高遷移率族蛋白B1在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2 發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中的作用*

陳毅華, 程芳, 何選秋, 周元平, 彭雁忠, 李雅琴, 戴璐, 齊明華△

1北京大學(xué)深圳醫(yī)院感染性疾病科(廣東深圳 518035)； 2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染性疾病科(廣東廣州 510515)

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)作為一種損傷相關(guān)模式蛋白，于1973年被發(fā)現(xiàn)，屬高遷移率族成員。高遷移率蛋白家族還包括高遷移率族蛋白B2(high mobility group box 2, HMGB2)和高遷移率族蛋白B3(high mobility group box 3, HMGB3)，其特點(diǎn)為分子量低，在凝膠電泳中遷移率高。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)人體的血壓、水分、電解質(zhì)等中起著非常重要的作用，是人體中一個(gè)關(guān)鍵的神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)。RAS主要包括血管緊張素原酶、血管緊張素原、血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)和血管緊張素受體。目前研究表明，AngⅡ和HMGB1都能在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲作用上促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但AngⅡ與HMGB1的作用關(guān)系目前尚不明確。因此，我們于2017年6月至2018年6月通過(guò)調(diào)控HMGB1的表達(dá)，觀察AngⅡ誘導(dǎo)HepG2發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 本研究所用肝癌細(xì)胞HepG2由北京大學(xué)深圳醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)方法參照以前的研究[1]，用DMEM 在37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，[Gibco DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：C11875500BT)加入10%熱滅活Gibco 胎牛血清(貨號(hào)：10099-141)，100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素]。臺(tái)盼藍(lán)染色法評(píng)估細(xì)胞活性。

用胰酶消化細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶中，每瓶約106個(gè)細(xì)胞，利用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋AngⅡ至終濃度為10-7nmol/L。分為表達(dá)組、SiRNA靜默組和對(duì)照組，表達(dá)組和SiRNA靜默組加入含有AngⅡ的培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞用正常的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)細(xì)胞12 h。

1.2 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染并過(guò)表達(dá)HMGB1基因 從HepG2細(xì)胞中提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板，擴(kuò)增HMGB1基因，引物F:5′-CATGGGCAAAGGAGATCCTAAG-3′,R:5′-CTGCGCTAGAACCAACTTATTC-3′，將擴(kuò)增的HMGB1基因片段克隆至pMD19-T載體。使用EcoRⅠ酶和HindⅢ酶將酶切后的pcDNA3.1載體和pMD19-HMGB1基因片段，回收酶切產(chǎn)物，將HMGB1基因片段克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1+(Invitrogen，美國(guó))中，構(gòu)建HMGB1真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HMGB1。EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定HMGB1真核表達(dá)載體，將構(gòu)建成功的HMGB1真核表達(dá)載體送測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，利用Lipofecamine 3000(Invitrogen, 美國(guó))將帶有人HMGB1基因的載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，同時(shí)將pcDNA3.1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞做空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染方法操作參照說(shuō)明書(shū)。

1.3 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 根據(jù)Genbank中提供的人HMGB1基因序列，利用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件http://sirna.wi.mit.edu/show_oligo.cgi，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)HMGB1基因的siRNA，序列為GGA UAU UGC UGC AUA UCG AUU UCG AUA UGC AGC AAU AUC CUU。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞株，通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證HMGB1基因表達(dá)改變。

1.4 RT-PCR檢測(cè)和Western blot分析 實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書(shū)，使用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)合成單鏈cDNA。SYBR Green法進(jìn)行樣品定量檢測(cè)，2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。ΔCt=(目的基因Ct-內(nèi)參Ct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；ΔΔCt=(待測(cè)樣品中目的基因ΔCt-參照樣品中目的基因ΔCt)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(選擇“空載”為參照進(jìn)行計(jì)算)；相對(duì)表達(dá)量=(2-ΔΔCt)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。QPCR檢測(cè)引物為：HMGB1-上游5′-GCC AAG GAA TCC AGC AGT TTG-3′，HMGB1-下游5′-CCA CCA GGA CAG GGC TAT CT-3′；內(nèi)參引物β-actin-F: 5′-CATCACTGCCACCCAGAAGACT-3′，β-actin-R: 5′-GGTAGGAACACGGAAGGCCAT-3′。同時(shí)提取總蛋白后，BCA法初步測(cè)定蛋白濃度。樣品蛋白在60℃溶解15 min后聚丙烯梯度電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Milipore,美國(guó))上。雜交膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，后用0.2%的TBST緩沖液室溫洗滌4次。兔抗人HMGB1抗體(Santa Cruz,美國(guó))以1∶3 000進(jìn)行稀釋。室溫孵育約1 h左右， 顯影后用冷CCD成像儀顯影，使用Image J軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各個(gè)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1基因表達(dá) 轉(zhuǎn)染過(guò)HMGB1表達(dá)載體和HMGB1-siRNA后，通過(guò)Wester blot檢測(cè)HMGB1基因表達(dá)改變。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HepG2-HMGB1-siRNA細(xì)胞中，HMGB1基因表達(dá)受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 HMGB1-siRNA表達(dá)HepG2細(xì)胞中的效果檢測(cè)

2.2 AngⅡ誘導(dǎo)EMT標(biāo)志蛋白在HMGB1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及干擾的肝癌細(xì)胞中表達(dá)的改變 通過(guò)Image J軟件分析條帶灰度值，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析后發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的Western blot 結(jié)果顯示如圖2，與正常HepG2細(xì)胞相比，經(jīng)AngⅡ處理后，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與陰性對(duì)照相比，HMGB1高表達(dá)HepG2細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.001)；與陰性對(duì)照相比，HMGB1干擾的HepG2細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，E-cadherin蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)AngⅡ處理的HMGB1高表達(dá)HepG2細(xì)胞與AngⅡ處理的正常HepG2細(xì)胞相比，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)。

波形蛋白(Vimentin蛋白)的Western blot 結(jié)果顯示如圖2及表1，與正常HepG2細(xì)胞相比，經(jīng)AngⅡ處理后，Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)；與陰性對(duì)照相比，HMGB1高表達(dá)HepG2細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.001)；與陰性對(duì)照相比，HMGB1干擾的HepG2細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，Vimentin蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)AngⅡ處理的HMGB1高表達(dá)HepG2細(xì)胞與AngⅡ處理的正常HepG2細(xì)胞相比，Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。

圖2 Western Blot驗(yàn)證EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白在肝癌細(xì)胞中的變化

表1 肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)

3 討論

肝癌作為一種常見(jiàn)的人類惡性腫瘤，近年來(lái)其在人群中的發(fā)病率躍居惡性腫瘤的前5位。全球流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，每年約有78萬(wàn)新增的肝癌患者，其中一半的患者在我國(guó)[2]。邵海妍等[3]通過(guò)對(duì)1991—2011年中國(guó)15～84歲居民的肝癌死亡趨勢(shì)分析發(fā)現(xiàn)，在這期間，我國(guó)居民肝癌病死率整體呈上升趨勢(shì)，城市、農(nóng)村人群肝癌病死率分別由1991年的19.63/10萬(wàn)、22.25/10萬(wàn)上升至2011年的23.61/10萬(wàn)、27.12/10萬(wàn)。目前，肝癌的病死率已經(jīng)超過(guò)胃癌、結(jié)直腸癌，在所有惡性腫瘤中僅次于肺癌，排第2位[4]。

目前，原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確。HCC轉(zhuǎn)移的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，有基礎(chǔ)研究表明腫瘤的生物學(xué)特性在很大程度上影響著肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，與其有關(guān)的癌基因、抑癌基因、黏附分子、基質(zhì)蛋白酶、細(xì)胞因子以及相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[5-6]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，ETM是肝癌細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[1]。闡明EMT在HCC中的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制對(duì)研發(fā)新的HCC治療靶點(diǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

高遷移率族蛋白(high mobility group box,HMG)是一組參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和DNA修復(fù)，與DNA結(jié)合相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，主要包括HMGB1、HMGB2和HMGB3[7]。

HMGB1的相對(duì)分子量為30 kD，是一種基因序列高度保守的非組蛋白核蛋白，在進(jìn)化中，哺乳動(dòng)物的HMGB1相似程度高達(dá)99%，主要參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，DNA修復(fù)及各項(xiàng)細(xì)胞的生命功能[8]。HMGB1作為內(nèi)源性分子，BOX B是發(fā)揮促炎反應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，通過(guò)損傷組織釋放到胞外，激活免疫系統(tǒng)，參與靜脈血栓、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。HMGB1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，在肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、神經(jīng)源性腫瘤等多種實(shí)體腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平高于正常組織，可能在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[11-12]。

經(jīng)AngⅡ處理后，HepG2侵襲和遷移能力增強(qiáng)， E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin表達(dá)上調(diào)；與陰性對(duì)照相比，HMGB1高表達(dá)的3種肝癌細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理后，侵襲和遷移能力增強(qiáng)，E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，Vimentin表達(dá)上調(diào)；與陰性對(duì)照相比，HMGB1干擾的3種肝癌細(xì)胞經(jīng)AngⅡ處理前后，侵襲和遷移能力無(wú)明顯差異，E-cadherin和Vimentin表達(dá)無(wú)明顯差異。

與我們研究結(jié)果相似，Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝癌細(xì)胞株Huh7和MHCC97H相比，HMGB1基因敲除后遷移和侵襲能力顯著降低，EMT相關(guān)蛋白表達(dá)降低；人膽管癌細(xì)胞經(jīng)HMGB1基因敲除后，E-Cadherin表達(dá)上調(diào)， N-Cadherin、Vimentin 和Snail基因表達(dá)下調(diào)，人膽管癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)變受到抑制，進(jìn)一步體外研究表明HMGB1可能通過(guò)促進(jìn)VEGF-C表達(dá)調(diào)節(jié)淋巴結(jié)微血管的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移[14]；Wang等[15]亦發(fā)現(xiàn)，HMGB1在直腸癌中可能起癌基因的作用，抑制內(nèi)源性HMGB1的表達(dá)有助于激活caspase 3和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，顯著抑制大腸癌細(xì)胞SW620和Colo320細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。大多數(shù)研究表明HMGB1有促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的能力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程，在人肝癌細(xì)胞系的生物學(xué)行為中HMGB1可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

肝癌細(xì)胞和祖細(xì)胞均屬于上皮細(xì)胞，肝癌細(xì)胞部分或整體的EMT轉(zhuǎn)化使肝癌在細(xì)胞水平上表現(xiàn)出異質(zhì)性，上皮細(xì)胞的可塑性變化增加了細(xì)胞異質(zhì)性。在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞為避免氧化損傷和原發(fā)性腫瘤部位過(guò)量活性氧，顯示出與慢性肝損傷“逃逸反應(yīng)”中類似間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal to epithelial transition，MET)作用情況。因此，肝癌細(xì)胞或祖細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化實(shí)質(zhì)上是使間充質(zhì)細(xì)胞具有抗凋亡和遷移的特性，抵抗細(xì)胞死亡刺激，并向細(xì)胞因子豐富的微環(huán)境轉(zhuǎn)移。在EMT作用下，肝癌細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化為上皮細(xì)胞、部分經(jīng)EMT誘導(dǎo)的間充質(zhì)細(xì)胞或完全經(jīng)EMT誘導(dǎo)的與纖維化組織中肝星狀細(xì)胞衍生的肌成纖維細(xì)胞類似的間充質(zhì)細(xì)胞，這些表型在腫瘤的任何階段均可以MET逆轉(zhuǎn)，恢復(fù)上皮性狀[16]。此外，EMT能夠通過(guò)促進(jìn)促血管生成因子生成，促進(jìn)肝癌腫瘤內(nèi)部血管生成，為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)素和氧供支持，逃逸腫瘤細(xì)胞通過(guò)循環(huán)傳播，EMT對(duì)MET的可逆性被認(rèn)為是遠(yuǎn)端定植的又一標(biāo)志。

本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在肝癌組織中表達(dá)異常升高。進(jìn)一步功能研究表明，在肝癌細(xì)胞中AngⅡ能通過(guò)誘導(dǎo)HMGB1表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，HMGB1能促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程。