低濃度二甲雙胍干預(yù)肝癌微環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的機(jī)制*

陳紀(jì)濤, 殷威達(dá), 劉兆宇, 李明, 方向明, 劉季芳

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院腫瘤科(廣東廣州 510700)

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞脫離正常的細(xì)胞周期，從此喪失增殖能力進(jìn)入一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，是細(xì)胞防御DNA損傷或癌基因刺激等造成的細(xì)胞生長失控和癌變的重要屏障。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老，不僅可以永久抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而且衰老的腫瘤細(xì)胞能被免疫系統(tǒng)清除導(dǎo)致腫瘤消退，因此，近年來腫瘤促衰老研究引起了學(xué)者們極大的興趣[1-3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與其所處的微環(huán)境息息相關(guān)[4]，腫瘤微環(huán)境(TME)是一種腫瘤內(nèi)部營養(yǎng)物資缺乏，酸度高，缺氧、缺血的環(huán)境，且其酸度是腫瘤活化的誘導(dǎo)物[5-6]。對(duì)TME的深入了解與研究，能夠?yàn)槟[瘤治療提供新的策略[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，低濃度(1 mmol/L)二甲雙胍治療肝癌HepG2細(xì)胞，呈現(xiàn)扁平鋪展、體積膨大、衰老樣細(xì)胞表型，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，作為細(xì)胞衰老有效標(biāo)志物的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal，其在pH=6.0的條件下表現(xiàn)活性)表達(dá)明顯升高，腫瘤細(xì)胞的增殖受到明顯抑制[8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：腫瘤細(xì)胞通過有氧糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，且瘤體內(nèi)缺氧環(huán)境誘導(dǎo)CA-Ⅻ催化CO2和H2O生成碳酸[9]。這時(shí)，腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)質(zhì)子泵(V型ATP酶，V-ATPases)、鈉氫交換蛋白1(Na+/H+exchanger,NHE1)等將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的H+排出胞外，從而維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)pH呈堿性(pH≥7.4)、細(xì)胞外呈酸性(pH=6.5～7.0)的微環(huán)境[10-11]。二甲雙胍是否通過改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)堿性環(huán)境促進(jìn)肝癌細(xì)胞衰老目前尚未清楚。因此，2019年3—8月，本文以這一科學(xué)問題展開研究，初步探討二甲雙胍通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老抑制其增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7、SK-HEP-1、Hep3b2.1-7和PLC/PRF/5購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑 二甲雙胍鹽酸鹽購自Sigma公司，CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay購自Promega公司，通用組織細(xì)胞衰老特異試劑盒購自上海紐杰美生物技術(shù)有限公司，NHE1抗體購自Abcam公司,V-ATPase、HIF-1α、Glut1和CAXII抗體及二抗均購自CST公司。

1.1.3 儀器 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國，Countstar IC-1000)、多功能酶標(biāo)儀(美國，BioTEK)、倒置熒光顯微鏡(德國，萊卡DMi8)、Western blot 系統(tǒng)(美國，Bio-Rad)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國，ChemiDoc XRS+)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌HepG2、Huh-7、SK-HEP-1、Hep3b2.1-7和PLC/PRF/5細(xì)胞從液氮中取出，放在37℃水浴鍋快速復(fù)蘇，HepG2細(xì)胞用RPMI 1640+10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，其它細(xì)胞以DMEM+10% FBS培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況定期換液和傳代。

1.2.2 衰老相關(guān)β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色實(shí)驗(yàn) 肝癌HepG2、Huh-7、SK-HEP-1、Hep3b2.1-7和PLC/PRF/5細(xì)胞長到對(duì)數(shù)生長期時(shí)，分別接種5×103個(gè)細(xì)胞/孔到24孔板中。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組中加入濃度為1 mmol/L的二甲雙胍，對(duì)照組中加入等體積對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，檢測細(xì)胞衰老情況。細(xì)胞SA-β-Gal檢測試劑步驟如下：在開始檢測前，先將SA-β-Gal試劑盒里的GENMED染色液(Reagent E)從-20℃的冰箱里取出，放在冰槽里等待融化。然后移取9.5 mL GENMED稀釋液(Reagent D)到15 mL離心管，加入500 μL GENMED染色液(Reagent E)，混勻后，放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱，標(biāo)記為GENMED染色工作液，然后進(jìn)行下列操作：(1)小心抽去24孔細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液；(2)每孔加入500 μL GENMED清理液(Reagent A)，清洗生長中的細(xì)胞表面；(3)小心抽去每孔中的清理液；(4)每孔加入500 μL GENMED固定液(Reagent B)，覆蓋整個(gè)生長表面；(5)在室溫下孵育5 min；(6)小心抽去固定液；(7)每孔加入500 μL GENMED酸性液(Reagent C)，清洗細(xì)胞表面；(8)小心抽去酸性液；(9)重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟7和8各一次；(10)每孔加入400 μL預(yù)熱的GENMED染色工作液，覆蓋整個(gè)細(xì)胞表面；(11)放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育3～16 h，或細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色(注意：避免液體蒸發(fā));(12)表達(dá)SA-β-Gal細(xì)胞為陽性細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，在200×高倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 MTS實(shí)驗(yàn) 將密度為90%的細(xì)胞用PBS清洗3次，加入胰酶消化，吹打混勻后吸取170 μL加入到含20 mL培養(yǎng)基的離心管中，混勻后將其均勻加入到96孔板中，每孔200 μL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后去掉培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)液類型，分別加入0 mmol/L 或1 mmol/L二甲雙胍的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，每孔200 μL，左邊區(qū)域40孔(每種濃度8個(gè)復(fù)孔)加入0 mmol/L二甲雙胍，右邊區(qū)域40孔加入1 mmol/L二甲雙胍，培養(yǎng)24 h。將20 μL MTS分別加入200 μL DMEM(RPMI 1640)+10%FBS的完全培養(yǎng)基中混勻，棄去96孔板的培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基類型分別加入200 μL MTS溶液，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，用多功能酶標(biāo)儀測量490 nm處吸光度，該吸光度值與細(xì)胞活力呈正相關(guān)。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7、SK-HEP-1、Hep3b2.1-7和PLC/PRF/5培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，1∶1傳代。第2天早上用100 μmol/L COCl2預(yù)處理細(xì)胞4 h，接著用1 mmol/L二甲雙胍孵育24 h后收集細(xì)胞提蛋白，BCA法測蛋白濃度。10%SDS凝膠電泳分析，上樣量為40 μg。電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白通過轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液2 h。PBST洗3次，每次5 min，根據(jù)Marker標(biāo)志減膜，按照抗體說明書稀釋抗體，4℃孵育過夜。第2天早上從4℃冰箱取出孵育盒置于常溫條件下30 min，回收一抗并用PBST洗滌3次，5 min/次，室溫下孵育二抗1 h，洗滌3次后用凝膠成像系統(tǒng)曝光，檢測肝癌細(xì)胞中NHE1、V-ATPase、HIF-1α、Glut1和CAXII蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 衰老細(xì)胞株的篩選 肝癌HepG2、Huh-7、SK-HEP-1、Hep3b2.1-7和PLC/PRF/5細(xì)胞，經(jīng)低濃度二甲雙胍處理，SA-β-Gal染色試劑盒檢測衰老標(biāo)志物SA-β-Gal的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7和PLC/PRF/5在藥物干預(yù)下更容易出現(xiàn)衰老表型(P<0.05)，其中Huh-7細(xì)胞最為顯著(P<0.01)。由于肝癌HepG2、Huh-7細(xì)胞衰老百分比較多，故接下來選擇這兩種細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。見圖1和表1。

圖1 二甲雙胍干預(yù)及衰老細(xì)胞株的篩選[SA-β-Gal染色(×200)]

表1 SA-β-Gal 陽性細(xì)胞數(shù)

2.2 細(xì)胞增殖能力檢測 對(duì)SA-β-Gal染色試劑盒檢測篩選出的肝癌HepG2和Huh-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)1 mmol/L二甲雙胍處理，MTS實(shí)驗(yàn)檢測藥物治療對(duì)這兩種細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞增殖受到抑制(P<0.05)，其中Huh-7細(xì)胞增殖速率顯著降低(P<0.01)，見表2。

項(xiàng)目HepG2Huh-7對(duì)照組1.18±0.201.24±0.17實(shí)驗(yàn)組0.98±0.171.02±0.12t值2.1603.121P值0.048 60.006 6

2.3 低氧條件下藥物干預(yù)對(duì)蛋白表達(dá)的影響 在缺氧條件下與正常對(duì)照組相比，肝癌HepG2和Huh-7細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍干預(yù)后，缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白表達(dá)受到抑制，而GLUT1和CAXII蛋白兩組相比無明顯差異。此外，實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞細(xì)胞膜質(zhì)子泵V-ATPase和NHE1表達(dá)下調(diào)。見圖2。

圖2 Western blot 檢測肝癌細(xì)胞微環(huán)境相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2018年全球腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：在世界范圍內(nèi)，肝癌發(fā)病率位居惡性腫瘤的第6位，致死率排第4位[12]。中國是肝癌高發(fā)區(qū)之一，每年大約有50%的新發(fā)病例發(fā)生在中國，且肝癌1～5年生存率從47%降低至10%[13]。目前對(duì)肝癌的治療分為兩大類，傳統(tǒng)治療和新興治療：傳統(tǒng)治療有手術(shù)治療，但中晚期無適應(yīng)癥；放化療，不良反應(yīng)比較大且患者容易產(chǎn)生耐受。新興治療有分子靶向治療，由于作用靶點(diǎn)有限且容易產(chǎn)生耐藥性；生物免疫治療靶向性強(qiáng)但作用單一；納米材料等載藥技術(shù)往往導(dǎo)致毒副作用和免疫排斥。因此，尋找性價(jià)比高且有效的治療措施，阻斷腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，對(duì)提高肝癌患者生存率具有重要意義。

近年來研究發(fā)現(xiàn)通過藥物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老從而抑制其增殖，衰老的細(xì)胞經(jīng)免疫系統(tǒng)進(jìn)行清除，這對(duì)于腫瘤的治療具有巨大的意義，引起了科研人員的極大興趣[14-15]。本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)，低濃度二甲雙胍通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老[16]。大量國內(nèi)外研究證實(shí)腫瘤微環(huán)境影響腫瘤進(jìn)展的多個(gè)方面，比如腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和放化療抗性等，其中腫瘤細(xì)胞所處酸性微環(huán)境扮演著重要的角色[17-18]。有學(xué)者研究報(bào)道，腫瘤細(xì)胞能通過上調(diào)V-ATPases和NHE蛋白表達(dá)等將胞內(nèi)H+排除胞外，進(jìn)而維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)PH堿性(pH≥7.4)、細(xì)胞外呈酸性(pH=6.5～7.0)的微環(huán)境[10-11]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肝癌HepG2和Huh-7細(xì)胞經(jīng)低濃度二甲雙胍干預(yù)后，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且細(xì)胞衰老特異性標(biāo)志蛋白SA-β-Gal表達(dá)升高。由于SA-β-Gal在pH=6.0的條件下表現(xiàn)活性，由此我們推測二甲雙胍可能在腫瘤胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步Western blot蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)，低濃度二甲雙胍治療能夠抑制HIF-1α的表達(dá)，這與前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相吻合[19]。而作為HIF-1α下游靶蛋白的GLUT1，其主要向腫瘤細(xì)胞內(nèi)輸送葡萄糖，以及參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境酸堿度pH值的CAXII蛋白，以往的研究結(jié)果表明二甲雙胍抑制其表達(dá)[19-20]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間沒有差異，可能與所使用的二甲雙胍濃度較低有關(guān)。最近我們的肝癌Huh-7細(xì)胞采用1 mmol/L二甲雙胍處理，使用代謝組學(xué)GC-MS代謝流檢測和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示治療組與對(duì)照組相比，糖酵解中丙酮酸和乳酸生成減少。以上數(shù)據(jù)提示二甲雙胍處理導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)酸性物質(zhì)合成減少。而本研究中我們還發(fā)現(xiàn)維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)外兩側(cè)pH值穩(wěn)定的關(guān)鍵蛋白V-ATPases和NHE1蛋白表達(dá)下調(diào)，肝癌HepG2和Huh-7細(xì)胞呈現(xiàn)衰老樣表型。據(jù)此我們推測：低濃度二甲雙胍可能通過影響V-ATPases和NHE蛋白的活性降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)pH值促進(jìn)其衰老，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而酸性物質(zhì)合成的減少有利于降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。但在肝癌中，二甲雙胍調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的具體方式和機(jī)制，目前還有待進(jìn)一步的研究。

肝癌發(fā)病率和致死率一直居高不下，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，科研和臨床工作者一直在努力尋找有效的治療手段。然而由于肝癌發(fā)病隱匿，反復(fù)手術(shù)患者耐受性差，對(duì)放化療不敏感，近年來興起的的分子靶向治療、納米材料載藥技術(shù)僅能在一定程度上抑制腫瘤的生長，但容易產(chǎn)生耐藥及免疫排斥，總體療效仍不盡如人意。只有掌握腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移所需微環(huán)境，才能更好地針對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)抑制其增殖。二甲雙胍是一種臨床上經(jīng)典降糖藥物，其價(jià)格便宜，本課題組發(fā)現(xiàn)該藥能夠通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老抑制其增殖，通過改變微環(huán)境抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。該研究為今后利用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老這種方式提高肝癌綜合療效提供了新的思路，為腫瘤患者的治療帶來了新的手段，具有十分重要的意義。