非編碼RNA：支架內(nèi)再狹窄治療策略的新靶點

楊雙亞 綜述 鄧文文，石蓓 審校遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563000

冠心病嚴(yán)重危害人類的健康，是全球范圍內(nèi)致死和致殘的主要原因之一。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療是臨床上冠心病最常見的治療方法。但同時，也帶來了一系列的問題，比如血管損傷、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)過度增殖以及新生內(nèi)膜形成。導(dǎo)致術(shù)后血管愈合延遲、管腔狹窄及支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)，最終引起術(shù)后患者死亡率增加[1-2]。ISR 在時間上可分為兩個階段：早期階段和后期階段。在早期(幾天到幾周)階段，植入支架會引起動脈壁機械損傷、內(nèi)皮破裂和功能障礙。隨后導(dǎo)致血栓形成、纖維蛋白和血小板聚集及炎癥反應(yīng)。在晚期(幾周到幾個月)階段，VSMC高度分化，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，細(xì)胞增殖和遷移能力增強，導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生和ISR[3]。

目前臨床上應(yīng)用最多的是植入裸金屬支架(bare metal stent，BMS)和藥物洗脫支架(drug eluting stents，DES)。研究表明，BMS 可以防止血管彈性回縮，可用于治療由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄，但同時它也誘導(dǎo)VSMC 過度增殖，導(dǎo)致新內(nèi)膜增生和再狹窄。DES是一種聚合物支架，不僅可以將藥物輸送到局部特定的受損區(qū)域，還避免了全身毒性。與BMS 相比，攜帶抗增殖藥物涂層的DES 雖然可以顯著降低ISR，但同時它也抑制了受損血管愈合，導(dǎo)致愈合延遲，引起晚期支架內(nèi)血栓形成發(fā)生率上升[4]。

大量研究表明，非編碼RNA (noncoding RNA，ncRNA)廣泛參與激活或調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝和免疫反應(yīng)。在支架內(nèi)再狹窄過程中，ncRNA表達(dá)失調(diào)，而特定的ncRNA 靶向作用于受損血管區(qū)域，通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜形成，可以減少支架植入造成的血管損傷。本綜述主要討論在支架內(nèi)再狹窄過程中，ncRNA 對VSMC 增殖和遷移及EC 功能的調(diào)控作用。

1 非編碼RNA和再狹窄

非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。按照非編碼RNA 片段的長度，可將它們分為兩大類，即短非編碼RNA 和長非編碼RNA。短非編碼RNA 包括microRNAs、小干擾RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、piwi 相互作用RNA(piRNA)和轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)。長非編碼RNA 包括核糖體RNA(rRNA)、天然反義轉(zhuǎn)錄本和長鏈非編碼RNA (lncRNA)等。

1.1 MicroRNA 和再狹窄 微小RNA(miRNA)是長度為18~25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子。能夠識別特定的靶基因mRNA，并在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及炎癥及免疫應(yīng)答等。microRNA在調(diào)節(jié)心臟及血管功能中起重要作用，同時，miRNA 也在調(diào)節(jié)EC和VSMC的細(xì)胞通訊中起到重要作用。

1.1.1 miRNA 調(diào)節(jié)VSMC 功能 PCI 術(shù)后再狹窄主要的病理變化是VSMC 的增殖、遷移和分化。VSMC 從收縮表型轉(zhuǎn)換為合成表型，遷移至內(nèi)膜，導(dǎo)致內(nèi)膜增生和血管狹窄[5]。許多miRNA 在調(diào)節(jié)VSMC 功能中起著至關(guān)重要的作用。在血管重塑及新生內(nèi)膜形成過程中，VSMC收縮表型會轉(zhuǎn)化為合成表型。miRNA-143/-145在VSMC中高表達(dá)，可通過沉默轉(zhuǎn)錄因子Elk4和Klf4抑制VSMCs遷移，促進(jìn)VSMCs分化，維持VSMC的收縮表型[6]。此外，miR-145還可以通過直接抑制轉(zhuǎn)錄因子KLF5，抑制血管損傷后VSMCs增殖和新生內(nèi)膜形成[7]。當(dāng)VSMCs從收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型時，VSMCs收縮表型的標(biāo)志物平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，ACTA2)和肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MYH11)表達(dá)減少[8-9]。上調(diào)VSMCs 中的miR-125a-5p 后，VSMCs 收縮表型的標(biāo)志物ACTA2、MYH11 表達(dá)增多[10]。除此之外，miR-125a-5p 可以抑制E26原癌基因1(E26 oncogene homologue 1，ETS-1)的表達(dá)。EST-1 是VSMC 增殖和遷移的標(biāo)志物，可以促進(jìn)血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)介導(dǎo)的VSMC 表型轉(zhuǎn)換。在受損血管中，miR-125a-5p表達(dá)下調(diào)，EST-1表達(dá)上調(diào)，VSMC從收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型[11]。MiR-23b也可以調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換。血管損傷后，MiR-23b表達(dá)下調(diào)[12]。其作用機制是通過直接靶向尿激酶(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、Smad 3 (Smad family member 3，SMAD3)和FOXO4 (forkhead box O4，F(xiàn)OXO4)，促進(jìn)VSMC 標(biāo)志物ACTA2 和MYH11 蛋白的表達(dá)[13-14]，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增生。同時，還有許多miRNA 可以通過靶向信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)VSMC 的功能與表型轉(zhuǎn)化。如miR-663 的表達(dá)上調(diào)后，促進(jìn)VSMC 分化，抑制PDGF 誘導(dǎo)的VSMC 的增殖和遷移[15]。miR-195前體則通過抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子Cdc42，減輕炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖[16]。除此之外，miR-125b、miR-130a、miR-146a 和miR-210 也被報道可調(diào)節(jié)VSMC功能[17]。送檢ISR患者的血液進(jìn)行基因測序后發(fā)現(xiàn)，miR-100、miR-143 和miR-145 水平表達(dá)下調(diào)，而miR-21顯著上調(diào)。綜上，miRNA可靶向作用于與VSMC 功能相關(guān)的不同分子及通路。miRNA 在支架內(nèi)再狹窄的靶向治療及作為早期標(biāo)志物方面具有巨大前景。

1.1.2 miRNA 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能 在支架內(nèi)再狹窄、局部再缺血和晚期血栓形成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)[18-19]。目前，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)已被廣泛用于各種支架涂層中，提高損傷后血管的愈合能力，且在臨床實驗中取得一定成效[20]。內(nèi)皮細(xì)胞對破裂區(qū)域的不完全覆蓋是晚期血栓形成的主要原因之一[18]。因此如何盡早地實現(xiàn)再內(nèi)皮化成為一大熱點及難點。目前研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA 可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，這些miRNA 被認(rèn)為是支架內(nèi)血栓形成潛在的治療靶點[21]。MiR-126 由內(nèi)皮細(xì)胞表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7(EC-specific gene epidermal growth factor-like domain 7，Egfl7)編碼，其在動脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)上調(diào)，參與血管的形成。MiR-126 通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[22-23]。miR-17-92通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad3和BMP/BMPR2信號通路，促進(jìn)VSMC 增殖及再內(nèi)皮化。miR-92a 表達(dá)上調(diào)后，使抗動脈粥樣硬化Krtippel 轉(zhuǎn)錄因子2 (anti-atherosclerotic Krtippel transcription factor 2，KLF2)表達(dá)下調(diào)。同時，miR-92a 可以下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達(dá)，從而加速支架植入后的內(nèi)皮再生[24-25]。研究表明miR-221 和miR-222 促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、血管內(nèi)膜新生和再狹窄。同時可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及存活。學(xué)者們認(rèn)為miR-221/222 在VSMC 和EC中的不同效應(yīng)可能有利于支架術(shù)后血栓形成和再狹窄的治療[26-27]。

1.2 LncRNA 和再狹窄 長非編碼RNA (LncRNA)是長度超過200 nt 的非編碼RNA，人類基因組中存在超過10 000 個lncRNA。最初，lncRNA 被認(rèn)為是無用的RNA。最近有證據(jù)表明，lncRNAs在許多生理學(xué)和生理學(xué)中起著關(guān)鍵作用病理過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、炎癥和心血管疾病[28]。

1.2.1 LncRNA調(diào)節(jié)VSMC功能 血管中富含的lncRNA SENCR通過調(diào)控收縮蛋白調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的分化和遷移[29]。敲除lncRNA SENCR 后，血管新生相關(guān)因子midkin 上調(diào)，促進(jìn)VSMCs 發(fā)生早期表型轉(zhuǎn)化。同時，lncRNA SENCR還可以促進(jìn)ECs增殖、遷移和血管生成。LncRNA-H19在動脈粥樣硬化后新生內(nèi)膜中高表達(dá)。磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)可抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)減少內(nèi)膜增生[30]。研究表明，LncRNA-H19靶向抑制PTEN 調(diào)控miR-675 促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖[31]。SMILR是一種血管平滑肌細(xì)胞中特有的lncRNA，通過特異性靶向透明質(zhì)酸合酶2(HAS2)促進(jìn)VSMCs增殖[32]。血小板來源生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和白介素處理的VSMCs中SMILR表達(dá)上調(diào)促進(jìn)VSMC 增殖。內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)VSMCs中miR-221和miR-222表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)VSMC 增殖、遷移及炎癥反應(yīng)[33]。Lnc-Ang362是這兩種促進(jìn)VSMC增殖的miRNA的宿主基因，可以促進(jìn)VSMCs增殖及新生內(nèi)膜形成。染色體9p21是疾病相關(guān)基因多態(tài)性的重要區(qū)域，它與全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association studies，GWAS)心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)息息相關(guān)[34-35]。LncRNAANRIL是編碼染色體9p21區(qū)域的長鏈非編碼RNA，是冠狀動脈疾病的易感遺傳位點[36]。研究表明，LncRNAANRIL在VSMCs和ECs中均高表達(dá)，通過介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN2A/B 促進(jìn)VSMCs 增殖和表型轉(zhuǎn)化[37-38]，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能[39]。因此，這項研究表明，上調(diào)ANRIL 的表達(dá)可能會降低再狹窄率。

1.2.2 LncRNA調(diào)節(jié)EC功能 P53是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子，研究表明lncRNA-p21是P53的靶基因，lncRNA-p21 與E3 泛素蛋白連接酶小鼠雙分2 蛋白(mouse double minute 2，MDM2)直接結(jié)合后，促進(jìn)p53與P300結(jié)合，進(jìn)而增強p53轉(zhuǎn)錄活性，抑制EC增殖[40]。此外，在ECs中，LincRNA-p21還可以通過海綿樣吸附miR-130b 后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期[41]。LncRNA MALAT1 在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，與內(nèi)皮細(xì)胞功能、炎癥反應(yīng)和血管生成相關(guān)。在人內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC)中，F(xiàn)OXM1是調(diào)控真核細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄因子，而MALAT1 通過抑制FOXM1表達(dá)，同時與miR-320a相互作用，最終抑制細(xì)胞增殖[42-43]。炎癥反應(yīng)引起的內(nèi)皮損傷是支架再狹窄發(fā)生發(fā)展不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。LncRNA ENST00000509256 調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)和神經(jīng)活性配體受體[5]，因此，ENST00000509256可能在內(nèi)皮激活后參與炎癥反應(yīng)。研究表明，lncRNA punisher能影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管再生，但是目前具體機制仍不清楚[44]。

1.3 其他ncRNAs

1.3.1 小干擾RNA 小干擾RNA(siRNA)是長度20~25 個核苷酸的雙鏈RNA，通過與mRNA 的結(jié)合，抑制特定mRNA的翻譯及蛋白表達(dá)。盡管哺乳動物中siRNA 含量少，但是通過各種轉(zhuǎn)染技術(shù)，它們可以特定、有針對性地去沉默基因。因此，siRNA是研究基因的重要工具和藥物靶標(biāo)。最新研究表明，它也是再狹窄的治療策略之一。整合素在細(xì)胞黏附和遷移中起著至關(guān)重要的作用，而Kindlin-2是參與整合素聚集和激活的關(guān)鍵成分[45]。因此，通過調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白，可以抑制VSMC活化和遷移[46]。使用siRNA特異性抑制Kindlin-2 后，有效地阻斷了Wnt 信號傳導(dǎo)，從而抑制VSMC 的增殖和遷移[47]?；|(zhì)相互作用分子1(STIM1)有助于生長因子誘導(dǎo)的VSMC增殖，然而，在使用siRNA抑制STIM1后，人心臟血管平滑肌增殖能力下降。此外，特異性抑制STIM1 的小干擾RNA 還可以抑制頸動脈血管成形術(shù)動物模型的再狹窄[48]。ZHANG 等[49]通過植入si TGF-β1基因支架后，有效地減少了兔髂動脈內(nèi)膜損傷后內(nèi)膜增生，顯著降低支架植入后的再狹窄率。這說明，siRNA 在支架植入術(shù)后具有預(yù)防再狹窄的潛在治療效果。

1.3.2 環(huán)狀RNA 環(huán)狀RNA(cirRNA)富含miRNA結(jié)合位點，可海綿樣吸附miRNA并抑制其表達(dá)，促進(jìn)靶基因mRNA 的翻譯[50]。circRNA 可作為診斷標(biāo)志物并參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，例如circ-0083357、circ-0082824、circ-0068942、circ-0057576、circ-0054537、circ-0051172、circ-0032970 和circ-0006323 通過促進(jìn)TRPM3 表達(dá)，抑制冠狀動脈疾病患者的hsa-mir-130a-3p 表達(dá)[51]。內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的cirRNA CZNF609[52]，海綿樣吸附miR-615-5p 后抑制其活性，當(dāng)沉默cZNF609 后，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[53]。此外，cirRNA-HRCR，作為一種內(nèi)源性miR-223海綿，能夠調(diào)節(jié)心力衰竭[54]。

1.3.3 piRNA Piwi相互作用RNA(piRNA)是長度約30 nt 的小RNA，主要存在于哺乳動物的生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中，通過與Piwi亞家族蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物(piRC)來調(diào)節(jié)基因沉默途徑[55]。然而，關(guān)于piRNA的研究仍處于初步階段，很少有報道其在動脈粥樣硬化和再狹窄中的作用。

2 小結(jié)

冠狀動脈支架植入是目前治療冠心病最主要的方法。然而，冠心病患者支架植入后20%~30%發(fā)生再狹窄。藥物洗脫球囊及生物可吸收支架里程碑式的出現(xiàn)，將再狹窄率降低到10%以內(nèi)，但其仍然存在著愈合延遲、遲發(fā)性支架內(nèi)血栓形成等缺點?；诖?，需要一個更為完善的治療策略以預(yù)防支架內(nèi)狹窄?；蛑Ъ苁墙鼛啄曛Ъ芗夹g(shù)的一大突破，它可以減輕支架植入后相關(guān)的血管問題。基因支架不僅含有抗炎和抗血栓藥物，同時攜帶miRNA 和siRNA 等ncRNA。通過使用涂有ncRNA的支架，可以調(diào)控血管易狹窄區(qū)域基因的表達(dá)，預(yù)防晚期血栓形成。目前，ncRNA支架仍處于探索階段，對于其在心血管疾病中發(fā)揮作用的理解仍然有限。在ncRNA 支架應(yīng)用于臨床前，必須弄清楚這幾個問題，例如，非編碼RNA是如何發(fā)揮他們的作用的？它們是否會對附近的基因產(chǎn)生負(fù)面影響？因此，盡管大量的動物模型以及一期臨床試驗已經(jīng)表明了其作為治療冠心病支架內(nèi)再狹窄的優(yōu)越性及有效性，但距離真正應(yīng)用于臨床，仍然還有很長的路要走。