膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜和關(guān)節(jié)液中miR-29a和VEGF的表達(dá)水平及意義

崔黎明， 曹建剛， 李強(qiáng)， 張志強(qiáng)

1天津市寧河區(qū)醫(yī)院骨一科(天津 301500)； 2天津市天津醫(yī)院骨科(天津 300211)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床常見的骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的一種慢性骨關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病率在中老年人中居高不下，嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)極大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。臨床常用影像學(xué)、關(guān)節(jié)鏡方法檢查KOA，但影像學(xué)不能靈敏地反映KOA患者關(guān)節(jié)受損程度，關(guān)節(jié)鏡給KOA患者帶來(lái)創(chuàng)傷，不利于常規(guī)檢測(cè)患者病情[2]。因此，急需尋找可早期診斷、病情評(píng)估的指標(biāo)。Ko等[3]發(fā)現(xiàn)微小RNA-29a(miR-29a)可通過(guò)靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)來(lái)抵抗KOA發(fā)病機(jī)制中的滑膜炎。VEGF在KOA患者滑膜和關(guān)節(jié)液中表達(dá)異常，且與KOA病情進(jìn)程相關(guān)[2]。但miR-29a、VEGF在KOA滑膜及關(guān)節(jié)液中的關(guān)系尚未明確。因此，本研究通過(guò)探究分析miR-29a、VEGF在KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中的表達(dá)情況及兩者與病情進(jìn)程的關(guān)系，以期為臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)KOA發(fā)生與發(fā)展提供診治靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年11月本院收治的KOA患者104例為研究對(duì)象，其中，男47例，女57例；年齡32～72歲，平均(57.93±6.59)歲；體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)21.19～26.58 kg/m2，平均(24.58±2.31)kg/m2；并選取同期半月板損傷患者104例進(jìn)行對(duì)照研究，其中，男50例，女54例；年齡30～74歲，平均(58.16±7.02)歲；BMI 為20.91～25.44 kg/m2，平均(23.29±2.26)kg/m2。兩組性別、年齡、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有KOA患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病分會(huì)確定的KOA判定標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)臨床資料完整者；(3)年齡30～74歲；(4)符合Kellgren-Lawrence(K-L)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ～Ⅳ級(jí)者；(5)所有受試者簽署知情同意書，該項(xiàng)研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等風(fēng)濕免疫性疾病者；(2)近期有注射關(guān)節(jié)藥物史、服用止痛藥史、服用糖皮質(zhì)激素藥物史者；(3)患有糖尿病、感染性疾病、血液病、慢性疾病、惡性腫瘤者；(4)合并嚴(yán)重心、肝、腎等器官功能不全者；(5)患有嚴(yán)重骨質(zhì)疏松及其他類型的關(guān)節(jié)性疾病者。

K-L分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)X線片顯示：Ⅱ級(jí)患者關(guān)節(jié)間隙呈現(xiàn)可疑性變窄，出現(xiàn)明顯骨贅；Ⅲ級(jí)患者關(guān)節(jié)間隙呈現(xiàn)明顯狹窄，出現(xiàn)中等量骨贅及骨質(zhì)硬化性該病；Ⅳ級(jí)患者關(guān)節(jié)間隙狹窄明顯，出現(xiàn)大量骨贅，骨質(zhì)硬化性病變嚴(yán)重，關(guān)節(jié)畸形明顯。依據(jù)K-L分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將納入KOA患者分組：Ⅱ級(jí)組31例，Ⅲ級(jí)組43例，Ⅳ級(jí)組30例。

1.2 主要試劑 TRIzol LS reagent購(gòu)買于美國(guó)Life Technologies公司；Taq Man MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq Man 通用PCR反應(yīng)混合物及Taq Man Assaay均購(gòu)買于美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 收集所有受試者關(guān)節(jié)鏡檢查時(shí)滑膜及關(guān)節(jié)液樣本，用無(wú)菌注射器采集關(guān)節(jié)囊中關(guān)節(jié)液4 mL，置5 mL EP管中，以1 800 r/min離心12 min，取上清液保存于EP管中，于-80℃冰箱中凍存，待檢。取受試者者關(guān)節(jié)滑膜組織置于標(biāo)本袋中，保存于-80℃冰箱中，待檢。

1.3.2 qRT-PCR法檢測(cè) -80℃冰箱中取出滑膜和關(guān)節(jié)液樣本，冰上解凍，滑膜組織研碎，依照TRIzol LS試劑盒說(shuō)明書加加TRIzol LS，提取總RNA，取2 μL總RNA利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量，合格樣本進(jìn)行下一步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照Taq Man MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將合格的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1 μL cDNA，用Taq Man 通用PCR反應(yīng)混合物及Taq Man Assaay將其PCR擴(kuò)增、定量檢測(cè)，引物序列見表1。反應(yīng)體系總體積為20 μL：2×Taqman ?Universal master mix 10 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water 8 μL，F(xiàn)/R各0.5 μL。反應(yīng)條件設(shè)置：97℃預(yù)熱8 min；95℃變性20 s，64℃退火25 s，40個(gè)循環(huán)。miR-29a、VEGF分別以U6、β-actin為內(nèi)參。2-ΔΔCT法對(duì)miR-29a、VEGF表達(dá)水平定量分析。

表1 miR-29a、VEGF及內(nèi)參U6、GAPDH的引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a、VEGF表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，KOA組滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，VEGF mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。見表2。

項(xiàng)目例數(shù)滑膜關(guān)節(jié)液miR-29aVEGFmiR-29aVEGF對(duì)照組1041.06±0.271.01±0.251.03±0.281.08±0.31KOA組1040.67±0.191.60±0.370.72±0.201.71±0.38t值11.56813.47410.2359.751P值0.0000.0000.0000.000

2.2 不同K-L分級(jí)KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a、VEGF表達(dá)水平比較 與Ⅱ級(jí)組患者相比，Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組患者滑膜中miR-29a表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，且隨分級(jí)增高降低越明顯；與Ⅱ級(jí)組患者比較，Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組患者VEGF表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

與Ⅱ級(jí)組患者相比，Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組患者關(guān)節(jié)液中miR-29a表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，且隨分級(jí)增高降低越明顯；與Ⅱ級(jí)組患者相比，Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組VEGF表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，且隨分級(jí)增高升高越明顯。見表3。

項(xiàng)目例數(shù)滑膜關(guān)節(jié)液miR-29aVEGFmiR-29aVEGFⅡ級(jí)組310.76±0.221.45±0.350.85±0.261.41±0.33Ⅲ級(jí)組430.64±0.17*1.63±0.38*0.70±0.21*1.75±0.39*Ⅳ級(jí)組300.53±0.14*△1.72±0.40*0.59±0.18*△1.99±0.41*△F值12.6124.10110.92818.088P值0.0000.0190.0000.000

*與Ⅱ級(jí)組比較P<0.05；△與Ⅲ級(jí)組比較P<0.05

2.3 KOA患者滑膜和關(guān)節(jié)液中miR-29a表達(dá)水平與VEGF表達(dá)水平的關(guān)系 Pearson相關(guān)性分析顯示，KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a表達(dá)水平與VEGF表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.701、-0.686，P<0.05)。見圖1、2。

2.4 滑膜和關(guān)節(jié)液miR-29a、VEGF mRNA及兩者聯(lián)合診斷KOA的價(jià)值 ROC曲線顯示，滑膜中miR-29a對(duì)KOA診斷的ROC曲線下面積(AUC)為0.857(95%CI:0.804～0.911)，截?cái)嘀禐?.855，其敏感度、特異度分別為83.7%、71.8%；VEGF對(duì)KOA診斷的AUC為0.928(95%CI:0.894～0.962)，截?cái)嘀禐?.306，其敏感度、特異度分別為78.8%、93.3%；兩者聯(lián)合對(duì)KOA診斷的AUC為0.954(95%CI:0.928～0.981)，其敏感度、特異度分別為90.4%、90.4%。見圖3。

關(guān)節(jié)液中miR-29a對(duì)KOA診斷的AUC為0.830(95%CI:0.774～0.886)，截?cái)嘀禐?.785，其敏感度、特異度分別為67.3%、84.6%；VEGF對(duì)KOA診斷的AUC為0.896(95%CI:0.869～0.950)，截?cái)嘀禐?.492，其敏感度、特異度分別為83.7%、87.5%；兩者聯(lián)合對(duì)KOA診斷的AUC為0.963(95%CI:0.941,0.986)，其敏感度、特異度分別為93.3%、88.5%。見圖4。

圖1 KOA患者滑膜中miR-29a與VEGF 表達(dá)水平的相關(guān)性

圖2 KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-29a與VEGF表達(dá)水平的相關(guān)性

圖3 滑膜中miR-29a、VEGF聯(lián)合診斷KOA的價(jià)值

圖4 關(guān)節(jié)液中miR-29a、VEGF mRNA聯(lián)合診斷KOA的價(jià)值

3 討論

OA是在關(guān)節(jié)軟骨病變、骨贅形成、滑膜炎的病變基礎(chǔ)上發(fā)展的一種疾病，KOA是OA常見的一種骨關(guān)節(jié)疾病。KOA以關(guān)節(jié)疼痛伴關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)積液為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病率較高，發(fā)病機(jī)制尚不明確，難以治愈，嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量，并給患者及其家庭帶來(lái)極重心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力[5]。因此尋找能夠早期診斷KOA的臨床指標(biāo)，及時(shí)正確評(píng)估病情，并給予合理治療方案，這對(duì)提高患者生命質(zhì)量具有重要意義。

miRNA是一類廣泛存在于機(jī)體各處的具有高度保守性的非編碼RNA，可通過(guò)與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)堿基互補(bǔ)，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)、蛋白翻譯的目的，其在一系列生理病理進(jìn)展中發(fā)揮極其重要作用[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中miRNA表達(dá)失調(diào)，如miR-19b-3p[7]、miR-140-3p[8]，miRNA具有作為KOA診治的生物學(xué)指標(biāo)的潛能。miR-29a是miR-29家族的一員，可在滑膜和關(guān)節(jié)液中穩(wěn)定存在。Liu等[9]研究表明miR-29a可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展；有關(guān)研究也已經(jīng)證實(shí)miRNA-29a可抵抗膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病進(jìn)程中的滑膜炎，在KOA發(fā)病進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用[5]。以上研究提示miR-29a在KOA患者體內(nèi)低表達(dá)，抑制KOA發(fā)病進(jìn)展。本研究中顯示，KOA組患者滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，且KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a表達(dá)水平均隨分級(jí)增高而降低，提示滑膜、關(guān)節(jié)液miR-29a參與KOA疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。

VEGF是典型的細(xì)胞因子，可在多種炎癥活動(dòng)中發(fā)揮作用，可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞自身增殖、遷移及血管新生等生物學(xué)過(guò)程，并影響滑膜血管翳的產(chǎn)生，其過(guò)表達(dá)可造成滑膜長(zhǎng)期遭受炎癥侵襲、軟骨破壞等[2]。VEGF可參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[10]、強(qiáng)直性脊柱炎[11]、OA[12]等多種炎癥活動(dòng)。大量研究表明，VEGF與KOA患者功能影響、影像學(xué)分級(jí)及臨床表現(xiàn)密切相關(guān)[13-15]，KOA患者關(guān)節(jié)液中VEGF呈高表達(dá)。以上研究表明，VEGF與KOA發(fā)病進(jìn)程有關(guān)。本研究中，KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中VEGF表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照者，且KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中VEGF表達(dá)水平均隨分級(jí)增高呈上升趨勢(shì)，與祝百龍等[16]研究結(jié)果類似，提示滑膜、關(guān)節(jié)液VEGF參與KOA疾病的發(fā)生與發(fā)展，VEGF可作為KOA患者病情進(jìn)展評(píng)估的臨床指標(biāo)。

有關(guān)研究表明，miR-29a與VEGF具有相關(guān)性[3]。本研究表明KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a與VEGF表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)，提示兩者可能通過(guò)相互作用，共同調(diào)控KOA發(fā)病進(jìn)展。miR-29a、VEGF在KOA中表達(dá)失調(diào)，提示兩者可能在KOA診斷中具有一定診斷價(jià)值。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a、VEGF對(duì)KOA均有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，但特異度較低，兩者聯(lián)合診斷KOA滑膜、關(guān)節(jié)液中的AUC分別為0.954、0.963，敏感度分別為90.4%、93.3%，對(duì)應(yīng)特異度分別為90.4%、88.5%。提示miR-29a、VEGF在滑膜和關(guān)節(jié)液中對(duì)KOA具有一定的診斷價(jià)值，兩者聯(lián)合可提高對(duì)KOA的診斷特異度，可較好地診斷KOA。

綜上所述，KOA患者滑膜、關(guān)節(jié)液中miR-29a表達(dá)下調(diào)，VEGF表達(dá)上調(diào)，兩者呈負(fù)相關(guān)，且對(duì)KOA診斷具有一定價(jià)值。但本研究樣本量較少，可能存在一定偏頗，后期將擴(kuò)大樣本量深入研究。