調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在重癥肌無(wú)力中的研究進(jìn)展

徐凱翎綜述, 張藝凡審校

重癥肌無(wú)力(Myasthenia Gravis，MG)是指主要由補(bǔ)體參與、T細(xì)胞依賴、抗體介導(dǎo)的獲得性自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為眼肌、延髓肌或四肢肌波動(dòng)性的無(wú)力或易疲勞性，除了眼肌外，通常受累肌肉是對(duì)稱的，全球年發(fā)病率約為(8～10)/100萬(wàn)人，各個(gè)年齡段在不同的誘因下均可發(fā)病[1]。以往大量研究認(rèn)為B細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上的相關(guān)受體的抗體會(huì)通過(guò)干擾正常的神經(jīng)肌肉傳遞而導(dǎo)致MG的發(fā)病。然而自身抗體的產(chǎn)生雖是由B細(xì)胞介導(dǎo)的，但是抗體的產(chǎn)生和MG的發(fā)生發(fā)展均離不開調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell,Treg)的參與。本文就Treg細(xì)胞的特性及在重癥肌無(wú)力發(fā)病過(guò)程中的數(shù)量及功能變化進(jìn)行敘述。

1 Treg

Treg這一概念最初由Gershon等人在20世紀(jì)70年代首先提出，近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)Treg具有控制病原體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)并在維持免疫自耐受性和免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。通常人體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞會(huì)分化以下幾種亞群：Th1、Th2、Th17、濾泡輔助T細(xì)胞和Treg,Th1、Th2和Th17在體內(nèi)又稱為效應(yīng)T細(xì)胞，可通過(guò)體液免疫和/或細(xì)胞免疫的方式促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，而Treg的功能受損或體內(nèi)平衡失調(diào)可能與炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)展有關(guān)，例如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ⅰ型糖尿病等[2]。

1.1 Treg的分化與發(fā)育 根據(jù)Treg的發(fā)育部位，Treg大致可分為由胸腺天然生成的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)和外周經(jīng)誘導(dǎo)生成的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(aTreg或iTreg)。來(lái)自骨髓中的淋巴干細(xì)胞在胸腺經(jīng)歷陽(yáng)性選擇及陰性選擇后發(fā)育成為CD4或CD8的單陽(yáng)性T細(xì)胞，其中的部分CD4單陽(yáng)性T細(xì)胞在接受中等強(qiáng)度T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)信號(hào)刺激分化為功能性的nTreg。nTreg在胸腺中的發(fā)育還需樹突狀細(xì)胞及髓質(zhì)和皮質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞提供的nTreg發(fā)育所必需的共刺激信號(hào)，如CD28或CD40等。外周中的CD4+T細(xì)胞在非自身抗原包括過(guò)敏原，微生物和食物等刺激及在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforing growth factor-β，TGF-β)和IL-2(Interleukin-2)參與下在胸腺外的特定位置發(fā)育成為iTreg，尤其是在胃腸道和呼吸道的粘膜表面，研究發(fā)現(xiàn)Treg約占脾臟和外周血CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%～10%[3]。

1.2 Treg的細(xì)胞分子標(biāo)志 Treg細(xì)胞表面高度表達(dá)CD4+，CD25+(也稱為IL-2Rα，即白細(xì)胞介素2受體α鏈)。轉(zhuǎn)錄因子P3(Forkhead box P3,Foxp3)的表達(dá)是Treg細(xì)胞的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3持續(xù)且穩(wěn)定的表達(dá)對(duì)于維持Treg細(xì)胞的正常分化和功能發(fā)揮關(guān)鍵作用。人類的FOXP3基因定位在X染色體的p臂上，F(xiàn)OXP3啟動(dòng)子與T細(xì)胞功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括NFAT、AP-1和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并被激活后開始轉(zhuǎn)錄。Foxp3可抑制IL-2轉(zhuǎn)錄，上調(diào)CD25和其他Treg標(biāo)記的表達(dá)，并具有抑制其它CD4+T細(xì)胞的活性。Foxp3基因突變會(huì)破壞Treg的功能并導(dǎo)致小鼠和人類的自身免疫性疾病。健康小鼠突變?yōu)镾curfy小鼠的原因?yàn)镕oxp3基因中插入了2個(gè)堿基對(duì)并表達(dá)出較短的非功能性的蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致這些小鼠的Treg無(wú)法有效抑制效應(yīng)T細(xì)胞及其分泌的相關(guān)促炎性細(xì)胞因子，因此表現(xiàn)出鱗屑、皮膚褶皺、眼睛發(fā)紅、脾臟和淋巴結(jié)腫大以及早亡的特征。人類FOXP3的基因突變可導(dǎo)致典型的致命性免疫失調(diào)、多內(nèi)分泌病、腸病和X連鎖綜合征(immunodysregulation,polyendocrinopathy,enteropathy and X-linked，IPEX)[4,5]；另一方面，體外分離Foxp3介導(dǎo)的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移可抑制炎癥T細(xì)胞的活性及功能。這些均表明調(diào)節(jié)Foxp3的表達(dá)對(duì)控制免疫反應(yīng)至關(guān)重要[6]。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員，GITR在nTreg上高度表達(dá),而在幼稚T細(xì)胞表面也可低水平表達(dá)，但在激活后其表達(dá)可上調(diào)[7]。GITR是Treg分化和擴(kuò)增的關(guān)鍵參與者，GITR激活后與其配體(GITRL)相互作用而發(fā)揮共激活信號(hào)的作用。在小鼠中的研究中支持GITR激活在Treg擴(kuò)增中的作用，在GITR基因敲除的小鼠中Treg細(xì)胞的數(shù)量較正常小鼠低，通過(guò)PCR從克隆的小鼠擴(kuò)增了Fc-GITR-L融合蛋白將其應(yīng)用于小鼠，有利于小鼠Treg細(xì)胞的增殖[8]。Foxp3+Treg表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)可負(fù)反饋調(diào)節(jié)Treg體內(nèi)平衡穩(wěn)態(tài)，用抗CTLA-4抗體可通過(guò)阻斷CTLA-4信號(hào)傳導(dǎo)可大大提高Treg增殖頻率和體內(nèi)Treg的數(shù)量[9]。但是，有研究表明表達(dá)CTLA-4的Treg細(xì)胞的百分比可能存在個(gè)體和組織的差異。例如，一些研究報(bào)告表明健康成人和新生兒中約50%～90%的Foxp3+Treg表達(dá)CTLA-4;然而，在其他研究報(bào)道中，大約23%的外周血Foxp3+Treg表達(dá)CTLA-4。此外，在直腸粘膜組織活檢中，大約50%的Foxp3+Treg表達(dá)CTLA-4[10]。Treg細(xì)胞還表達(dá)低水平的CD127(IL-7受體α鏈)，但CD127與Foxp3的表達(dá)成反比。由于活化效應(yīng)T細(xì)胞也表達(dá)CD127，使得該標(biāo)記的利用受到限制[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)在健康個(gè)體中大約4%～17%的外周血和直腸粘膜的Treg表達(dá)程序性死亡-1(Programmed death-1，PD-1)[12]。此外有助于描述Treg細(xì)胞亞群的分子還包括CD39、CD95、OX40,但上述分子在Treg上的作用有待進(jìn)一步研究。

1.3 Treg亞群 最近的幾項(xiàng)研究表明，人類Treg細(xì)胞具有功能和表型多樣性,基于Foxp3和白細(xì)胞抗原亞型RA(CD45RA)表達(dá)不同，Treg細(xì)胞可分為以下3種亞群:CD25+CD45RA+Foxp3lo靜止Treg細(xì)胞(rTregs)，CD25hiCD45RA-Foxp3hi活化的Treg細(xì)胞(aTregs)和分泌細(xì)胞因子的非抑制性非Treg細(xì)胞CD25+CD45RA-Foxp3lo，前兩者在體外均具有抑制作用。需要注意的是，靜止的和活化的Treg代表相同細(xì)胞的兩個(gè)發(fā)育階段，rTregs在相關(guān)刺激下可活化為aTregs[13]。

1.4 Treg介導(dǎo)的免疫抑制機(jī)制

1.4.1 分泌抑制性細(xì)胞因子 Treg可通過(guò)分泌具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子如IL-10、IL-35和TGF-β發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。IL-10是Treg細(xì)胞分泌的大小為18 kDa的蛋白，廣泛作用于效應(yīng)T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用[14]。在大鼠中已觀察到IL-10通過(guò)結(jié)合樹突狀細(xì)胞中IL-10受體從而激活JAK1-TYK2-STAT3途徑以降低MHC-Ⅱ類分子，CD80或CD86，CD11b/c等分子的表達(dá)達(dá)到抑制樹突狀細(xì)胞成熟的功能。此外，IL-10可抑制Th1細(xì)胞炎性細(xì)胞因子(如IL-12、INF-γ、IL-1β、IL-6，TNF-α)的分泌，它也促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性增加了炎癥部位細(xì)胞碎片的清除[15]。IL-35是IL-12家族中的異二聚體細(xì)胞因子，由p35和EBI3亞基組成。IL-35具有兩個(gè)已知功能：(1)抑制輔助T細(xì)胞的增殖;(2)促進(jìn)幼稚T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞。最近，這種細(xì)胞因子被證明具有誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞向B調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力[16]。TGF-β是一個(gè)25 kDa的蛋白質(zhì)和一種多功能細(xì)胞因子，目前已經(jīng)提出了4種主要作用機(jī)制：(1)抑制效應(yīng)T細(xì)胞的分化；(2)促進(jìn)幼稚T細(xì)胞分化為Treg或Th17細(xì)胞；(3)抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖；(4)抑制巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性[17]。

1.4.2 溶細(xì)胞抑制 Treg細(xì)胞可產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶稱為顆粒酶B。當(dāng)Treg 直接與效應(yīng)細(xì)胞接觸時(shí)，可通過(guò)胞吞的作用釋放富含穿孔素和顆粒酶B的顆粒，穿孔素將自身插入靶細(xì)胞的脂質(zhì)膜中，并在鈣離子存在的情況下聚合形成跨膜圓柱體，每個(gè)圓柱體形成一個(gè)孔，顆粒酶B可通過(guò)該孔進(jìn)入細(xì)胞，一旦進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，粒酶B通過(guò)胱天蛋白酶依賴的或獨(dú)立的機(jī)制誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[18]。

1.4.3 代謝破壞抑制 Treg可通過(guò)增加效應(yīng)T細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平，從而控制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生。Treg介導(dǎo)cAMP的抑制主要通過(guò)兩種機(jī)制：(1)Treg介導(dǎo)的cAMP通過(guò)間隙連接流入靶細(xì)胞;(2)存在于Treg表面上的外切核酸CD39和CD73將三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為腺苷。此后，腺苷再與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合，導(dǎo)致這些靶細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高[19]。

1.4.4 通過(guò)下調(diào)CD80和CD86的水平來(lái)抑制樹突狀細(xì)胞的成熟或功能 樹突狀細(xì)胞通過(guò)識(shí)別、獲取、加工和呈遞外源抗原和自身抗原，以啟動(dòng)T細(xì)胞活化。樹突狀細(xì)胞表面存在CD80/86,與共刺激信號(hào)CD28結(jié)合后促進(jìn)DC的成熟及抗原提呈能力。Treg細(xì)胞高水平表達(dá)CTLA-4，Qureshi等表明，CTLA-4可以通過(guò)胞吞作用從樹突狀細(xì)胞捕獲配體CD80和CD86，這些配體進(jìn)入Treg細(xì)胞后進(jìn)行降解從而導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞表面的CD80/86下調(diào)[20]。

2 Treg與MG

2.1 Treg和EAMG的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(EAMG)是通過(guò)相關(guān)抗原免疫動(dòng)物而建立的適用于研究重癥肌無(wú)力的臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。Gertel等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)與單純用磷酸鹽緩沖液和完全弗氏佐劑免疫的健康對(duì)照組大鼠相比，EAMG大鼠的脾臟和外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量減少及抑制效應(yīng)T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖能力降低。此外，這項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)來(lái)自EAMG大鼠的Treg細(xì)胞具有更明顯的凋亡程度[21]。Aricha等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)離體產(chǎn)生的源自健康供體的外源性Treg細(xì)胞抑制了EAMG的發(fā)生發(fā)展，還可以使體液中乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)的特異性反應(yīng)下調(diào)[22]。此后，另有研究表明從EAMG大鼠自身離體擴(kuò)增功能性Treg細(xì)胞，向EAMG大鼠重新給予上述擴(kuò)增的自體功能性Treg細(xì)胞也可抑制EAMG的進(jìn)展[23]。這些研究高度提示EAMG的Treg細(xì)胞的數(shù)量減少及活性降低。

2.2 Treg和MG患者的關(guān)系 Balandina等學(xué)者及WenHua等學(xué)者分別在2005年和2017年均通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)MG患者的CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量較健康對(duì)照組未見明顯下降，但其調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)嚴(yán)重的缺陷，同時(shí)對(duì)T細(xì)胞調(diào)節(jié)功能至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)下降[24]。有學(xué)者采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MG患者和健康對(duì)照者的外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MG患者和健康對(duì)照組之間的CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分比雖無(wú)明顯差異，但癥狀控制不佳的MG患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分比癥狀較穩(wěn)定的MG患者低，這表明CD4+CD25+Treg可能與MG的疾病穩(wěn)定性有關(guān)[25]。濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞主要功能是輔助B細(xì)胞增殖和促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。卵泡調(diào)節(jié)性T(Tfr)細(xì)胞定義為位于生發(fā)中心的Treg的一個(gè)子集，Tfr細(xì)胞可以抑制生發(fā)中心B細(xì)胞和Tfh細(xì)胞的增殖，因此，Tfr與Tfh細(xì)胞在體內(nèi)免疫方面具有相互拮抗的功能，Yanbin等學(xué)者研究觀察到與健康對(duì)照組和經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的MG患者相比，未經(jīng)治療的MG患者Tfr/Tfh細(xì)胞比率降低，此外還觀察到經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療的MG患者的循環(huán)Treg和Tfr樣細(xì)胞的頻率增加，而循環(huán)Tfh樣細(xì)胞的頻率減少[26]。Kohler等發(fā)現(xiàn)胸腺瘤相關(guān)性MG患者的胸腺瘤組織中可以觀察到較低數(shù)量的Treg[27]。Thiruppathi等學(xué)者通過(guò)體外增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)健康受試者的Treg可以更有效地抑制效應(yīng)T細(xì)胞，而MG患者的Treg抑制效應(yīng)T細(xì)胞的能力降低，此外他們還通過(guò)RT-PCR測(cè)定了Foxp3的信使RNA(mRNA)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MG患者的CD4+CD25+Treg細(xì)胞中FOXP3 mRNA水平與健康對(duì)照組相比也顯著降低[28]。上述研究表明MG患者體內(nèi)功能性Treg數(shù)量減少，或者是表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞的數(shù)量減少可能是MG的發(fā)病機(jī)制之一。

2.3 Treg與MG的治療 目前有研究發(fā)現(xiàn)將GM-CSF治療EAMG小鼠可延緩EAMG疾病的進(jìn)展，同時(shí)觀察到小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量增多及FOXP3的表達(dá)增加[29]。Bhattacharya等發(fā)現(xiàn)GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞因子依賴和接觸依賴性機(jī)制擴(kuò)增nTreg并誘導(dǎo)iTreg[30]。在臨床上Rowin等學(xué)者將GM-CSF運(yùn)用于一位難治性肌無(wú)力危象的患者，觀察到該患者臨床癥狀改善，Treg細(xì)胞循環(huán)數(shù)量的增加以及Treg中Foxp3表達(dá)水平增加[31]。有研究發(fā)現(xiàn)GM-CSF治療可通過(guò)增殖Treg以抑制慢性移植物抗宿主病[32]。此外另有研究發(fā)現(xiàn)低劑量的GM-CSF治療可以預(yù)防實(shí)驗(yàn)性Ⅰ型糖尿病和自身免疫性甲狀腺炎等自身免疫性疾病的發(fā)展[33]。近年來(lái)，維生素D(VitD)已被證明與自身免疫疾病有關(guān)，例如多發(fā)性硬化癥和牛皮癬等。Kang等發(fā)現(xiàn)MG患者與健康對(duì)照組相比，MG的血清VitD水平較低[34]。其作用機(jī)制可能為：(1)Treg表達(dá)VitD受體，在健康個(gè)體體外可誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg，促進(jìn)Foxp3的表達(dá)及增加IL-10分泌細(xì)胞的數(shù)量[35]；(2)VitD3在抗原提呈水平可能對(duì)Treg具有誘導(dǎo)作用[36]。此外有研究報(bào)道大劑量VitD治療MG患者可誘導(dǎo)疾病緩解[37]，但需要進(jìn)一步的研究假設(shè)及補(bǔ)充維生素D的長(zhǎng)期安全有效數(shù)據(jù)。越來(lái)越多的證據(jù)表明改變腸道微生物的組成可影響免疫系統(tǒng)的活化并驅(qū)動(dòng)促炎和抗炎反應(yīng)促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)展。Alessandra和Elena等發(fā)現(xiàn)口服益生菌(包括雙歧桿菌和乳酸桿菌)可有效調(diào)節(jié)EAMG和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性脊髓炎疾病，其潛在機(jī)制可能為升高外周血Treg細(xì)胞的百分比和血清中TGF-β，促進(jìn)未成熟的樹突狀細(xì)胞向免疫調(diào)節(jié)表型成熟[38]。因此，益生菌誘導(dǎo)Foxp3+Treg似乎可用于治療包括MG在內(nèi)的自身免疫性疾病。雷帕霉素是一種臨床上用于治療自身免疫和移植排斥的免疫抑制藥物，有研究表明雷帕霉素可通過(guò)抑制Th17細(xì)胞的糖酵解及促進(jìn)Treg細(xì)胞的脂肪酸氧化以 降低Th17細(xì)胞和增加Treg細(xì)胞在體內(nèi)的比例。另有研究表明雷帕霉素可通過(guò)上調(diào)自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型的TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)減輕炎癥反應(yīng)。這些信號(hào)通路可以為MG治療中Treg的控制提供新的靶分子。

3 展 望

隨著對(duì)Treg細(xì)胞的研究日趨深入，包括它的發(fā)育分化、表面分子標(biāo)志、分群、在各種自身免疫性疾病的進(jìn)展及治療的應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)其與MG的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但仍然還有許多深層次的問(wèn)題需要更多研究加以闡明。首先，除了Foxp3外還需要探索Treg更為特異性的表面標(biāo)志物及其在Treg上的具體作用機(jī)制；其次，對(duì)于通過(guò)增加Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能在臨床上對(duì)于MG的治療還存在很多爭(zhēng)議并缺乏長(zhǎng)期安全有效的數(shù)據(jù)，需進(jìn)一步開展相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)研究Treg對(duì)于MG治療的可行性及發(fā)揮Treg免疫調(diào)節(jié)作用所需的條件。因此，這些問(wèn)題的解決對(duì)于MG的治療具有重要意義。