赤眼蜂分子鑒定研究進展

嚴智超，華海清，李元喜

(南京農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系，南京 210095)

赤眼蜂Trichogrammaspp.隸屬膜翅目Hymenoptera小蜂總科Chalcidoidea，赤眼蜂科Trichogrammatidae，是世界范圍內(nèi)應用最廣泛、最成功的一類卵寄生蜂，已被廣泛應用于水稻、玉米、棉花、果蔬、林木等多種農(nóng)林害蟲的防控，取得了顯著的經(jīng)濟和生態(tài)效益(Smith, 1996; 何曉芳等, 2005; 張俊杰等, 2015)。赤眼蜂屬種類繁多，已報道有200余種，其寄主范圍廣泛，可寄生鱗翅目、半翅目等7個目500多種昆蟲的卵，其中特別對鱗翅目農(nóng)林害蟲的防控作用尤為顯著(Pinto, 1999; 胡紅英, 2003)。不同赤眼蜂對不同寄主和生境具有偏好性，其種類和品系的選擇是影響其田間防效的重要因素。此外，對于監(jiān)測、避免赤眼蜂人工繁育中的蜂種混雜以及追蹤、評估其田間釋放后的防控效果，赤眼蜂的鑒定無疑都是至關重要的(胡紅英, 2003; Stouthamer, 2006)。

然而，由于赤眼蜂體型微小(僅0.5 mm左右)，又缺乏明顯的種間形態(tài)差異，其分類鑒定一直是研究的難題(Nagarkatti & Nagaraja, 1977; 胡紅英, 2003; 何曉芳等, 2005)。早期研究曾以赤眼蜂體色、觸角、翅毛等特征進行分類鑒定，造成了許多混亂。其中一個原因是，赤眼蜂的這些性狀具有發(fā)育可塑性(Pintoetal., 1989)。如，松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi在25℃以上培養(yǎng)出來的雌蜂呈通體黃色，而在接近發(fā)育起點溫度培養(yǎng)的則呈通體黑褐色。Flanders和Quednau(1960)提出了應在相同溫度、濕度和寄主條件下進行赤眼蜂培養(yǎng)用以準確鑒定，但由于操作繁瑣未能推廣開來。一些學者先后逐漸認識到赤眼蜂雄外生殖器在其分類鑒定中的重要性。Nagarkatti和Nagaraja(1968，1971)率先系統(tǒng)性地對雄外生殖器特征進行了描述，并以此為主要分類鑒定依據(jù)，開啟了赤眼蜂的現(xiàn)代分類學研究。此后，雄外生殖器快速成為本屬分類鑒定所用的普遍特征，赤眼蜂屬的分類研究也從1971年僅知的十余種(Nagarkatti & Nagaraja, 1971; 何曉芳等, 2005)發(fā)展至今報道有200余種(Pinto, 1999; Stouthamer, 2006)。

但基于赤眼蜂形態(tài)的傳統(tǒng)分類鑒定仍存在以下明顯缺陷：(1)對專業(yè)技術要求高，且耗時費力；(2)難以區(qū)分一些近緣種，也無法鑒定隱存分類單元；(3)無法鑒定殘缺標本，及雄蜂之外的其他發(fā)育階段；(4)難以鑒定孤雌產(chǎn)雌的赤眼蜂品系(Stouthameretal., 1999; Stouthamer, 2006)。因而，赤眼蜂的分類研究亟需更準確、便捷、高效的鑒定方法。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，越來越多的分子鑒定技術被應用于赤眼蜂的分類鑒定，對基于形態(tài)特征的傳統(tǒng)分類鑒定予以了豐富與補充。本文就赤眼蜂屬分子鑒定中常用的方法進行簡短的綜述。

1 分子標記的選擇

大量的研究表明，選擇合適的分子標記是成功分子鑒定的關鍵(Behura, 2006; Stouthamer, 2006; 黃帥和胡紅英, 2006; Gariepyetal., 2007)。在赤眼蜂分子鑒定的研究中，常用的分子標記有同工酶，如酯酶等，以及DNA片段，如微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)、核糖體DNA、線粒體DNA等。

同工酶具有多態(tài)性，可用于赤眼蜂種間的區(qū)分鑒定。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法對蛋白質(zhì)進行分離，然后對同工酶的酶譜進行分析，根據(jù)同工酶譜帶的不同，對物種、群體進行鑒定，即同工酶電泳法(Isoenzyme Electrophoresis)(Murthyetal., 2013)。Voegele和Berge(1976)首次將該方法引入赤眼蜂分子鑒定的研究。之后，同工酶電泳法在赤眼蜂分子鑒定研究中主要流行于20世紀80至90年代(何曉芳等, 2005)，主要采用的同工酶標記有酯酶、蘋果酸脫氫酶、過氧化物歧化酶等，其中最常用的標記為酯酶(Kazmer, 1991; 黃壽山等, 1991; Pintureau, 1993; 霍紹棠等, 1994)。然而，同工酶等蛋白質(zhì)與DNA分子標記不同，容易降解、失活，需要大量的新鮮或凍存的樣品，且同工酶的豐度、活性也可能受到發(fā)育階段、性別、環(huán)境等影響(何曉芳等, 2005; Murthyetal., 2013; Yazlovetskyetal., 2015)。因此，同工酶電泳法也逐漸在赤眼蜂分類鑒定研究中被舍棄。

隨著PCR(Polymerase Chain Reaction)技術的發(fā)明與普及，DNA分子標記越來越多地應用于赤眼蜂分子鑒定的研究(Stouthamer, 2006; 黃帥和胡紅英, 2006)。相較于蛋白質(zhì)，DNA分子可通過PCR進行特異性擴增，從而大大減少對初始樣本量的需求，十分適合赤眼蜂等微小昆蟲的分子鑒定。另，DNA不具有發(fā)育可塑性，對不同的發(fā)育階段均可以鑒定。其中，在赤眼蜂分子鑒定中，采用的DNA分子標記有微衛(wèi)星DNA、核糖體DNA和線粒體DNA。

微衛(wèi)星DNA也被稱作簡單重復序列(Simple Sequence Repeats，SSR)或短串聯(lián)重復序列(Short Tandem Repeats，STR)，由1～6個堿基的重復單元組成(Richardetal., 2008; Gulcher, 2012)。SSR廣泛分布于真核生物的整個基因組，較基因組其他區(qū)域具有更高的突變速率，也更為豐富的多態(tài)性，因而常被用于群體結構分析、遺傳圖譜繪制、個體雜合度檢測等多個領域(Gulcher, 2012)。然而，SSR分析的方法開發(fā)常需要文庫構建和篩選，以獲得微衛(wèi)星兩側的序列用于引物設計，成本較高且耗時費力，一定程度上限制了其廣泛應用(Zaneetal., 2002)?；赟SR分析的基礎，Zietkiewicz等(1994)進一步提出簡單重復序列間區(qū)(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)分子標記技術。ISSR分析的引物即為在SSR序列的3′端或5′端加上2～4個隨機堿基，用于擴增引物錨定的重復序列間的間隔DNA片段。ISSR分析無需靶序列的背景信息，較SSR更便捷高效，但由于是隨機引物錨定，其重復性不及SSR(Zietkiewiczetal., 1994)。在赤眼蜂分子鑒定研究中，SSR和ISSR分析的應用都較少，主要應用于赤眼蜂雜合度的檢測和種內(nèi)不同種群間的區(qū)分(Landaisetal., 2000; Vavreetal., 2004; Borbaetal., 2005; Pizzoletal., 2005; 付海濱, 2006; 付海濱等, 2006; 裴毅夫等, 2009; Lu & Han, 2016)。

核糖體DNA是分子鑒定中常用的分子標記。核糖體DNA在基因組中具有大量的拷貝數(shù)，即使DNA部分降解，也可以成功擴增。一個核糖體DNA轉(zhuǎn)錄單位由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)兩個部分組成，包括3個基因18S、5.8S、28S及兩個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)，即ITS1和ITS2(Wellauer & Dawid, 1977; Srivastava & Schlessinger, 1991)。其中，ITS不直接編碼核糖體RNA，其進化速率相對較快，即使在近緣物種中也會出現(xiàn)長度及序列的差異，因此可以用于物種的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關系的解析。其中，ITS2被廣泛用于赤眼蜂的分子鑒定中，對美國、葡萄牙、澳大利亞、中國、南非、印度等多個國家地區(qū)的赤眼蜂展開了分子鑒定的研究(Silvaetal., 1999; Stouthameretal., 1999; Querinoetal., 2001; Pintoetal., 2002; Li, 2007; Kumaretal., 2009; Sumeretal., 2009; Karimietal., 2012; Poorjavadetal., 2012; Nasiretal., 2013; Zoubaetal., 2013; Almeida & Stouthamer, 2015)。然而，核糖體DNA無法區(qū)別一些近緣的赤眼蜂種。如，ITS2無法區(qū)分微小赤眼蜂T.minutum及其近緣種T.platneri(Stouthameretal., 2000)，而線粒體分子標記COII則可將其區(qū)分(Borghuisetal., 2004)。此外，核糖體DNA在同一個體的多個拷貝間存在序列多態(tài)性，如ITS2的不同拷貝在同一個個體中可達到4%的序列差異(Richetal., 1997)，這給后續(xù)的限制性內(nèi)切酶鑒定、測序分析等帶來了一定的不便和不確定性。

另一類常用的分子標記是線粒體DNA。與核糖體DNA不同，線粒體DNA經(jīng)母系遺傳，同一個體內(nèi)不具有異質(zhì)性(Cameron, 2014; Hill, 2015)。另，昆蟲線粒體基因的進化速率遠高于核基因，這種現(xiàn)象在赤眼蜂等膜翅目昆蟲中尤為明顯(Yanetal., 2019)。同樣的，線粒體基因也存在大量的拷貝數(shù)，容易擴增(Cameron, 2014)。由于種種優(yōu)點，線粒體DNA被廣泛應用于物種的分子鑒定，線粒體基因COI更是被選為通用的物種條形碼(Cameron, 2014)。在赤眼蜂分子鑒定研究中，曾采用的線粒體分子標記有COI、COII、Cytb等，其中COI應用最為廣泛(Borghuisetal., 2004; 付海濱, 2006; Huaetal., 2018)。但相較于ITS2，COI在赤眼蜂分子鑒定研究中起步較晚，研究也相對更少。然而，通過對19種赤眼蜂ITS2和COI兩個基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，Thiruvengadam等(2016)(Venkatesanetal., 2016)發(fā)現(xiàn)COI比ITS2具有更高的變異率，也更適合赤眼蜂屬不同種的區(qū)分與鑒定。

2 常用分子鑒定方法

1985年，Kary Mullis發(fā)明了PCR技術(Saikietal., 1985; Mullis, 1990)。目前常用的赤眼蜂分子鑒定技術大多都是基于PCR技術發(fā)展而來，如對全基因組進行PCR擴增的隨機擴增多態(tài)性DNA分析(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、針對特定DNA片段的物種特異性PCR(Species-specific PCR，SS-PCR)，以及對DNA片段進行PCR擴增后的鑒定，如限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、高分辨率熔解曲線分析(High Resolution Melting Analysis, HRM)、測序比對等。

2.1 RAPD

隨機擴增多態(tài)性DNA分析(以下簡稱RAPD)是由John Williams和John Welsh分別領導的兩個小組幾乎同時發(fā)明于1990年，是一種建立在PCR基礎上進行DNA多態(tài)性分析的分子技術(Jainetal., 2010)。其原理是設計一系列隨機引物，對研究對象的基因組DNA進行PCR擴增，并將所得PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，通過擴增產(chǎn)物的多態(tài)性反映基因組DNA的多態(tài)性，從而用于物種鑒定、系譜分析等(Jainetal., 2010)。RAPD不需要基因組的前期信息，操作也相對簡單。Landry等(1993)用隨機引物對短管赤眼蜂T.pretiosum等3種赤眼蜂進行了總基因組的RAPD分析。Vanlerberghe-Masutti(1994)對廣赤眼蜂T.evanescens等7種赤眼蜂所提取的線粒體DNA進行了RAPD分析。此后，Chang等(2001)、Li(2007)、Singh等(2008)、Ercan等(2012)等研究者也嘗試利用RADP用于赤眼蜂的分子鑒定。但是，RAPD對模板要求高，重復性差，且易受外來污染DNA(如寄主、共生菌等)的影響(Stouthamer, 2006; Li, 2007)。因此，RADP在赤眼蜂分子鑒定中也未能推廣開來。

2.2 PCR-RFLP

限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析(以下簡稱RFLP)是根據(jù)不同生物體內(nèi)某一區(qū)段的DNA序列存在多態(tài)性及限制性內(nèi)切酶識別具有專一性的特征，用一種或多種限制性內(nèi)切酶將不同生物體的同一基因片段分割成大小不同的片段，根據(jù)酶切后片段大小達到區(qū)分物種的目的(何曉芳等, 2005; Stouthamer, 2006)。早期，研究者曾直接對提取的赤眼蜂線粒體DNA進行RFLP分析。Vanlerberghe-Masutti(1994)選用了11種限制性內(nèi)切酶對7種赤眼蜂的線粒體DNA進行RFLP分析，并基于酶切片段長度的多態(tài)性嘗試對7種赤眼蜂的進化關系進行解析。然而，直接提取線粒體DNA對樣本量的需求較大。后來，人們主要采用先PCR對特定DNA片段進行擴增，再進行RFLP分析，并逐漸成為了赤眼蜂分子鑒定的重要方法(Stouthamer, 2006)。

其中，基于ITS2分子標記的PCR-RFLP研究最多，迄今已對來自美國、葡萄牙、中國、澳大利亞、印度、南非等多個國家地區(qū)的至少40余種赤眼蜂建立了基于ITS2的PCR-RFLP圖譜(Silvaetal., 1999; Stouthameretal., 1999; Querinoetal., 2001; Pintoetal., 2002; Li, 2007; Kumaretal., 2009; Sumeretal., 2009; Karimietal., 2012; Poorjavadetal., 2012; Nasiretal., 2013; Zoubaetal., 2013; Almeida & Stouthamer, 2015)。如，Stouthamer等(1999)采用MseI、EcoRI和MaeII三種限制性內(nèi)切酶，對北美地區(qū)的短管赤眼蜂T.pretiosum等7種赤眼蜂建立了基于ITS2序列的PCR-RFLP分子檢索表。Silva等(1999)選用ITS2為標記基因，采用限制性內(nèi)切酶MnlI區(qū)分了葡萄牙常見的6種赤眼蜂。類似地，Li等(2007)采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對ITS2序列進行PCR-RFLP分析，進而區(qū)分鑒定中國4種常見的赤眼蜂，即松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi、玉米螟赤眼蜂T.ostriniae、擬澳洲赤眼蜂T.confusum和廣赤眼蜂T.evanescens。另，COI、COII、Cytb和ITS1等多種分子標記也曾被用于赤眼蜂的PCR-RFLP分析(Sappaletal., 1995; Borghuisetal., 2004; 付海濱, 2006; Huaetal., 2018)。如，Hua等(2018)基于COI序列，采用了EcoNI、SspI和VspI三種限制性內(nèi)切酶，建立了稻螟赤眼蜂T.japonicum等8種赤眼蜂的PCR-RFLP分子檢索表。

PCR-RFLP不受赤眼蜂的發(fā)育階段、性別等限制，結果準確穩(wěn)定、操作也相對簡單，為傳統(tǒng)形態(tài)鑒定提供了有效的補充，已被廣泛地應用于赤眼蜂的鑒定(Stouthamer, 2006; Gariepyetal., 2007)。但其缺點是只能鑒定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的變異，并且這些酶切位點在種內(nèi)也可能因突變存在異質(zhì)性，從而對鑒定結果造成一定影響。

2.3 物種特異性PCR

物種特異性PCR就是基于物種的DNA保守序列，設計物種特異性引物，再通過PCR擴增和凝膠電泳技術，直接通過目標片段的有無或長短來進行鑒定(Gariepyetal., 2007)。相對于PCR-RFLP，該方法省去了限制性內(nèi)切酶酶切的步驟，是赤眼蜂分子鑒定中一種較為快捷、高效的方法。而其最重要和最困難的部分是物種特異性引物的設計(黨向利，2003)。理論上，設計物種特異性引物需要測定該赤眼蜂種間與種內(nèi)的變異，進而確定種間特異、種內(nèi)保守區(qū)域的序列。因此，研究者往往采用盡可能多的樣本來進行分析檢測，并已建立了多種赤眼蜂的物種特異性PCR鑒定方法。

如，李正西和沈佐銳(2001)通過對多種赤眼蜂ITS2序列的比對，設計了松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi、玉米螟赤眼蜂T.ostriniae兩種赤眼蜂的物種特異性引物。黨向利(2003)進一步通過ITS2序列的分析比較，設計了松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi等4種赤眼蜂的物種特異性引物。耿金虎等(2004)也基于螟黃赤眼蜂T.chilonis的ITS2序列設計了該赤眼蜂的物種特異性引物。類似地，付海濱(2006)基于線粒體Cytb基因設計了甘藍夜蛾赤眼蜂T.brassicae等4種赤眼蜂的物種特異性引物，實現(xiàn)了基于Cytb對4赤眼蜂的物種特異性PCR分子鑒定。

此外，還可以將多個分子標記的擴增引物混合在同一PCR反應體系內(nèi)，即多重PCR(Multiplex-PCR)(Gariepyetal., 2007)。多重PCR可高效地同時進行多個分子標記的擴增，節(jié)省成本，經(jīng)濟便捷。多重PCR還可以確保至少一條條帶的成功擴增，從而避免在常規(guī)PCR中常見的假陰性對結果判斷的干擾(Dangetal., 2005)。然而，多重PCR無疑對引物設計、PCR條件優(yōu)化等要求更高，如需要考慮到多對引物的退火溫度、不同引物間的競爭性結合等。Dang等(2005)根據(jù)37種赤眼蜂的序列比對，設計了擬澳洲赤眼蜂T.confusum和松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi的ITS2物種特異性引物，并加入ITS1的通用引物作為PCR成功與否的指標，從而避免假陰性對結果判斷的干擾。Davies等(2006)也設計了多對澳洲赤眼蜂T.australicum和短管赤眼蜂T.pretiosum的物種特異性引物，并采用多重PCR方法加以鑒定區(qū)分。

2.4 HRM

高分辨率熔解曲線分析(以下簡稱HRM)是基于實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，以下簡稱qPCR)技術發(fā)展的一項低成本、高通量、高靈敏度、操作簡單的分子檢測技術，已被成功應用于物種鑒定、基因分型和甲基化分析等諸多領域(Guttmannetal., 1977; Vossenetal., 2009)。該方法將熒光染料結合到雙鏈PCR擴增產(chǎn)物中，染料只有在與PCR產(chǎn)物結合時才會發(fā)出明亮的熒光。因此，在PCR之后，測量反應熒光的同時升高擴增子的溫度導致產(chǎn)生序列特異性熔解曲線，通過熔解曲線形狀的差異來區(qū)分擴增片段間微小的序列差異(Vossenetal., 2009)。利用HMR對赤眼蜂的分子鑒定尚處于起步階段，相關報道較少。于超(2017)采用HRM分析技術獲得3種赤眼蜂COI基因的標準化熔解曲線，成功將松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi等3種赤眼蜂鑒定區(qū)分開來。進一步，Rugman-Jones等(2017)采用羅氏的Rotor-Gene RG-3000 qPCR儀器，建立了無需DNA提取的HRM鑒定方法，并成功將T.platneri與田間存有的其他4種赤眼蜂區(qū)分開來。

相較RAPD、PCR-RFLP、物種特異性PCR等方法，HRM無需PCR后的凝膠電泳，更加快捷(Vossenetal., 2009; 李瀟和盧瑤, 2010)。且一次性可同時完成96或384個樣本的檢測分析，具有較高通量。成本上，HRM只需在常規(guī)PCR基礎上增加飽和熒光染料，不需要設計特異性探針，成本也相對低廉。另，檢測完的樣品還可以用于其他的檢測，如后續(xù)的電泳、測序等一系列操作。然而，HRM對溫控的一致性有非常高的要求，需要特殊的儀器支持，而常規(guī)qPCR儀往往難以勝任(李瀟和盧瑤, 2010)。

2.5 測序比對

雖然，上述的方法均可以區(qū)別鑒定部分赤眼蜂物種，但都缺乏系統(tǒng)性，僅局限在部分地區(qū)展開研究，難以建立一個全面的檢索體系。如，PCR-RFLP所采用的限制性內(nèi)切酶各不相同，各研究間缺乏一定的比較性。而測序比對是指對特定的DNA序列進行測序，再與已知的序列進行比對，從而鑒定所測序的物種(Gariepyetal., 2007)。該方法可以直接提供分子標記的序列信息，所積累的數(shù)據(jù)可以在種間、種內(nèi)等多各個層次展開研究，應用于物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育關系構建、群體多樣性分析等多諸多方面(Stoeckle & Hebert, 2008; Cameron, 2014)。

Orrego等(1993)利用PCR擴增并測序了短管赤眼蜂T.pretiosum和松毛蟲赤眼蜂T.dendrolimi的ITS1序列，之后赤眼蜂的相關分子標記的序列信息不斷積累完善。截至2019年11月，生命條形碼數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)(Barcode of Life Data Systems, BOLD，www.boldsystems.org)已有來自37個國家2 700多條COI序列，覆蓋30個赤眼蜂的命名種；在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中，已積累有72個赤眼蜂命名種的ITS2序列。隨著測序成本的不斷下降，測序比對的方法無疑在赤眼蜂的分子鑒定中起到越來越重要的作用。Triapitsyn(2015)甚至提出，赤眼蜂新種的發(fā)表需上傳其多個分子標記的序列。

然而，相較于PCR-RFLP、HRM等方法，測序的成本仍相對較高，周期相對較長。此外，值得注意的是，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中已上傳序列可能存在赤眼蜂物種的錯誤鑒定。如，在生命條形碼數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中，BOLD ∶AAD6262由一條標記為食胚赤眼蜂T.embryophagum的COI序列與其他44條甘藍夜蛾赤眼蜂T.brassicae序列聚類在一起，提示潛在的物種鑒定錯誤。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，ITS2序列AF453568和AF453569所標記物種為T.maidis，但后來發(fā)現(xiàn)其正確物種應為廣赤眼蜂T.evanescens(Murthyetal., 2013)。另，Hua等(2018)通過對8種赤眼蜂、16個地理種群的COI序列構建進化樹分析，也提示螟黃赤眼蜂T.chilonis來自印度種群的COI序列(KU575095)可能存在物種的錯誤鑒定。

3 總結與展望

赤眼蜂的分子鑒定相較于傳統(tǒng)鑒定具有十分突出的優(yōu)點，解決了之前赤眼蜂形態(tài)學鑒定中的一些難點，如雄蜂以外的發(fā)育階段、近緣種、孤雌品系的鑒定等(Stouthamer, 2006)。然而，赤眼蜂的鑒定還遠無法做到完全依賴于分子鑒定，以后也不可能完全拋棄經(jīng)典的形態(tài)學鑒定。另外，所有可靠的分子鑒定方法的研究和開發(fā)，都必須建立在正確形態(tài)鑒定的基礎上(黨向利, 2003; Stouthamer, 2006; Huaetal., 2018)。

隨著組學技術的普及，赤眼蜂越來越多的組學信息得到了解析。目前已經(jīng)有赤眼蜂屬的1個基因組(Lindseyetal., 2018)、3個線粒體基因組(陳龍, 2016; Chenetal., 2018; Shenetal., 2019)及多個轉(zhuǎn)錄組發(fā)表(Zhangetal., 2016; Wuetal., 2017; Kerimaetal., 2018)。大規(guī)模的比較組學分析使得全面、系統(tǒng)地篩選、評估新型分子標記成為可能。隨著高通量測序成本的不斷下降，全基因組測序可能成為未來常用的DNA多態(tài)性檢測手段。理論上，基于廣泛深入的表型-基因型關系的研究，全基因組測序不僅可以準確地鑒定蜂種，還可以預測赤眼蜂的重要農(nóng)業(yè)性狀，如寄生力、抗藥性等。

此外，新技術的不斷涌現(xiàn)，如等溫擴增技術(Isothermal Amplification)、基于CRISPR/Cas的分子檢測技術、單分子測序技術、微流控芯片等技術的發(fā)展，也為今后赤眼蜂分子鑒定提供了新的思路。以重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等為代表的等溫擴增技術的應用，可以擺脫分子鑒定對PCR儀器的依賴(Piepenburgetal., 2006)。而基于CRISPR/Cas的分子檢測技術使低成本、便捷、靈敏、特異的分子檢測技術成為可能(Chertow, 2018; Lietal., 2019)。其中，以代表性的SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking)技術所生產(chǎn)的試紙，其靈敏度可達單分子水平，可以區(qū)分不同的病毒亞型(Myhrvoldetal., 2018)，而將CRISPR/dCas9耦合在石墨烯膜上，可把特定DNA分子的檢測轉(zhuǎn)化為電信號，從而達到準確、快速的鑒定(Hajianetal., 2019)。這些技術都有可能應用于赤眼蜂的鑒定。

也許不遠的將來，隨著新分子標記的發(fā)現(xiàn)、新技術的發(fā)展，更便捷、高效的赤眼蜂分子鑒定方法會不斷涌現(xiàn)。而檢測準確、操作便捷、成本低廉一直是赤眼蜂鑒定在規(guī)?；狈?、釋放中的迫切需求，也是赤眼蜂分子鑒定研究的不懈追求。不論現(xiàn)在還是將來，赤眼蜂分子鑒定無疑都是赤眼蜂研究和應用的重要工具，為挖掘赤眼蜂資源提供技術支撐。

致謝：感謝新疆大學胡紅英教授為本文初稿提出寶貴意見；感謝審稿專家在投稿過程中提出的建設性意見。