神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡在腦出血中的機(jī)制研究與展望

李明月綜述，鄒 偉審校

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)已成為全球每年影響數(shù)百萬(wàn)人生命的高發(fā)病率和死亡率的疾病之一。雖然治療ICH的藥物和方法已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)細(xì)胞死亡機(jī)制，探求新的干預(yù)靶點(diǎn)和手段仍是治療ICH、減少病死率、致殘率亟需解決的問(wèn)題。

1 鐵死亡的概述

“Ferroptosis”即鐵死亡，2012年由Dixon等[1]首次提出。Dixon團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)致癌的RAS選擇性致死小分子愛(ài)拉斯汀(Erastin)能夠引發(fā)一種獨(dú)特的鐵依賴(lài)形式的細(xì)胞死亡，這種特殊形式的細(xì)胞死亡不會(huì)被caspase依賴(lài)性凋亡，自噬以及其他細(xì)胞死亡形式的抑制劑阻斷，而是被鐵螯合劑以及一些親脂性抗氧化劑，脂質(zhì)過(guò)氧化抑制劑等顯著抑制。鐵死亡不同于其他形式的細(xì)胞死亡[2]，在形態(tài)學(xué)上，發(fā)生鐵死亡的細(xì)胞表現(xiàn)為線(xiàn)粒體體積縮小、雙層膜密度增加，線(xiàn)粒體嵴減少或消失。在生化水平上，谷胱甘肽(γ-glutamylcysteinylglycine，GSH)耗竭，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)活性下降，二價(jià)鐵離子以類(lèi)似芬頓(Fenton)反應(yīng)的方式產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)，脂質(zhì)氧化物不能經(jīng)GPX4催化的谷胱甘肽還原反應(yīng)代謝，繼而氧化膜脂質(zhì)，促使細(xì)胞膜完整性缺失，發(fā)生鐵死亡。

2 鐵死亡與腦出血

腦出血(ICH)是死亡率最高的腦卒中亞型。ICH后，除了血腫導(dǎo)致的最初物理壓迫外，血腫釋放的過(guò)量血紅蛋白和鐵在腦實(shí)質(zhì)中積累，導(dǎo)致鐵和脂質(zhì)代謝紊亂，加速神經(jīng)毒性。研究發(fā)現(xiàn)腦出血后的繼發(fā)性損傷不僅是由鐵離子催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的大分子物質(zhì)隨機(jī)破壞的結(jié)果，而且還會(huì)引發(fā)一種程序性的死亡，即鐵死亡。Zille 等[3]發(fā)現(xiàn)ICH后神經(jīng)細(xì)胞存在鐵死亡的藥理學(xué)改變和分子學(xué)特征。Li等[4]也用透射電鏡在血腫周?chē)窠?jīng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)鐵死亡特征性線(xiàn)粒體形態(tài)萎縮，可為腦出血后鐵死亡的發(fā)生提供強(qiáng)有力的證據(jù)。Zhang等[5]在利用膠原酶誘導(dǎo)的ICH模型中也發(fā)現(xiàn)了鐵死亡，并證實(shí)使用Ferrostatin-1可以預(yù)防在培養(yǎng)的海馬切片中，血紅蛋白引起的神經(jīng)元鐵死亡和鐵沉積。同時(shí)在腦出血的體內(nèi)模型中觀察到TUNEL標(biāo)記的DNA內(nèi)切核裂解；在體外模型中觀察到暴露在血紅素誘導(dǎo)下的細(xì)胞質(zhì)膜的溶解，前者代表鐵死亡另一重要特征，后者是鐵死亡發(fā)生的重要步驟[6]。因此限制鐵死亡相關(guān)的病理過(guò)程與減少腦損傷和改善ICH患者的生活質(zhì)量密切相關(guān)。

3 腦出血過(guò)程中影響鐵死亡的主要因素

3.1 鐵代謝 雖然神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)尚不明確，但鐵代謝障礙被認(rèn)為是鐵死亡的關(guān)鍵因素[3]。通常Fe2+被二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1(divalent metal transportor 1，DMT1)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，也可以通過(guò)血紅素載體蛋白以血紅素形式吸收進(jìn)入細(xì)胞。后經(jīng)銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP)氧化為Fe3+，與膜上完全不含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白(apotransferrin，ApoTf)結(jié)合，形成Tf-Fe3+復(fù)合物，后由膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TFR)識(shí)別并結(jié)合，形成轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Tf)復(fù)合物，內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，由于質(zhì)子進(jìn)入核內(nèi)體的主動(dòng)運(yùn)輸使腔內(nèi)pH值降低，導(dǎo)致復(fù)合物中的Fe3+被釋放，ApoTf和TfR被回收到細(xì)胞膜，重新開(kāi)始識(shí)別游離鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白絡(luò)合物。釋放的Fe3+必須經(jīng)過(guò)十二指腸酶細(xì)胞色素b還原酶(Dcytb)將其還原為Fe2+或被STEAP家族還原酶的6個(gè)跨膜上皮抗原成員還原為Fe2+后經(jīng)DMT1或鐵代謝調(diào)節(jié)因子鋅鐵調(diào)控蛋白(ZRT/IRT-like proteins，ZIP)家族中的兩種蛋白(ZIP8/14)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞質(zhì)不穩(wěn)定鐵池(labile iron pool，LIP)才能被機(jī)體所利用。其中大部分鐵存于血紅蛋白中以供氧運(yùn)輸，另外一部分以鐵蛋白的形式儲(chǔ)存，鐵池中的鐵也用于線(xiàn)粒體氧化磷酸化。多余部分Fe2+則由膜鐵轉(zhuǎn)出蛋白(ferroportin，F(xiàn)pn) 轉(zhuǎn)出細(xì)胞，在十二指腸的基底外側(cè)由膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白(hephaestin，HEPH)或CP將轉(zhuǎn)出細(xì)胞的Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+，然后與ApoTf結(jié)合重新進(jìn)入循環(huán)。然而過(guò)量Fe2+，可大大加速人體內(nèi)飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)線(xiàn)粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生活性氧的酶(如NADPH 氧化酶、脂氧合酶)造成影響，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧(ROS)，鐵沉積所引起的氧化反應(yīng)若超過(guò)細(xì)胞的抗氧化能力水平則可導(dǎo)致氧化應(yīng)激信號(hào)的啟動(dòng)，直接或間接地引起大分子的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。

另外鐵調(diào)素(Hepcidin)是一種肽激素，主要在肝臟中產(chǎn)生。其表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平受到鐵水平、促紅細(xì)胞生成素水平以及細(xì)胞環(huán)境的影響。Hepcidin翻譯后與Fpn的結(jié)合會(huì)引起Fpn的降解，從而抑制鐵的輸出[7]。

PCBP家族蛋白(poly-(rC)-binding protein，PCBP)和核受體共激活因子4 (cargo receptor，NCOA4)也被報(bào)道對(duì)鐵蛋白結(jié)合鐵的釋放至關(guān)重要。PCBP1和PCBP2被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)鐵伴侶，它們負(fù)責(zé)將鐵運(yùn)送到鐵蛋白，供鐵代謝、儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)使用。NCOA4被認(rèn)為是介導(dǎo)鐵蛋白自噬的相關(guān)蛋白，在鐵蛋白自噬過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用[8]。

研究發(fā)現(xiàn)鐵毒性引起的ICH早期腦損傷可以被鐵螯合劑改善，使用鐵螯合劑(去鐵胺、2，2′-聯(lián)吡啶或VK-28)可以減少鐵的積累，減輕灰白質(zhì)損傷，改善功能預(yù)后[9]，雖然鐵離子加速鐵死亡的具體機(jī)制尚不清楚，但鐵螯合劑已被證實(shí)可抑制鐵離子捐贈(zèng)電子到氧氣以形成ROS。另外在膠原酶誘導(dǎo)的血管損傷的體內(nèi)模型中，在損傷部位或遠(yuǎn)端直接注射鐵卟啉菌抑制劑可減少受損細(xì)胞的數(shù)量和損傷的大小，改善動(dòng)物的神經(jīng)功能[4]。因此腦出血患者可以從減少Hb和Fe2+誘導(dǎo)的毒性中受益。

另外研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦出血模型中DMT1表達(dá)水平增高[10]，DMT1是鐵代謝中唯一向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的蛋白，其表達(dá)增高可直接導(dǎo)致胞內(nèi)鐵含量增加。張紅霞等[11]通過(guò)觀察大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH) 后DMT1的表達(dá)變化及鐵死亡情況發(fā)現(xiàn)，DMT1的表達(dá)增高可引起鐵含量增高、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA增高以及GPX4的持續(xù)減少，引起鐵死亡的發(fā)生，而DMTI的抑制劑依布硒林可以減少細(xì)胞內(nèi)鐵、MDA含量，增加GSH含量和提高GPX4活性，改善腦水腫和神經(jīng)功能評(píng)分，其機(jī)制很可能是減少了鐵向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)繼而減輕鐵死亡，從而對(duì)SAH后早期腦損傷起到保護(hù)作用。

在轉(zhuǎn)錄水平上，ApoTf和TfR從細(xì)胞外環(huán)境中將鐵輸入細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程也受到主要轉(zhuǎn)錄因子鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2(iron response element binding protein 2，IREB2) 的調(diào)節(jié)，當(dāng)其基因沉默后，不僅影響鐵的攝入，還能夠使鐵蛋白重鏈和輕鏈表達(dá)增加，降低細(xì)胞內(nèi)鐵含量，抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[1]。Chang等[12]發(fā)現(xiàn)，腦出血小鼠模型口服表兒茶素(EC)具有神經(jīng)保護(hù)作用，EC可以減少I(mǎi)CH小鼠模型的早期腦損傷，降低病變體積，改善神經(jīng)系統(tǒng)的缺陷，其作用機(jī)制除了通過(guò)Nrf2信號(hào)通路提供神經(jīng)保護(hù)之外，還通過(guò)非Nrf2依賴(lài)途徑降低HO-1水平和腦鐵沉積，并調(diào)控鐵死亡相關(guān)基因，使腦出血后6 h IREB2 mRNA水平下降 20%。Reed等[13]的研究發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)節(jié)蛋白2(IRP2)表達(dá)通過(guò)減少TfR的表達(dá)減少鐵的吸收，通過(guò)誘導(dǎo)鐵蛋白的表達(dá)增加游離鐵的儲(chǔ)存，因此，IRP2在防止細(xì)胞鐵超載中起保護(hù)作用，可能潛在地抑制鐵死亡。因此，調(diào)控細(xì)胞鐵代謝和鐵蛋白自噬的相關(guān)受體是調(diào)控鐵死亡的重要節(jié)點(diǎn)之一。

3.2 脂質(zhì)過(guò)氧化 細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)取決于細(xì)胞生成的活性成分與細(xì)胞本身的抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡?；钚匝?ROS)、活性氮(RNS)和活性脂(RLS)等活性物質(zhì)在介導(dǎo)正常細(xì)胞生理活性和信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用；過(guò)多的活性物質(zhì)可以靶向細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)導(dǎo)致功能障礙。其中ROS和RNS與血漿或細(xì)胞器膜多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物就是引起脂類(lèi)大分子損傷的一個(gè)重要例子。其中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的RLS包括4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal，4-HNE)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)，與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，其中包括癌癥、卒中、神經(jīng)變性疾病、心血管疾病和肝病等[14]。

一般來(lái)講抗氧化劑，如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)是抵御過(guò)量ROS的第一道防線(xiàn)。然而，在過(guò)量Fe2+存在的情況下，H2O2可以通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基(OH-)，促進(jìn)PUFAs如(花生四烯酸/腎上腺酸(arachidonic acid，AA/adrenicacid，AdA))在細(xì)胞膜上的氧化。AA/AdA必須被酯化成膜磷脂才能傳遞鐵死亡信號(hào)，因此，負(fù)責(zé)AA/AdA自由擴(kuò)散以及活化和酯化進(jìn)入磷脂(PLs)的分子途徑都會(huì)影響細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的敏感性。Agmon等[15]研究發(fā)現(xiàn)酯?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4(Acyl-CoA synthetase long-chain familymember4，ACSL4)可以催化AA/AdA成為花生四烯酸/腎上腺-COA，(adrenic acid/arachidonic acid-CoA，AA/AdA-CoA)，溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase，3LPCAT3)可以將AA/AdA-CoA插入到溶血磷脂Lyso-PE，參與磷脂酰乙醇胺-多不飽和脂肪酸(phosphatidylethanolamine-adrenic acid/arachidonic acid，PE-AA/AdA)等膜磷脂的合成。磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)是被氧化并驅(qū)使細(xì)胞朝向鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵磷脂。在ALOX15存在的情況下，可將PE-AA/AdA進(jìn)一步氧化成雙/三氧化磷脂酰乙醇胺(PE-AA/AdA-OO(O))。目前認(rèn)為PL-OOH的積累是鐵死亡的一個(gè)重要特征，GPX4使用兩個(gè)GSH分子作為電子供體，可將脂質(zhì)過(guò)氧化氫(LOOH)還原為脂質(zhì)醇(L-OH)，從而減少對(duì)膜功能的損害[16]。

目前在人類(lèi)和小鼠腦出血后均可觀察到脂氧合酶和脂質(zhì)過(guò)氧化物的增加[17]。其中環(huán)加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是催化體內(nèi)AA合成前列腺素(PG) 步驟中的限速酶。Li等[4]在膠原酶誘導(dǎo)小鼠ICH模型中觀察到，前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(product cyclooxygenase-2，PTGS2)編碼的COX-2在ICH后神經(jīng)元高度表達(dá)，在小鼠腦出血病灶原位或腦室注射Ferrostatin-1后血腫周?chē)M織脂質(zhì)氧自由基和COX-2的產(chǎn)生被抑制，減少了ICH后的繼發(fā)性腦損傷，為ICH 患者提供了潛在臨床治療。另外研究表明GPX4抑制與COX-2和脂氧合酶(即ALOX15)的表達(dá)增加有關(guān)[18]，同時(shí)ALOX15抑制劑Zileuton也能保護(hù)HT22細(xì)胞免受Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[19]。另外據(jù)報(bào)道，ALOX15通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器的膜結(jié)合參與細(xì)胞器的程序性降解，并進(jìn)一步在體外發(fā)現(xiàn)ALOX15與線(xiàn)粒體結(jié)合，導(dǎo)致膜解體和ROS的產(chǎn)生[20]。因此通常COX-2和ALOX15也都被認(rèn)為是脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡的標(biāo)志物。

另外還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)作為GSH還原酶的輔酶，在其存在下，GSH還原酶可將GSSH還原為GSH，調(diào)控鐵死亡[21]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在鐵死亡過(guò)程中產(chǎn)生的ROS與NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOXs)增強(qiáng)相關(guān)[1]。此外，ACSL4的缺乏可防止RSL3誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體外膜破裂[22]。因此還原劑NADPH和ACSL4的低水平也都是與增強(qiáng)的鐵死亡敏感性相關(guān)的生物標(biāo)志物。因此調(diào)控脂質(zhì)代謝過(guò)程中的酶和提高細(xì)胞抗氧化作用是調(diào)節(jié)鐵死亡的另一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

3.3 谷氨酸代謝 胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)(Systerm Xc-)是由溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2/4F2hc)和溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11/xCT)兩個(gè)亞基以二硫鍵結(jié)合形成的異二聚體，是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化體系。在細(xì)胞外氧化狀態(tài)下，胱氨酸(cystine，Cys)通過(guò)濃度驅(qū)動(dòng)的、非Na+依賴(lài)的Systerm Xc-系統(tǒng)以1∶1的比率與谷氨酸(glutamate，Glu)進(jìn)行交換，Cys攝取入胞內(nèi)，并被迅速還原成半胱氨酸，參與胞內(nèi)GSH的合成；GPX4作為哺乳動(dòng)物中修復(fù)脂質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的硒蛋白，可使用兩個(gè)GSH分子作為電子供體，將磷脂過(guò)氧化氫(PL-OOH)還原為無(wú)毒脂醇(L-OH)，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能不受損害，同時(shí)將胞內(nèi)GSH 轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH耗竭誘導(dǎo)GPX4失活，會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致鐵死亡[16]。Zhang等[5]研究表明，在腦出血急性期GPX4的表達(dá)明顯減少，增加GPX4水平可使神經(jīng)元免于鐵死亡，改善預(yù)后；并進(jìn)一步證明GPX4的基因過(guò)表達(dá)可以顯著提高GPX4的水平，緩解腦出血后的氧化應(yīng)激狀態(tài)和神經(jīng)功能缺損；相反使用特異性抑制劑或基因敲減抑制GPX4水平會(huì)加速腦出血后腦損傷。另有研究表明半胱氨酸可以促進(jìn)GSH的產(chǎn)生，細(xì)胞滲透性半胱氨酸類(lèi)似物N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)可以中和花生四烯酸依賴(lài)的ALOX15催化所產(chǎn)生的毒性脂質(zhì)，進(jìn)而保護(hù)腦組織免受腦出血相關(guān)細(xì)胞鐵死亡的影響[17]。另一方面Systerm Xc-對(duì)細(xì)胞外谷氨酸的濃度異常敏感，文獻(xiàn)表明在各種腦損傷情況下神經(jīng)細(xì)胞外谷氨酸濃度均明顯升高，進(jìn)而抑制Systerm Xc-的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使胞內(nèi)GSH明顯減少，引發(fā)細(xì)胞鐵死亡[23]。同時(shí)，谷氨酸還有神經(jīng)遞質(zhì)的作用，谷氨酸水平過(guò)高會(huì)導(dǎo)致谷氨酸受體過(guò)度刺激導(dǎo)致興奮性毒性和神經(jīng)細(xì)胞死亡。Castillo等[24]對(duì)124例自發(fā)性腦出血患者進(jìn)行研究結(jié)果表明，腦出血患者的預(yù)后與谷氨酸的濃度密切相關(guān)。另外谷氨酸的濃度還與腦出血的殘腔體積和不良的神經(jīng)功能有關(guān)。因此如何降低細(xì)胞外谷氨酸的積累，調(diào)節(jié)谷氨酸代謝以及提高細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力是減輕鐵死亡的又一關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

3.4 線(xiàn)粒體功能損傷 線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一，雖然線(xiàn)粒體在鐵死亡中明顯受損，但有證據(jù)表明線(xiàn)粒體并沒(méi)有驅(qū)動(dòng)細(xì)胞鐵死亡過(guò)程。缺乏線(xiàn)粒體的細(xì)胞對(duì)鐵死亡仍然敏感。研究表明線(xiàn)粒體外膜破裂是一個(gè)晚期事件，與細(xì)胞裂解密切相關(guān)，而線(xiàn)粒體以外的脂質(zhì)過(guò)氧化作用發(fā)生在線(xiàn)粒體脂質(zhì)過(guò)氧化之前。然而對(duì)于靶向線(xiàn)粒體的抗氧化作用說(shuō)法也不盡相同，有研究表明線(xiàn)粒體靶向的活性氧清除劑(mitoquinone，MitoQ)可以從RSL3毒性中拯救神經(jīng)元細(xì)胞[25]。而線(xiàn)粒體靶向的自由基清除劑卻被相反地被報(bào)道為療效欠佳[7]。Krainz等[26]研究結(jié)果表明，在缺血/再灌注誘導(dǎo)的組織損傷、急性腎損傷和其他涉及鐵死亡途徑的病理中，防止線(xiàn)粒體脂質(zhì)氧化可能會(huì)提供一個(gè)可行的治療機(jī)會(huì)。而且線(xiàn)粒體靶向的 XJB-5-131，JP4-039以及其他硝基類(lèi)脂質(zhì)過(guò)氧化緩凝劑是一種有效的鐵死亡抑制劑。

另外線(xiàn)粒體鐵代謝在一定程度上與鐵死亡發(fā)生有關(guān)。MitoNEET又稱(chēng)CISD1，是一種含鐵的線(xiàn)粒體外膜蛋白，參與線(xiàn)粒體的鐵輸出[27]。敲除MitoNEET會(huì)加劇Erastin的毒性，增加線(xiàn)粒體鐵含量和脂質(zhì)過(guò)氧化作用，而MitoNEET的穩(wěn)定減弱了Erasin毒性，降低了線(xiàn)粒體脂質(zhì)過(guò)氧化作用。另外電壓依賴(lài)性陰離子通道(voltage-dependent anion channels，VDACs)，也被稱(chēng)為膜孔蛋白，是真核細(xì)胞輸送離子和代謝物的跨膜通道，其在線(xiàn)粒體外膜上分布較多。Erastin可以與線(xiàn)粒體外膜上的VDAC2和VDAC3 結(jié)合，改變膜的通透性。除此之外，Erastin也可改變VDAC的離子選擇性，導(dǎo)致通道只允許陽(yáng)離子進(jìn)入線(xiàn)粒體內(nèi)，引起線(xiàn)粒體功能障礙和氧化劑釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線(xiàn)粒體鐵蛋白(Mitochondrial ferritin，F(xiàn)tMt)是位于線(xiàn)粒體中的一種儲(chǔ)存鐵的蛋白質(zhì)，最新研究表明FtMt可顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝，其過(guò)度表達(dá)可顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡中FtMt的保護(hù)作用體現(xiàn)在對(duì)VDAC2/3表達(dá)的抑制和NOX2的抑制。NOX2活化作為ROS生成的主要NADPH氧化酶異構(gòu)體，可以顯著促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理氧化應(yīng)激。該研究揭示了FtMt對(duì)Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡的保護(hù)作用[28]。因此靶向線(xiàn)粒體鐵代謝也為識(shí)別神經(jīng)細(xì)胞中抑制鐵死亡的新靶點(diǎn)提供了新思路。

4 腦出血過(guò)程中鐵死亡相關(guān)的分子調(diào)控

4.1 Nrf2-ARE 細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生與鐵穩(wěn)態(tài)、氧化還原穩(wěn)態(tài)的失調(diào)關(guān)系密切。除了GPX4，核因子相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related actor 2，Nrf2)在調(diào)節(jié)腦出血后氧化反應(yīng)，減輕氧化損傷方面也起重要作用[29]。通常情況下細(xì)胞內(nèi)Nrf2主要通過(guò)與三種不同的E3泛素連接酶(KEAP1-CUL3-RBX1、SCF/β-TrCP、synoviolin/Hrd1)形成復(fù)合物保持較低水平。由于基因突變、氧化應(yīng)激，其他因子的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，或外源性藥物抑制，會(huì)使這些復(fù)合物的形成受到影響，進(jìn)而引起Nrf2釋放，并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核以啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)激活一組細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄，抵抗毒性損傷。有研究表明Nrf2核積累可以減少腦出血早期的腦損傷[30]，并進(jìn)一步證實(shí)在腦出血后72 h，Nrf2基因敲除小鼠較野生型小鼠腦出血誘導(dǎo)的病變體積更大，鐵超載細(xì)胞更多[12]。

Nrf2不僅參與氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，其在鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以及血紅素代謝方面也起重要作用。參與鐵儲(chǔ)存的蛋白如輕鏈鐵蛋白和重鏈鐵蛋白(light chain/heavy chain of ferritin，F(xiàn)TL/FTH1)，以及參與鐵輸出的Fpn均由Nrf2調(diào)控[31]。此外，對(duì)血紅素代謝起重要調(diào)節(jié)作用的血紅素加氧酶1(heme-oxygenase 1，HMOX1)、鐵螯合酶以及血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)體溶質(zhì)載體家族48成員A1(solute carrier family member 48 member A1，SLC48A1)均受到Nrf2的上調(diào)[32]。另外與鐵死亡發(fā)生相關(guān)的兩個(gè)最關(guān)鍵的靶點(diǎn)Systerm Xc-和GPX4，已被確定也由Nrf2調(diào)節(jié)，其抑制可直接引發(fā)鐵死亡[33]。

此外，Nrf2在調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體功能方面也起著重要作用，Nrf2可以與線(xiàn)粒體結(jié)合，從而監(jiān)測(cè)和響應(yīng)線(xiàn)粒體功能的變化[34]。Nrf2還調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)，包括生物合成[35]，以及線(xiàn)粒體自噬(通過(guò)P62依賴(lài)的，PINK1/Parkin獨(dú)立機(jī)制)[36]。另外線(xiàn)粒體靶向抗氧化劑MitoQ的保護(hù)作用也涉及Nrf2激活[37]。因此，靶向Nrf2在以脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡為特征的疾病中仍然是一種非?？尚械姆椒╗38]。

4.2 p53 典型的腫瘤抑制因子p53在拮抗腦出血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[39]，最近大量研究表明p53也是調(diào)控鐵死亡的重要轉(zhuǎn)錄介質(zhì)，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)p53可以負(fù)性調(diào)節(jié)Systerm Xc-的亞基(SLC7A11)的轉(zhuǎn)錄，使其對(duì)鐵死亡敏感[40]，其能力與應(yīng)用藥物抑制SCL7A11導(dǎo)致鐵死亡效果相當(dāng)[1]。另一方面，p53依賴(lài)的p21(CDKN1A)的轉(zhuǎn)錄[40]，以及p53依賴(lài)的DPP4的核聚集，似乎也可以通過(guò)保持氧化還原平衡來(lái)抑制鐵死亡。在機(jī)制上，p53-p21通路的激活很可能通過(guò)提高GSH水平抑制毒性脂質(zhì)ROS的積累，來(lái)抑制鐵死亡。但關(guān)于p21是如何促進(jìn)GSH的合成的還不清楚[41]。

關(guān)于p53是如何在鐵死亡過(guò)程中發(fā)揮作用的，OU等做了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，鑒定了SAT1(編碼spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1)基因作為p53的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，可以增加ALOX15的表達(dá)。ALOX15是將氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)化為鐵死亡脂質(zhì)過(guò)氧化的核心介質(zhì)。然而，盡管發(fā)現(xiàn)了SAT1與ALOX15誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)性，但SAT1調(diào)控ALOX15表達(dá)的確切機(jī)制仍不清楚，推測(cè)SAT1可能通過(guò)影響細(xì)胞多胺水平間接調(diào)控ALOX15的表達(dá)[42]。然而p53是否在其基礎(chǔ)活性之外激活才會(huì)對(duì)腦出血后鐵死亡產(chǎn)生影響以及p53是怎樣與ROS相互作用的還有待于進(jìn)一步考究。

4.3 NCOA4 核受體共激活因子4 (cargo receptor，NCOA4)被認(rèn)為是介導(dǎo)鐵蛋白自噬的相關(guān)蛋白。鐵蛋白可以抑制過(guò)量的胞漿鐵，從而賦予氧化應(yīng)激下的細(xì)胞保護(hù)功能。而鐵蛋白自噬是鐵儲(chǔ)存蛋白的一種自噬降解，在缺鐵期間維持體內(nèi)鐵的平衡。鐵死亡的觸發(fā)被證明是過(guò)度激活了鐵蛋白的自噬[14]，在鐵蛋白分解代謝的過(guò)程中增加了不穩(wěn)定鐵池中的鐵含量，促進(jìn)了ROS的積累，從而誘發(fā)鐵死亡；抑制NCOA4可以抑制鐵蛋白降解，從而抑制鐵死亡[43]。有研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期自噬被激活，自噬可能通過(guò)降解神經(jīng)元內(nèi)鐵蛋白，增加神經(jīng)元內(nèi)游離鐵和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，從而促進(jìn)神經(jīng)元鐵死亡，加重蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦損傷[44]。

4.4 Mevalonate pathway(甲戊二羥酸途徑) 硒元素是GPX4生物合成的元素之一，GPX4有一個(gè)硒代半胱氨酸活化位點(diǎn)(Sec)，硒元素可以通過(guò)調(diào)節(jié)GPX4的豐度和活性調(diào)控鐵死亡的發(fā)生，甲戊二羥酸途徑的抑制劑，如他汀類(lèi)藥物已被證明可以干擾Sec和細(xì)胞培養(yǎng)中GPX4的生物合成進(jìn)而影響鐵死亡的發(fā)生[45]。除此之外，在腦出血模型中研究發(fā)現(xiàn)單純的腦室硒給藥，可以增強(qiáng)GPX4的表達(dá)，抑制GPX4依賴(lài)性的鐵死亡，顯著改善腦出血大鼠的行為缺陷；全身應(yīng)用腦滲透劑硒肽也可以激活其穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞死亡，促進(jìn)出血性卒中后的功能恢復(fù)。對(duì)GPX4的詳細(xì)啟動(dòng)子分析表明，TFAP2c/Sp1是鐵依賴(lài)性刺激或硒給藥的驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子。TFAP2c/Sp1能感覺(jué)到細(xì)胞“硒”或硒代半胱氨酸的藥理學(xué)變化，含硒的半胱氨酸肽Tat-SelPep可以通過(guò)與TFAP2c/Sp1的DNA結(jié)合來(lái)增強(qiáng)GPX4等硒蛋白和轉(zhuǎn)錄程序中的含有硒的其他基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)保護(hù)腦出血后腦細(xì)胞免受鐵死亡影響，改善小鼠出血性卒中[6]。另外甲戊二羥酸途徑還可以產(chǎn)生輔酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)，CoQ10通過(guò)在細(xì)胞膜上發(fā)揮抗氧化功能而成為鐵死亡的內(nèi)源性抑制劑。

4.5 The transsulfuration pathway(轉(zhuǎn)硫途徑) 除了細(xì)胞外攝取半胱氨酸，某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞還能利用蛋氨酸作為硫供體，通過(guò)轉(zhuǎn)硫途徑，利用中間體同型半胱氨酸和胱硫醚合成新生半胱氨酸。因此繞過(guò)Systerm Xc-，所以此類(lèi)細(xì)胞可抵抗Systerm Xc-抑制所導(dǎo)致的鐵死亡。研究表明半胱氨酸-tRNA合成酶(CARS)的敲減可以防止脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成，抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，而對(duì)鐵穩(wěn)態(tài)無(wú)影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CARS的缺失可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)硫途徑，并抑制由胱氨酸缺乏引起的細(xì)胞鐵死亡[46]。由此可見(jiàn)轉(zhuǎn)硫途徑在鐵死亡的發(fā)生中也起重要作用。但目前該途徑在腦出血模型中的作用研究還很少。轉(zhuǎn)硫途徑是否在腦出血中有重要意義，以及發(fā)生條件還有待于進(jìn)一步研究。

4.6 HIF和ATF4 研究表明鐵螯合劑是通過(guò)靶向鐵依賴(lài)性酶-低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶(the hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylases，HIF)防止谷氨酸或氯化血紅素誘導(dǎo)的腦出血體外模型中神經(jīng)元鐵死亡，而不是通過(guò)抑制芬頓反應(yīng)。HIF是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor 4，ATF4)依賴(lài)的前體轉(zhuǎn)錄所必需的酶。ATF4是氧化穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在皮質(zhì)神經(jīng)元中，鐵死亡可以誘導(dǎo)ATF4，以及與細(xì)胞死亡相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄[47]。在腦出血48 h內(nèi)，ATF4在血腫周?chē)X組織神經(jīng)元中表達(dá)顯著升高，72 h達(dá)到高峰，其作為PERK通路的下游因子參與腦出血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬發(fā)生[48]。另有研究表明在原發(fā)性腦瘤(WHO III級(jí)和IV級(jí)膠質(zhì)瘤)中ATF4的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的惡性程度和神經(jīng)元損傷。而siRNA介導(dǎo)的ATF4的敲除減弱了這些膠質(zhì)瘤的惡性特征。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，ATF4可以以System Xc-依賴(lài)性的方式介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡[47]。但HIF是否催化ATF4形成參與腦出血后神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡，以及ATF4本身在腦出血后神經(jīng)元損傷中除了介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬，是否介導(dǎo)鐵死亡等問(wèn)題還有待于進(jìn)一步深入研究。

5 不足與展望

鐵死亡是最近才被描述的一種新型細(xì)胞死亡現(xiàn)象，以往關(guān)于鐵死亡的研究多數(shù)集中在腫瘤疾病、神經(jīng)退行性疾病、腦、心臟，腎臟等缺血性疾病，對(duì)于腦出血后鐵死亡的研究仍然處于初步階段。目前對(duì)于鐵死亡的研究還缺乏像細(xì)胞凋亡(如caspases家族激活)、自噬(如自噬溶酶體形成)等特異性的標(biāo)志物來(lái)反應(yīng)鐵死亡發(fā)生。同時(shí)關(guān)于它的機(jī)制和調(diào)節(jié)因素，還有很多沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，我們只是通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)腦出血中有神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡這種現(xiàn)象存在，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一些參與調(diào)節(jié)鐵死亡的通路和因子，但哪些在腦出血后神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮主要作用，是否還存在其他途徑的調(diào)控? 仍有諸多疑惑有待解決。腦出血后神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡的發(fā)現(xiàn)對(duì)于提高出血后神經(jīng)細(xì)胞存活率，改善腦出血患者預(yù)后無(wú)疑是一種福音，但如何識(shí)別鐵死亡下游信號(hào)或鐵依賴(lài)性ROS的執(zhí)行途徑，找到干預(yù)的確切靶點(diǎn)仍是后期研究的重點(diǎn)。