嗜肺軍團(tuán)菌致病性與效應(yīng)蛋白的研究進(jìn)展

黃雨萱，鄭賢惠，朱翠明，李水紅

(南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

軍團(tuán)菌屬(Legionella)是一類(lèi)需氧革蘭陰性桿菌，廣泛分布于天然淡水、人工供水系統(tǒng)(如沐浴器、噴水池、冷卻水塔)、空調(diào)制冷裝置、車(chē)輛的雨刷水箱及單細(xì)胞原生動(dòng)物(如阿米巴變形蟲(chóng))細(xì)胞內(nèi)[1]。目前，該屬已發(fā)現(xiàn)60多個(gè)菌種，約一半以上菌種可對(duì)人致病[2]，其中嗜肺軍團(tuán)菌 (Legionellapneumophila)的致病力最強(qiáng)。免疫力低下的人群因吸入含嗜肺軍團(tuán)菌的氣溶膠而引起人類(lèi)軍團(tuán)病(Legionella disease)，又稱(chēng)退伍軍人癥。軍團(tuán)病是一種可致命的急性發(fā)熱性呼吸道傳染病，由于首次暴發(fā)于1976年美國(guó)費(fèi)城召開(kāi)的一次退伍軍人大會(huì)期間而得名，此后陸續(xù)在全球出現(xiàn)多次小范圍的暴發(fā)流行[3-5]。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，軍團(tuán)病可分為龐蒂亞克熱 (Pontiac fever)和軍團(tuán)菌肺炎(Legionella pneumonia)兩種類(lèi)型。龐蒂亞克熱是一種非肺炎型軍團(tuán)病，主要表現(xiàn)為急性流感綜合征，無(wú)明顯肺部病變，通常3～5 d即可自愈。軍團(tuán)菌肺炎是一種以肺部病變(如化膿性支氣管炎、大葉性肺炎伴小膿腫形成)為主的急性全身性疾病，可由肺部遷徙入血引起播散，導(dǎo)致皮膚、肌肉、消化、神經(jīng)等多系統(tǒng)損傷[6]。軍團(tuán)菌肺炎發(fā)病迅速、病死率高，已引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。

1 嗜肺軍團(tuán)菌的胞內(nèi)生存機(jī)制

嗜肺軍團(tuán)菌可在營(yíng)養(yǎng)較少的污水中存活數(shù)月甚至一年，且易與水中其他微生物相互作用形成混合菌生物被膜(biofilm)[7-9]。此時(shí)的嗜肺軍團(tuán)菌生存能力較強(qiáng)，但對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力則相對(duì)較弱，處于“活而不可養(yǎng)”(viable but non-culturable, VBNC)狀態(tài)[10-11]。自由生活阿米巴(FLA)能以細(xì)菌為食，被稱(chēng)作微生物界的“特洛伊木馬”；而抗阿米巴菌能在FLA胞內(nèi)存活與增殖，引起人類(lèi)致病菌的擴(kuò)散和傳播[12]。嗜肺軍團(tuán)菌是一種典型的兼性胞內(nèi)菌和抗阿米巴菌，能通過(guò)FLA (如棘阿米巴、福氏耐格里阿米巴)的吞噬而在其細(xì)胞中存活和增殖[13]。軍團(tuán)菌除了可以在阿米巴等單細(xì)胞原始動(dòng)物胞內(nèi)寄生和增殖外，還可以侵染哺乳動(dòng)物的肺泡上皮細(xì)胞 (epithelial cell)和單核巨噬細(xì)胞(macrophage cell)，并在其中增殖，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。

嗜肺軍團(tuán)菌被阿米巴捕食后，迅速被封入由線粒體和細(xì)胞囊泡包繞的吞噬囊泡中，這個(gè)含有嗜肺軍團(tuán)菌囊泡體的結(jié)構(gòu)被稱(chēng)作Legionella-containing vacuole(LCV)。嗜肺軍團(tuán)菌分泌的效應(yīng)蛋白(effector)可調(diào)控宿主胞內(nèi)運(yùn)輸途徑和內(nèi)外環(huán)境。吞噬起始階段，LCV表面因帶有宿主線粒體核糖體成分始終不會(huì)被酸化，同時(shí)募集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡輸送的蛋白并與之連接[14]。吞噬最后階段，LCV膜融入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被多層粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜所包圍，形成一種內(nèi)體阻滯吞噬體(endosomal maturation-blocked, EMB)[15-16]。EMB的形成進(jìn)一步抑制了LCV與溶酶體的融合，而避免被降解消化。

侵染早期，嗜肺軍團(tuán)菌在效應(yīng)蛋白的作用下，干擾宿主的細(xì)胞周期，抑制宿主細(xì)胞的凋亡，創(chuàng)造出理想的胞內(nèi)增殖環(huán)境，幫助軍團(tuán)菌從宿主細(xì)胞中逃逸與增殖[17-18]。侵染后期，隨著嗜肺軍團(tuán)菌在EMB中不斷地消耗宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并大量增殖，最終漲破吞噬泡。嗜肺軍團(tuán)菌分泌的某些效應(yīng)蛋白可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，使宿主細(xì)胞裂解死亡，從而從宿主胞內(nèi)成功釋放[19]。

2 嗜肺軍團(tuán)菌的致病物質(zhì)

嗜肺軍團(tuán)菌產(chǎn)生的酶類(lèi)(肽基脯氨酰基異構(gòu)酶、磷酸酯酶、DNA酶、蛋白水解酶等)、毒素(內(nèi)毒素、細(xì)胞毒素等)和溶血素可造成宿主細(xì)胞損傷。肽基脯氨酰基異構(gòu)酶可增強(qiáng)侵染巨噬細(xì)胞的能力[20]；磷酸酯酶可抑制中性粒細(xì)胞超氧化物陰離子的產(chǎn)生，而后者可作為第二信使參與免疫應(yīng)答等生理功能；細(xì)胞毒素可影響中性粒細(xì)胞的氧化代謝；脂多糖可促進(jìn)嗜肺軍團(tuán)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，并具有促炎作用，引起肺部感染[21-22]。軍團(tuán)菌產(chǎn)生的這些致病物質(zhì)還可對(duì)抗宿主的免疫殺傷，使其在吞噬囊泡中存活并增殖，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡[23]。嗜肺軍團(tuán)菌內(nèi)毒素除引起高熱、低血壓、彌散性血管內(nèi)凝血、內(nèi)毒素休克等革蘭陰性?xún)?nèi)毒素相同生理病理反應(yīng)外，還可通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，促進(jìn)嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)入單核巨噬細(xì)胞胞內(nèi)[24]。此外，菌毛的黏附作用，微莢膜的抗吞噬作用也參與其發(fā)病過(guò)程。

嗜肺軍團(tuán)菌可以在宿主細(xì)胞內(nèi)存活主要是依賴(lài)其獨(dú)特的毒力分泌系統(tǒng)向宿主胞內(nèi)注入分泌型效應(yīng)蛋白。嗜肺軍團(tuán)菌具有I、II、IVA、IVB及V型分泌系統(tǒng)[25]，其中IVB型分泌系統(tǒng) (type IVB secretion system, T4BSS) 在侵染宿主的過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[26-27]。T4BSS分泌系統(tǒng)又被稱(chēng)作Dot/Icm分泌系統(tǒng)，主要由2個(gè)致病區(qū)域(共7個(gè)基因和18個(gè)Icm)組成。其中Dot 代表細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷基因(defective organelle trafficking gene)，Icm代表細(xì)胞內(nèi)繁殖基因 (intracellular multiplication gene)。嗜肺軍團(tuán)菌Dot/Icm IVB型分泌系統(tǒng)是其最主要的毒力系統(tǒng)，可向宿主細(xì)胞內(nèi)注入300種以上的效應(yīng)蛋白，而這些蛋白在其侵染宿主過(guò)程中發(fā)揮了重要生物學(xué)功能[28]。

3 嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白的主要功能

嗜肺軍團(tuán)菌的毒力因子除普通胞外菌具有的侵襲力和毒素外，還包括能影響其在宿主細(xì)胞內(nèi)存活與增殖的所有菌蛋白[29]。嗜肺軍團(tuán)菌非效應(yīng)蛋白的毒力蛋白包括：Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FeoB[30]、鞭毛調(diào)控σ因子FliA[31]、磷脂酶A調(diào)控σ因子RpoS[32]、肽基脯氨?；?lè)串悩?gòu)酶Mip[33]、毒素RtxA[34]、促內(nèi)吞蛋白EnhC[35]和熱休克蛋白HSP60[36]等。Dot/Icm分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白作為主要的效應(yīng)蛋白，由于其在致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近年來(lái)相關(guān)研究逐漸增多。這些效應(yīng)蛋白參與軍團(tuán)菌感染、復(fù)制、增殖和自噬的各個(gè)階段，但是目前對(duì)大多數(shù)效應(yīng)蛋白的功能研究相對(duì)較少，為了深入了解效應(yīng)蛋白的功能，現(xiàn)將國(guó)內(nèi)外研究較多的效應(yīng)蛋白的生物學(xué)功能歸納如下。

3.1 形成保護(hù)性LCV，避免與溶酶體融合 研究[37-38]表明：Dot/Icm系統(tǒng)缺陷的嗜肺軍團(tuán)菌突變株被宿主吞噬后，可與酸性LAMP1-陽(yáng)性的溶酶體結(jié)合而被消滅；而Dot/Icm系統(tǒng)完整組裝后，則可直接阻斷與溶酶體的結(jié)合。嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白可通過(guò)俘獲宿主胞內(nèi)參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的重要蛋白，從而干擾宿主囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)；同時(shí)通過(guò)俘獲宿主胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體囊泡，形成可保護(hù)自身的寄生性囊泡LCV使其不被溶酶體識(shí)別消化，幫助其在宿主胞內(nèi)的存活與增殖[39-40]。這些效應(yīng)蛋白包括SidM、SidD、LidA、LepB、RalF、AnkX/Lem3、VipA、VipD、SidC、SidE、SidJ、LseA、PieE、LegG1、RidL 和YlfA/LegC7等[41]。

SidM (DrrA) 具有鳥(niǎo)苷酸交換因子 (GEF) 和鳥(niǎo)苷酸解離抑制因子釋放因子 (GDF) 雙重活性，并可對(duì)Rab1蛋白特異性識(shí)別；而Rab蛋白作為一種分子開(kāi)關(guān)，在囊泡的出芽、轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、錨定、融合的各階段發(fā)揮重要作用[40, 42-43]。嗜肺軍團(tuán)菌SidM正是通過(guò)俘獲介導(dǎo)宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子Rab1，使其形成成熟的LCV。首先SidM 通過(guò)對(duì)Rab1 的特異性識(shí)別，與AnkX 和Lem3一起輔助解離Rab1-GDI 復(fù)合物，并與LidA共同完成對(duì)Rab1 的競(jìng)爭(zhēng)性俘獲和穩(wěn)定，參與Rab1激活和AMP化修飾。在調(diào)控后期，SidD 通過(guò)對(duì)Rab1的AMP化修飾，促進(jìn)LepB 識(shí)別并水解Rab1-GTP，使Rab1 再次回到活性關(guān)閉狀態(tài)，并從LCV 上脫離且被胞內(nèi)GDI 回收，構(gòu)成完整的膜循環(huán)[41, 44-46]。 此外，VipA和VipD在嗜肺軍團(tuán)菌調(diào)控宿主囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中亦發(fā)揮了重要作用。VipA通過(guò)參與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合與聚合而調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，VipD通過(guò)阻止一些小G 蛋白(如Rab5、Rab22)進(jìn)入正常的膜循環(huán)，抑制宿主溶酶體成熟[47-48]。

3.2 激活抗凋亡NF-κB通路，抑制宿主細(xì)胞凋亡 嗜肺軍團(tuán)菌感染早期需要在宿主細(xì)胞內(nèi)大量繁殖從而侵染細(xì)胞，因此，宿主細(xì)胞的過(guò)早凋亡對(duì)軍團(tuán)菌的增殖與侵染極其不利。致病性嗜肺軍團(tuán)菌可通過(guò)向宿主胞內(nèi)分泌效應(yīng)蛋白調(diào)控宿主抗凋亡基因的表達(dá)，來(lái)抑制細(xì)胞凋亡或延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間。例如，可以通過(guò)正向調(diào)節(jié)NF-κB 通路(細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要調(diào)控因子)以延緩宿主細(xì)胞的凋亡。研究[49-50]表明：Dot/Icm 底物效應(yīng)蛋白LegK1、LnaB、SdhA、sidF 和LubX等可能參與激活宿主細(xì)胞抗凋亡NF-κB 通路。例如，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 (STPK) LegK1，能模擬宿主的IκB 而激活宿主的NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在宿主細(xì)胞中顯示出很強(qiáng)的NF-κB 信號(hào)活性，從而能起到防止宿主細(xì)胞過(guò)早凋亡的作用。某些蛋白激活宿主NF-κB 活性的機(jī)制尚不完全明確，可能是多個(gè)效應(yīng)蛋白協(xié)同作用的結(jié)果。

3.3 促使宿主細(xì)胞死亡，從宿主細(xì)胞中逃逸 嗜肺軍團(tuán)菌生命周期的最后一步是成功從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái)。LepA和LepB是兩個(gè)具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域 (coiled-coil domain) 的效應(yīng)蛋白，可能參與宿主裂解死亡過(guò)程。研究[51-52]發(fā)現(xiàn)：嗜肺軍團(tuán)菌LepA和LepB缺失株與野生株相比，在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力無(wú)顯著差異，而從原生動(dòng)物細(xì)胞中釋放的能力卻顯著下降。這些研究說(shuō)明LepA和LepB很可能在裂解宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，可幫助嗜肺軍團(tuán)菌從宿主細(xì)胞中成功逃逸。

3.4 帶有真核蛋白序列基元效應(yīng)蛋白的生物學(xué)意義 嗜肺軍團(tuán)菌基因組特征分析發(fā)現(xiàn)其基因組相當(dāng)大，可編碼大量類(lèi)真核生物蛋白或編碼的蛋白具有真核生物蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。例如，上文提到的STPK LegK1可通過(guò)激活宿主的NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制宿主細(xì)胞過(guò)早凋亡；STPK LegK3可引起較弱的酵母菌生長(zhǎng)抑制且可調(diào)節(jié)酵母菌屬的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[53]。通過(guò)觀察酵母胞內(nèi)LegK3與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的小泡之間的共同定位現(xiàn)象，可以發(fā)現(xiàn)他們之間存在相關(guān)作用[54]，但具體作用機(jī)制尚不明確。嗜肺軍團(tuán)菌可表達(dá)多種真核效應(yīng)蛋白，這些蛋白可介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用，是一類(lèi)潛在的毒力因子[55]。

3.5 效應(yīng)蛋白的其他生物學(xué)功能 嗜肺軍團(tuán)菌某些效應(yīng)蛋白還具有其他方面的生物學(xué)功能。例如：RomA含有甲基轉(zhuǎn)移酶的SET 結(jié)構(gòu)域，可甲基化修飾宿主細(xì)胞核質(zhì)，抑制宿主基因表達(dá)[56]；LegU2具有U-box結(jié)構(gòu)域，具有E3泛素化連接酶的活性，介導(dǎo)泛素化細(xì)胞周期蛋白Clk1，阻礙宿主細(xì)胞周期進(jìn)程[57]；黏附相關(guān)效應(yīng)蛋白SdeA可促進(jìn)細(xì)菌內(nèi)化[58]；鞭毛蛋白FliC (FlaA) 可促進(jìn)細(xì)胞炎性壞死 (又稱(chēng)細(xì)胞焦亡) 和細(xì)菌釋放[59-60]；SidK 通過(guò)靶向結(jié)合宿主v-ATP酶，抑制ATP 水解，阻止液泡酸化[61]；RidL可與內(nèi)吞體分選 (endosomes sorting) 重要復(fù)合物Retromer結(jié)合，抑制其介導(dǎo)的囊泡物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，以幫助嗜肺軍團(tuán)菌的生存與增殖[62]；SdeA能以一種特殊方式催化泛素化(蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一)過(guò)程[63]等。

嗜肺軍團(tuán)菌除能產(chǎn)生酶類(lèi)、毒素、菌毛和微莢膜等致病物質(zhì)外，還具有獨(dú)特的Dot/Icm IVB型毒力分泌系統(tǒng)，能夠向宿主細(xì)胞分泌超過(guò)300種效應(yīng)蛋白，而這些效應(yīng)蛋白在其致病過(guò)程中亦發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，被列為廣義的毒力因子。

這些效應(yīng)蛋白的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在以下三個(gè)方面：(1)侵染早期形成保護(hù)性LCV，有效避免與溶酶體融合而得以在胞內(nèi)存活與增殖。(2)侵染過(guò)程通過(guò)激活宿主NF-κB通路抗宿主細(xì)胞凋亡；通過(guò)抑制宿主細(xì)胞的凋亡增加對(duì)其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，可以在宿主胞內(nèi)更長(zhǎng)久的存活與增殖。(3)侵染后期，通過(guò)裂解LCV或宿主細(xì)胞，促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡或焦亡等方式幫助嗜肺軍團(tuán)菌從宿主細(xì)胞中順利釋放，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步侵染。參考文獻(xiàn)[64]現(xiàn)將報(bào)道較多的嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白歸納總結(jié)，見(jiàn)表1，含文中未提及的SidI、Lgt1、MavN和RavZ等效應(yīng)蛋白。

表1 嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白在胞內(nèi)增殖過(guò)程中對(duì)宿主細(xì)胞的作用途徑

4 總結(jié)與展望

嗜肺軍團(tuán)菌是一種可引起軍團(tuán)病(包括高致死性軍團(tuán)菌肺炎和龐蒂亞克熱)的病原菌。我國(guó)已將軍團(tuán)病列為需要重點(diǎn)防治的一種新發(fā)傳染病。因此，針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌開(kāi)展致病機(jī)制相關(guān)研究十分必要。

當(dāng)前，嗜肺軍團(tuán)菌絕大多數(shù)效應(yīng)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能尚未完全闡明，且效應(yīng)蛋白在調(diào)控表達(dá)的信號(hào)通路、與宿主靶蛋白及宿主各調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的相互作用等方面的研究尚在起始階段。全面深入地研究這些效應(yīng)蛋白對(duì)于詳細(xì)闡明嗜肺軍團(tuán)菌的致病機(jī)制具有重大意義，也為軍團(tuán)病的防治提供理論基礎(chǔ)和新的藥物靶標(biāo)。此外，嗜肺軍團(tuán)菌作為一種研究胞內(nèi)病原菌致病機(jī)制的理想模型，可為結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門(mén)菌等胞內(nèi)菌與宿主先天性免疫系統(tǒng)間的復(fù)雜信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究給予重要啟示。