自噬性細(xì)胞死亡與凋亡相互影響作用的研究進(jìn)展

王欣琦，賈顏鴻，周 童，栗 達(dá)，王 莉，張澤兵*

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 病理科，吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春130021；2.吉林市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

生物體都在不斷地更新，細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)的成分不斷地被重塑和循環(huán)利用，因此，都會(huì)發(fā)生低水平的基礎(chǔ)性自噬，以執(zhí)行細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能。例如細(xì)胞通過自噬分解異常蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器，獲得可供循環(huán)利用的核苷、氨基酸等大分子物質(zhì)及能量，從而維持細(xì)胞代謝平衡。然而自噬又是可以高度誘導(dǎo)的，尤其是在細(xì)胞內(nèi)和(或)細(xì)胞外應(yīng)激的情況下，例如營養(yǎng)匱乏、缺氧、氧化應(yīng)激、代謝失衡、致癌基因激活、病原菌感染時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)自噬作用，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用[1]。在大多數(shù)情況下，自噬是構(gòu)成促進(jìn)細(xì)胞存活的應(yīng)激適應(yīng)途徑。但一個(gè)明顯的矛盾是如果在發(fā)育過程中給予持續(xù)的應(yīng)激刺激導(dǎo)致過量的自噬就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，一種被稱為“Ⅱ型”或“自噬”細(xì)胞死亡的非凋亡性程序性細(xì)胞死亡。從凋亡機(jī)制中明確區(qū)分非凋亡細(xì)胞死亡機(jī)制對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是很困難的。有研究發(fā)現(xiàn)，某些自噬相關(guān)基因也調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，同時(shí)，在細(xì)胞凋亡機(jī)制中處于中心地位的Caspase半胱氨酸蛋白酶家族也參與調(diào)控自噬性細(xì)胞死亡過程[2]。找出與凋亡和自噬相關(guān)細(xì)胞死亡之間有關(guān)的“切換”或調(diào)節(jié)機(jī)制，有望成為癌癥治療學(xué)的新靶點(diǎn)。

1 自噬相關(guān)基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程

凋亡和自噬途徑之間存在串?dāng)_，自噬通過提供能量以允許需要能量的程序化細(xì)胞死亡過程完成，以及以自身的方式降解細(xì)胞材料，從而有助于促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

1.1 Bcl家族通過Beclin 1調(diào)控自噬從而影響細(xì)胞凋亡

Beclin 1/Atg 6/BECN 1是一種在自噬的起始過程中起著關(guān)鍵性作用的蛋白質(zhì)，用于激活Ⅲ類磷脂酰肌醇-3-激酶[3]，ATG 6/Beclin-1與Ⅲ類PI3-激酶信號(hào)復(fù)合物協(xié)同作用下積極控制自噬泡的形成[4]。雖然自噬具有抗凋亡作用，但在非凋亡的死亡細(xì)胞中自噬小體數(shù)量的增加與非凋亡細(xì)胞死亡的形式有關(guān)。由于自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的自降解過程，大規(guī)模的細(xì)胞破壞會(huì)導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞萎縮和細(xì)胞崩潰。由此可推斷凋亡和自噬可能有共同調(diào)控的方向，因?yàn)榭沟蛲鯞cl-2和Bcl-xl蛋白通過與Beclin 1(哺乳動(dòng)物Atg6)結(jié)合而負(fù)調(diào)控自噬?？沟蛲龅鞍譈cl-2與自噬蛋白Beclin 1的相互作用是凋亡機(jī)制和自噬機(jī)制潛在的重要匯合點(diǎn)[5]。

1.1.1Bcl-2被磷酸化后與Beclin 1的BH3結(jié)構(gòu)域發(fā)生解離，而引發(fā)自噬

Bcl-2蛋白家族，Bcl-2，Bcl-xl和Mcl-1是眾所周知的抗凋亡介質(zhì)，但其在抑制自噬中的作用正日益被人們所了解。Bcl-2蛋白的離子來源于其拮抗Bax和Bak的能力，從而阻止凋亡。Bcl-2和Bcl-xl在抑制凋亡和自噬相關(guān)細(xì)胞死亡中的雙重作用使這些蛋白成為理想的化療靶點(diǎn)。Beclin 1和Bcl-2的表達(dá)水平是決定細(xì)胞在腫瘤發(fā)生和化療過程中是否能抵抗凋亡或自噬的關(guān)鍵因素。人BECN1包含一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域[6]，Beclin 1已被證明通過其BH3結(jié)構(gòu)域與抗凋亡Bcl-2家族成員相互作用。當(dāng)Bcl-2被磷酸化后并與Beclin 1發(fā)生解離，就會(huì)引發(fā)自噬[7]。如果繼續(xù)激活JNK1通路并保持Bcl-2磷酸化，細(xì)胞還會(huì)發(fā)生凋亡[8]。

1.1.2不同營養(yǎng)狀態(tài)下調(diào)控Bcl-2與Beclin 1的結(jié)合而調(diào)控自噬

Bcl-2抑制Beclin 1依賴自噬的發(fā)現(xiàn)提出了生理自噬是如何在表達(dá)Bcl-2和Beclin 1的正常細(xì)胞中發(fā)生的問題。研究結(jié)果表明，內(nèi)源性Bcl-2與內(nèi)源性Beclin 1結(jié)合，這種相互作用受細(xì)胞營養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)節(jié)[5]。當(dāng)氨基酸饑餓引起最大自噬時(shí)，Bcl-2與Beclin 1的結(jié)合量很小。當(dāng)氨基酸過量抑制自噬時(shí)，Bcl-2與Beclin 1結(jié)合最大。因此，在饑餓和其他潛在的生理刺激的反應(yīng)下，Bcl-2與Beclin 1的解離可能是激活Bcl-2自噬的重要機(jī)制。相反，Bcl-2和Beclin 1在正常生長條件下的結(jié)合可能是防止不適當(dāng)?shù)淖允傻臋C(jī)制之一。此外，饑餓誘導(dǎo)的JNKI激活可引起B(yǎng)cl-2的BH4和BH3結(jié)構(gòu)域之間的多位點(diǎn)磷酸化，從而破壞Bcl-2和Beclin 1的相互作用[9]。

1.1.3Caspase通過切割Beclin 1而抑制自噬

同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)caspase可以在細(xì)胞凋亡中切割Beclin 1，從而破壞其自噬活性。例如，caspase-3，-7和-8介導(dǎo)的Beclin 1的切割產(chǎn)生N-端和C-端,促凋亡蛋白Bax誘導(dǎo)的凋亡通過增強(qiáng)caspase介導(dǎo)的Beclin 1在D149的斷裂而減少自噬[10]。斷裂后，N端和C端的Beclin 1片段都改變了其定位，這些片段與Vps 34不正常相互作用，而Vps 34又是自噬所必需的。Beclin 1的切割是caspase抑制自噬的關(guān)鍵事件，就像一個(gè)不能被切割的Beclin 1突變體在過度表達(dá)Bax的細(xì)胞中恢復(fù)自噬一樣[11]。由此可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡可以抑制自噬。

1.2 Atg 5和FADD在自噬細(xì)胞死亡中的重要作用

自噬相關(guān)基因Atg5是自噬小體形成所必需的蛋白質(zhì)，是干擾素g誘導(dǎo)的自噬細(xì)胞死亡所必需的。用短干擾RNA(SiRNA)沉默Atg5基因會(huì)導(dǎo)致部分耐藥。細(xì)胞凋亡與鈣蛋白酶介導(dǎo)的Atg 5切割有關(guān)，而Atg 5的斷裂與細(xì)胞類型和凋亡刺激無關(guān)，提示鈣蛋白酶激活和Atg 5斷裂是凋亡細(xì)胞的普遍現(xiàn)象。Atg 5由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，與抗凋亡分子Bcl-xl相關(guān)[12]，并觸發(fā)細(xì)胞色素c釋放和caspase活化。加在一起，鈣蛋白酶介導(dǎo)的Atg 5切割，截短的Atg 5可能通過阻斷Bcl-xl的功能而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致Bax的激活，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞死亡[13]， 因此，代表了自噬與凋亡之間的分子聯(lián)系，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床抗癌治療具有潛在的重要意義。

1.2.1IFN-γ或Atg5表達(dá)引起空泡積聚從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡

Atg5還可能在自噬和自噬細(xì)胞死亡中起雙重作用。在自噬過程中，Atg5是一種獨(dú)特的非泛素結(jié)合反應(yīng)的組分之一，它是液泡形成所必需的。IFN-γ或Atg5表達(dá)引起的空泡積聚的細(xì)胞死亡，液泡形成先于細(xì)胞死亡。Atg5(K130r)突變體可阻斷IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和空泡形成，Atg5在體外和體內(nèi)通過死亡域與FADD相互作用，其介導(dǎo)的細(xì)胞死亡而非空泡形成在FADD缺陷細(xì)胞中被阻斷。提示Atg5與FADD相互作用在IFN-γ誘導(dǎo)的自噬細(xì)胞死亡中起重要作用[14-16]。

1.2.2Atg5通過其Lys殘基與Atg12結(jié)合，并與FADD結(jié)合以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡

在細(xì)胞死亡壓力存在的情況下，自噬和自噬細(xì)胞死亡可能共用Atg5的機(jī)制。Atg5的中端和C端含有一個(gè)Lys殘基與Atg12結(jié)合，并與FADD結(jié)合以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。此外，Atg5(K130r)突變體與Atg12結(jié)合能力缺陷的觀察表明，Atg5與Atg12的結(jié)合也與液泡相關(guān)的細(xì)胞死亡類似。說明Atg5介導(dǎo)的細(xì)胞死亡可能需要Atg12的參與。

1.2.3FADD作為Atg5誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡的下游介質(zhì)調(diào)控其反應(yīng)過程

通過酵母雙雜交篩選，可以確定Atg5是一種與FADD死亡結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白。令人驚訝的是，隨后的研究分析顯示Atg5的促細(xì)胞死亡活動(dòng)需要FADD作為下游介質(zhì)。雖然FADD的過度表達(dá)可能激活含有caspase-8等死亡效應(yīng)區(qū)，但FADD的減少可使Atg5誘導(dǎo)的自噬細(xì)胞死亡。FADD是一種主要由受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的適配器分子。然而，許多證據(jù)表明，F(xiàn)ADD是一種多功能蛋白，在非受體介導(dǎo)的凋亡、壞死和細(xì)胞生長中表現(xiàn)出不同的活性。因此，F(xiàn)ADD可能是決定各種信令命運(yùn)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。闡明含有FADD的配合物(如FADD-Atg5和FADD-caspase)的信號(hào)依賴化學(xué)計(jì)量學(xué)將是非常重要的。目前，研究人員并不認(rèn)為與FADD相互作用的caspase-8對(duì)Atg5介導(dǎo)的細(xì)胞死亡有顯著的促進(jìn)作用。由FADD-DD和Atg5觸發(fā)的有效細(xì)胞死亡表明FADD-DD可能起到激活自噬細(xì)胞死亡的下游介質(zhì)的作用，而FADD-DED(死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域)通常是細(xì)胞死亡所必需的[14]。

1.3 Atg4D可能通過線粒體途徑增強(qiáng)凋亡反應(yīng)

1.3.1Atg4D作為caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中的一種底物

Atg4D是細(xì)胞自噬與凋亡調(diào)控界面的重要因子。Atg4D的擴(kuò)展N端包含一個(gè)典型的caspase切割序列(DEVD63K)。其延伸的N端構(gòu)成自抑制，caspase的裂解通過去除這個(gè)自抑制結(jié)構(gòu)域來刺激活性。通過比較高表達(dá)全長突變體和ΔN63-Atg4D(野生型和C144A活性位點(diǎn)突變體)的效果，發(fā)現(xiàn)Atg4D介導(dǎo)的細(xì)胞毒性并不是由自噬能力改變引起的。有研究發(fā)現(xiàn)Atg4D是caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中的一種底物，其切割產(chǎn)生截短的產(chǎn)物，增強(qiáng)了GABARAP-L1的體外啟動(dòng)活性，并在人細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

1.3.2線粒體通過BH3的C-末端靶向Atg4D產(chǎn)生細(xì)胞毒性并與Bcl-2家族相互作用而促進(jìn)凋亡

有數(shù)據(jù)還表明Atg4D是一個(gè)重要的細(xì)胞存活因子，因?yàn)槌聊珹tg4D的表達(dá)會(huì)使細(xì)胞對(duì)饑餓和葡萄球菌毒素引起的細(xì)胞死亡敏感。同時(shí),caspase裂解使Atg4D對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞也產(chǎn)生毒性。Atg4D介導(dǎo)的細(xì)胞毒性并不是由于自噬改變所致，而是由線粒體通過其BH3的C-末端靶向Atg4D所致，并與Atg4D與線粒體的短暫聯(lián)系有關(guān)。Atg4D的caspase切割可能也暴露了BH3結(jié)構(gòu)域[17]。BH3結(jié)構(gòu)域在插入多結(jié)構(gòu)域Bcl-2家族成員的疏水裂縫時(shí)起促進(jìn)凋亡的作用[18]。但Atg4D是否可以通過靶向Bax或Bak而導(dǎo)致凋亡前線粒體因子的釋放仍然是未知的。

2 凋亡相關(guān)蛋白參與調(diào)控自噬性細(xì)胞死亡

最近的證據(jù)表明，Atg蛋白本身可以作為半胱氨酸蛋白酶的靶點(diǎn)，提供潛在的自噬調(diào)節(jié)以及發(fā)現(xiàn)來自Atg蛋白片段的新功能。

2.1 caspase-8切割A(yù)tg3蛋白對(duì)受體激活細(xì)胞死亡過程中自噬的調(diào)節(jié)作用

Atg3是自噬相關(guān)泛素化類系統(tǒng)的一個(gè)組成部分，參與自噬體的形成[19]。研究人員在Atg3序列中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)caspase-8靶位點(diǎn)[20]，在Atg3中，caspase-3、-6或-8的裂解位點(diǎn)被預(yù)測落在其與Atg7、s6相互作用所需的區(qū)域，Atg7和Atg3是分別催化Atg8(LC3、GATE-16或GABARAP)脂質(zhì)化的E1和E2酶[21]。

TNF-a通過與其受體TNFR 1和TNFR 2結(jié)合而激活細(xì)胞死亡。相反，另一種死亡配體TRAIL通過其對(duì)不同類型死亡反應(yīng)的作用，導(dǎo)致caspase-8的激活。在caspase-8激活后，Atg3發(fā)生斷裂或降解。細(xì)胞死亡期間Atg3的切割可能是死亡受體刺激和caspase-8活化下游事件的結(jié)果。caspase-8的過表達(dá)導(dǎo)致Atg3的降解，這一過程依賴于caspase-8的酶活性。Atg3上caspase-8切割位點(diǎn)的突變在體外均能抑制caspase-8的切割[20]。Caspase-8介導(dǎo)的Atg3蛋白的切割阻斷了死亡受體在配體結(jié)合后觸發(fā)的信號(hào)的自噬臂。重新引入caspase-8抗性Atg3或通過caspase抑制阻斷Atg3切割，揭示死亡受體途徑的自噬相關(guān)信號(hào)。有研究顯示Atg5或Atg3的缺失抑制自噬體的形成，從而明顯抑制caspase-8的活化和凋亡[22]。

2.2 caspase-3切割Beclin 1可能導(dǎo)致自噬失活，從而導(dǎo)致凋亡增加

有研究發(fā)現(xiàn)Beclin 1中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)caspase-3切割位點(diǎn)，它們可能參與了自噬和凋亡的調(diào)控。Beclin 1是caspase-3的底物，分別在位置124和149處有兩個(gè)裂解位點(diǎn)，該裂解位點(diǎn)通過抑制自噬作用促進(jìn)凋亡活性細(xì)胞的凋亡。這可能是由于這些位點(diǎn)的突變導(dǎo)致這種蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變。Beclin 1在這兩個(gè)位點(diǎn)的斷裂也可能導(dǎo)致BH3結(jié)構(gòu)域的暴露，從而獲得促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。曾有研究人員發(fā)現(xiàn)單用Beclin 1(D 150-450)的N端裂解產(chǎn)物就足以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而不受任何凋亡刺激的影響。在caspase-3切割后，Beclin 1的BH3結(jié)構(gòu)域暴露可能通過直接結(jié)合Bcl-2家族中的其他抗凋亡成員來增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，并允許僅有促凋亡BH3的分子競爭Beclin 1與Bcl-2/Bcl-xl的結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。因此，研究Caspase-3對(duì)Beclin 1的裂解是否會(huì)影響B(tài)cl-2和Beclin 1之間的相互作用是很有意義的。

3 小結(jié)

自噬與細(xì)胞死亡的確切關(guān)系是近年來爭論的焦點(diǎn)。在許多系統(tǒng)中，自噬和凋亡同時(shí)被激活。自噬和凋亡都是高度調(diào)控的生物學(xué)過程，在組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)、發(fā)育和疾病中發(fā)揮重要作用。盡管自噬和凋亡在一些分解代謝過程之間有明顯的差異，但他們卻是緊密相連的。在大多數(shù)情況下，自噬為保護(hù)性自噬，與凋亡之間多為抑制作用。Caspases在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，在引導(dǎo)自噬-凋亡串?dāng)_中起關(guān)鍵作用。在某些特殊情況下，自噬前蛋白甚至可以被轉(zhuǎn)化成促凋亡蛋白，從而在被半胱氨酸蛋白酶切割后介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一方面，自噬可以通過調(diào)節(jié)caspase的數(shù)量和活性來影響凋亡級(jí)聯(lián)。因此，有必要進(jìn)一步研究半胱氨酸蛋白酶和Atg蛋白之間的相互作用在動(dòng)物模型和人類臨床模型中自噬-凋亡串?dāng)_中的作用。由于自噬細(xì)胞死亡既有caspase依賴性的，也有與caspase無關(guān)的。盡管進(jìn)行了大量的研究，但自噬性細(xì)胞死亡主要是根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和形態(tài)學(xué)特征來評(píng)估的，而自噬與細(xì)胞死亡聯(lián)系的確切機(jī)制仍有待于充分了解。