五味子甲素研究進展*

李 靜，張 培，李文堯，宋 毅

（四川大學華西醫(yī)院藥劑科，四川 成都 610041）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinenzis-Turcz.Baill或華中五味子Schisandra sphenanthear Rend.etWils.的干燥成熟果實，前者稱為“北五味子”，后者稱為“南五味子”[1]，《神農(nóng)本草經(jīng)》載其有益氣滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神等功效[2]。五味子的主要化學成分為木脂素類，其中五味子甲素為主要活性成分，五味子甲素也稱去氧五味子素、五味子素A，臨床對其藥理作用的研究相對較多，其涉及生殖系統(tǒng)[3]、心血管系統(tǒng)[4]、呼吸系統(tǒng)[5]、消化系統(tǒng)[6-7]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8]等，不僅具有保肝、抗病毒、抗炎、舒張血管、抗癌等作用，在精神病的治療中也具有重要意義。在此，對五味子甲素的藥理作用、提取工藝、測定方法等進行綜述，旨在后續(xù)研究提供參考。

1 藥理作用

1.1 保肝作用

肝病包括外源性和內(nèi)源性的肝損傷，五味子甲素具有誘導肝微粒體細胞色素P450 酶活性，從而可增強肝臟的解毒功能、降低血清轉(zhuǎn)氨酶、阻斷多種毒性物質(zhì)對肝細胞膜的損傷作用[9]。王菊平等[10]的研究顯示，五味子甲素對急性膽汁淤積造成的肝損傷具有很好的改善作用，主要通過降低血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的活性和血清總膽紅素（TBil）的含量，增加Na+，K+-ATP 酶活性以改善肝功能。王陳萍等[11]將五味子類木脂素成分對肝損傷細胞的保護作用進行了比較，結果顯示，五味子甲素對體外損傷肝細胞無保護作用。而LU 等[12]的研究證實，五味子甲素體內(nèi)對損傷肝細胞具有很好的藥理活性。曹媛等[5]采用不同濃度的五味子甲素在不同孵育時間時刺激肝星狀細胞LX-2，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色（MTT）法檢測五味子甲素對細胞的抑制作用，RT-PCR 法和Western blot 法測定纖維化指標CollagenⅠ和α-SMA 的表達量，并檢測五味子甲素對凋亡相關蛋白Bcl-2 和Bax 表達量的影響，結果顯示，五味子甲素在不同濃度及孵育時間時可抑制人肝星狀細胞系LX-2 細胞的增殖，可顯著降低CollagenⅠ和α-SMA 的m RNA 水平和蛋白表達量，并能顯著降低Bcl-2 的m RNA 水平和蛋白表達量，以及Bcl-2/Bax，因此五味子甲素可通過抑制細胞增殖、降低纖維化指標的表達，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。沈芳儀等[13]研究表明，五味子甲素有降低肝炎的ALT 的作用，且臨床應用廣泛。

1.2 抗炎作用

白細胞介素1β（IL-1β）為單核細胞因子，具有很高的活性，從細胞中釋放出來后表現(xiàn)為全身性激素樣作用，在1 ng/L 質(zhì)量濃度時即可表現(xiàn)出非常強的生物學活性。IL-1β 不僅能促進白細胞聚集，還能直接誘發(fā)其他促炎因子生成，并激活中性粒細胞參與炎性反應。楊德峰等[14]通過實驗證實，五味子甲素能有效抑制單核巨噬細胞中IL-1β mRNA 的表達。同時，邱宏濤等[15]通過網(wǎng)絡藥理學方法分析得出，五味子甲素對4 個炎性因子[腫瘤壞死因子-α（TNF-α），IL-1β，白細胞介素6（IL-6），前列腺素E2（PGE2）]的分泌均有抑制作用，并能同時減少誘導型一氧化氮合酶（iNOS）及COX-2 蛋白的表達，并證實了五味子甲素的抗炎作用最強。崔鶴蓉等[16]通過免疫熒光和Western blot 試驗證實，五味子甲素在濃度范圍內(nèi)（25 ～200 μmol/L）對NLRP3 炎性小體活性的抑制作用不依賴于核因子κB（NF-κB） 通路活性及其誘導的NLRP3，ASC，pro-IL-1β 等炎性小體蛋白的表達，而是通過阻斷caspase-1 活化，抑制caspase -1 對pro -IL -1β 的剪切活化，進而抑制NLRP3 炎性小體的活性，減輕免疫炎性反應。在抗炎作用上，有文獻表明，五味子甲素在體外能有效抑制脂多糖誘導的炎性反應[17]。

1.3 抗凝血作用

羅旭靈[4]采用生物學分析發(fā)現(xiàn)，五味子甲素與APJ受體的3 個氨基形成4 個位點，通過比濁法、體外血栓檢測儀分析、線粒體熒光針標記法及透射電鏡分析等方法表明，五味子甲素可通過抑制線粒體自噬從而抑制elabela32，apelin12、17、36 誘導的兔血小板聚集及體外血栓形成。徐志立等[7]考察了五味子甲素對潰瘍性結腸炎（UC）小鼠血液流變性及凝血功能的影響，結果顯示，五味子甲素可改善UC 小鼠血液流變性及凝血功能，此作用有利于UC 潰瘍黏膜的修復與疾病的治療。同時，五味子甲素對UC 小鼠血液流變性及凝血功能的改善作用有利于預防UC 并發(fā)的血栓形成，以及進而導致的腸黏膜血灌注降低，細胞缺血、缺氧，從而減輕腸黏膜組織損傷，抑制潰瘍的形成與發(fā)展?？梢?，五味子甲素可明顯降低UC 小鼠全血黏度，改善UC 小鼠血液流變性，顯著延長 出血時間（BT），凝血時間（CT），降低UC 小鼠血液高凝狀態(tài)，此作用有利于防止UC 小鼠血栓形成，促進結腸黏膜的修復，緩解UC 臨床癥狀，提高臨床療效。

1.4 抗癌作用

曾智銳等[18]分析了五味子甲素對人胰腺癌細胞株AsPc-1 增殖、凋亡的影響，結果顯示，隨著五味子甲素濃度的增加，AsPc-1 細胞Bcl-2 蛋白的相對表達量、全長度β-catenin 蛋白及78kD 的β-catenin 蛋白的相對表達量均逐漸下調(diào)，而Bax 蛋白的相對表達量逐漸增加；五味子甲素組β-catenin 蛋白在細胞核的聚集明顯減少。提示五味子甲素可抑制人胰腺癌細胞AsPc-1細胞的增殖、克隆形成能力，從而達到促進細胞凋亡的效果；而其作用機制則可能是五味子甲素能在一定程度上降低β -catenin 蛋白的表達及水解，從而減少β-catenin 蛋白在細胞核內(nèi)的定位，進而發(fā)揮調(diào)控功效，表明五味子甲素具有抑制胰腺癌細胞生長和促進其凋亡的潛在藥用價值。LEE 等[19]發(fā)現(xiàn)，五味子甲素可引起卵巢癌細胞周期阻滯從而抑制卵巢癌細胞的增殖，還可通過抑制腫瘤相關巨噬細胞的活性，減少微環(huán)境中的炎性因子。陳雪等[20]的研究表明，五味子甲素通過下調(diào)CyclinD1 蛋白表達水平、上調(diào)促凋亡因子Bax 和Bcl-2表達水平抑制膠質(zhì)瘤C6 細胞的生長。魏子龍等[21]證實，五味子甲素通過抑制膠質(zhì)瘤干/祖細胞表面已存在的ABCBI 基因編碼的P-糖蛋白泵出藥物能力并降低ABCBI 基因轉(zhuǎn)錄和翻譯能力，逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤干/祖細胞耐藥性。

1.5 防護腎損傷

甘永雄等[22]通過大鼠實驗分析了五味子甲素對失血性休克大鼠腎臟損傷的作用，通過復制失血性休克大鼠模型并采用不同質(zhì)量濃度的五味子甲素進行處理，同時比較相應炎性因子的表達情況。結果顯示，40 mg/kg和80 mg/kg 的五味子甲素可促使大鼠血清血尿素氮（BUN）及血清肌酐（SCr）含量明顯下降；80 mg/kg 的五味子甲素能促使線粒體中琥珀酸脫氫酶（SDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）逐漸升高，同時降低IL-1β 及TNF-α 的mRNA 及蛋白表達水平。提示五味子甲素能對NLRP3 炎性小體活化情況進行抑制，從而可達到減輕失血性休克大鼠腎損傷的效果。

1.6 抗抑郁

1.7 抑制胃腸平滑肌收縮

五味子甲素對腸平滑肌收縮功能的調(diào)節(jié)作用機制為Ca2+參與可引起平滑肌收縮，在肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）能催化20 kD 的肌球蛋白輕鏈（MLC20）的磷酸化，磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATPase 活性增強，能有效分解三磷酸腺苷（ATP），將化學能力轉(zhuǎn)化為機械能，在肌動蛋白與肌球蛋白相互作用下產(chǎn)生收縮。MLCK 屬于平滑肌細胞收縮的重要調(diào)節(jié)蛋白，五味子甲素可有效抑制MLCK 的過度表達，從而對腸平滑肌收縮有積極作用[6]。

1.8 抗帕金森病

五味子甲素可通過有效抑制PD 細胞模型的凋亡作用而發(fā)揮對多巴胺神經(jīng)細胞的保護作用[23-24]。

2 提取研究

木脂素、多糖、揮發(fā)油等均為五味子的主要有效成分，目前，臨床對木脂素的研究相對較多，五味子甲素為木脂素的有效成分之一。提取五味子甲素的方法較多，常用方法包括超聲酶解法[25]、高壓脈沖電場法[26]、超聲波-微波協(xié)同萃取[27]、乳化劑萃取[28]、超臨界CO2萃取[29]。

采用超聲酶解法[25]提取五味子甲素，以五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3 種有效成分的提取量作為考察指標，采用單因素試驗確定其最佳提取工藝。研究結果顯示，工藝條件為果膠酶、濃度為1.0%、酸水液p H 為4.0、酸水液體積為25 mL、水解溫度為50 ℃、酶解時間為5 h，五味子甲素的提取量為1.268 mg/g。

采用高壓脈沖電場對五味子木脂素的提取進行研究，以料液比、電場強度及脈沖數(shù)為自變量，在單因素試驗結果的基礎上，通過響應曲面法進行優(yōu)化研究，結果顯示，以80%乙醇為提取溶劑，電場強度為25KV/cm，脈沖數(shù)為8，料液比為1 ∶30（g/mL）為最佳提取工藝條件。

在五味子甲素的提取研究中，各種傳統(tǒng)技術、現(xiàn)代提取技術及新型輔助提取技術報道較多[30]，不同提取方法均有自身的特點與不足。與傳統(tǒng)技術乙醇回流相比，超臨界流體萃取法的操作方法更簡單，且無有機溶劑殘留，故可避免長時間加熱導致的損失，同時還具有操作簡單、設備簡單、雜質(zhì)少、有效成分提取率高等多種優(yōu)點，故應用廣泛。與傳統(tǒng)技術比較，現(xiàn)代新型技術更適應社會發(fā)展，適用范圍廣、適應性好、回收率高、分離量大、分離率高等特點，值得在現(xiàn)代研究中推廣。

3 測定方法

3.1 高效液相色譜(HPLC)法

五味子甲素的含量測定多采用HPLC 法、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）、超高效液相色譜法（UPLC），主要是通過對樣品進行提純、定容等處理，然后以HPLC 法對流動相甲醇-水（77 ∶23）測定[31]，以明確五味子甲素含量。姜鑫等[32]用HPLC 法測定五味子甲素的線性范圍為0 ～295 μg/mL，RSD≤3.9%（n=6）。孫琳等[33]采用UPLC 測定五味子甲素，進樣量線性范圍是0.001 3 ～0.05 μg（r=0.999 9），平均回收率為101.73%，RSD為2.29%。劉宏勝等[34]采用RP-HPLC 法測定五味子甲素。以上研究結論均提示，HPLC 法簡單，線性范圍佳，準確度和穩(wěn)定性好，是現(xiàn)代常用五味子甲素的測定方法。

3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法

HPLC-MS 以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到的質(zhì)譜圖具有高選擇性和高靈敏度，常用于成分復雜、不穩(wěn)定成分的分析。關皎等[35]采用超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UFLC-MS/MS）測定五味子甲素，質(zhì)譜采用3200 QTRAP 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，離子源為電噴霧電離源（ESI 源），檢測方式為正離子檢測，掃描模式為多重反應檢測（MRM），結果五味子甲素質(zhì)量濃度在0.1 ～5 μg/mL（r=0.999 2）范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，平均回收率為96.9%（n=9）。此方法適用性，重復性、準確度均較高[36-37]。

3.3 薄層掃描(TLCS)法

TLCS 是指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜（TLC）中有紫外或可見吸收的斑點或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢查的方法。但隨著現(xiàn)代科技越來越發(fā)達，新型技術的運用，該法更多用于定性分析，少用于定量。陳素英[38]采用TLC 法對五味子甲素進行定性和定量分析，結果表明，五味子甲素最佳測量條件為熒光掃描模式，分離條件為甲苯-乙酸乙酯（8 ∶1）單次展開；通過考察樣品貯備液的穩(wěn)定性，證明五味子甲素在薄層板上展開后具有較好的穩(wěn)定性和較高的精密度。TLC 法操作簡便易行，準確靈敏，且重現(xiàn)性與專屬性好，較符合定量分析的要求，可為藥物的質(zhì)量控制提供客觀的定量評價。

3.4 毛細管電泳法

毛血管電泳法屬于微分離分析技術，高效毛細管電泳主要是以高壓電廠作為驅(qū)動力，將毛細管作為分離通道，以樣品中各組分間分配行為、淌度等的差異情況為依據(jù)達到分離效果。但國內(nèi)相關研究報道較少，僅有文獻[39-40]分別采用膠束電泳和毛細管電泳法測定五味子甲素的含量。與HPLC 法及TLC 法比較，高效毛細管電泳的起步較晚，但該測定方式因具有回收率高、分析速度快、費用低、進樣體積小、儀器維護方便、水溶液消耗量少等優(yōu)點，臨床應用廣泛。