二代測序技術(shù)在實體腫瘤診療中的應用進展

翚 纓 曾 灝

廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院檢驗科，廣西貴港 537100

在臨床上，惡性腫瘤具有細胞分化、轉(zhuǎn)移、增殖等功能，發(fā)病機制十分復雜，可以劃分為致癌、促癌和癌細胞演進這三個不同的環(huán)節(jié)[1]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)水平的不斷進步，二代測序技術(shù)作為一種大規(guī)模的平行測序技術(shù)，逐漸應用于臨床實體腫瘤的診療中，可以更好地分析腫瘤的發(fā)病機制、分子分型以及預后等各方面的信息，為臨床腫瘤的診療工作帶來了進一步的突破[2]。二代測序技術(shù)在腫瘤診療的過程中，可以通過信號通路和突變基因的技術(shù)應用，來識別實體腫瘤中的特異突變現(xiàn)象。目前，二代測序技術(shù)在實體腫瘤診療中的應用，明顯促進了分子生物學的發(fā)展歷程，并且也可以讓臨床醫(yī)學者在研究基因組的測序問題中，以低成本獲得高效率，在我國實體腫瘤的臨床實踐工作中，具有積極的促進作用。本研究將結(jié)合一些典型研究對二代測序技術(shù)在實體腫瘤診療中的應用進行如下綜述。

1 二代測序技術(shù)簡介

近年來，在人類基因研究的課題中，我們對于遺傳信息的掌握越來越清晰；與此同時，隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，基因檢測技術(shù)的水平也得到提升，逐漸呈現(xiàn)出了規(guī)?；?、工業(yè)化、專業(yè)化的特點。在第一代測序技術(shù)中，即Sanger 測序，雖其是基因檢測的金標準，讀長較長、精準，但由于其成本較高、通量低，限制了其在各個領(lǐng)域中的應用都存在部分缺陷[3]。而后經(jīng)過技術(shù)人員的深入研發(fā)，在第一代測序技術(shù)中衍生了二代測序技術(shù)，與上一代測序技術(shù)相比，二代測序技術(shù)的范圍重點在于基因組重測序、目標區(qū)域測序以及全外顯子組測序，同時具有成本逐漸降低、通量高的優(yōu)點，可以以高通量的輸入來篩選多種基因，改變篩選基因的靈敏度。此外，二代技術(shù)還可以對大量的平行基因進行測序，在臨床應用過程中，可以更好地探究實體腫瘤的變異性，為腫瘤的診療工作提供數(shù)據(jù)信息的支持?？偟膩碚f，二代測序技術(shù)對實體腫瘤的檢測結(jié)果與一代相比差異并不明顯，但是卻具有檢驗通量、時間和篩選方面的優(yōu)勢，并且可以避免機體侵入性檢查，能達到早期診斷、及時治療的目的，同時在耐藥性和療效方面還具有明顯的監(jiān)測效果。

2 二代測序技術(shù)在實體腫瘤中的應用

近年來，二代測序技術(shù)在各個領(lǐng)域中的應用都十分廣泛，特別是在腫瘤基因組學的研究中發(fā)揮了巨大的作用，用于突變基因、信號通路的探索以及識別特異性突變[3]。同時，二代測序技術(shù)還可以研究腫瘤質(zhì)變的發(fā)展機制，有利于臨床診療的實施，進一步推進了我國醫(yī)學水平的進步。特別是在實體腫瘤的樣品檢測中，二代測序技術(shù)能夠了解機體病變組織的基因改變機制，并為臨床診療提供參考方向，有利于隨時調(diào)整用藥和靶向治療方案，達到理想的治療效果。在此，下文重點論述二代測序技術(shù)在實體腫瘤中的應用，并簡單分析二代測序技術(shù)在臨床應用的優(yōu)點。

2.1 遺傳性乳腺癌（HBC）

乳腺癌的發(fā)病率位居我國女性惡性腫瘤的首位，尤其是以浸潤性導管癌為主。浸潤性導管癌是一種具有高度特異性質(zhì)的疾病，在基因譜、生物特性以及診療方向中都存在一定的研究難度，因此在臨床上需要加強對此類患者腫瘤分期、病情診治方面的研究力度，更好地用于診斷治療以及預后評估中。在二代測序技術(shù)的應用中，基因表達譜不僅可以清楚了解患者的腫瘤分期情況和基因表達特性，同時還可以加深臨床對病理組織細胞調(diào)節(jié)情況的認識，進一步強調(diào)腫瘤組織中的生物學特性。有研究表明[4]，乳腺癌的發(fā)病因素與體細胞突變有關(guān)，這為臨床乳腺癌的診治工作提出了重要方向。在此條件下，可以通過對腫瘤細胞突變譜展開研究，明確乳腺癌的發(fā)展機制以及細胞分子的變化情況。Bennett 等[5]分別對三陰性乳腺癌患者予以RNA 測序和DNA 測序；Ellis 等[6]對所選的乳腺癌患者進行DNA 測序，均研究NGS 應用于體細胞突變譜的檢測效果。其中部分患者行全基因組測序，其余患者行外顯子組測序，兩組結(jié)果均提示，二代測序技術(shù)可以綜合基因組的發(fā)展情況，分析乳腺癌細胞分化、突變和轉(zhuǎn)移方面的特征，促進了臨床乳腺癌基因研究的進展。

HBC 在臨床上大多是由BRCA1 和BRCA2 突變引起的，兩者的基因編碼腫瘤可以抑制機體的蛋白生長、分化，造成DNA 修復功能受損，同時還對細胞周期的變異、基因轉(zhuǎn)歸、基因穩(wěn)定方面起到關(guān)鍵作用。細胞組織突變會增加HBC 的發(fā)病風險，針對此類現(xiàn)象，臨床應加強對家族史患者的篩查和測試。傳統(tǒng)的DNA 測序具有檢測時間長、費用較高等缺點，而采取二代測序技術(shù)則可以達到低成本、高效率的效果，改善了傳統(tǒng)測序檢測方法的局限性，也能夠合理應用于臨床的常規(guī)診斷中。

2.2 胃癌（SC）

SC 是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變，SC 在臨床上的發(fā)病率逐漸上升。而近年來，有研究表明[7]，SC 的發(fā)病機制與基因因素的改變存在密切關(guān)系，其中包括基因突變、基因表達異常以及基因遺傳變異等。在二代測序技術(shù)中，可以通過對SC 組織的腫瘤分子標志物進行檢測，提取RNA 或者DNA 以獲得機體的基因信息，從而了解SC 患者發(fā)病進程、用藥等方面的問題；同時可以通過基因表達鑒別不同個體中的表達特點，更有利于預后，實現(xiàn)SC 轉(zhuǎn)歸向好，篩選出與基因表達異常的靶基因，剖析臨床診療方案的調(diào)控機制。Lim SM 等[8]對早期SC 患者的癌旁組織進行二代測序，研究機體基因表達水平的差異以及結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示，在早期SC 患者的病理標本組織中，存在1602 個基因上調(diào)以及695 個基因下調(diào)；30% ～40% 的SC 患者還存在融合基因LRP5-LITAF，這提示早期SC 患者的基因表達異常多與腫瘤期數(shù)、侵入和擴散程度有關(guān)。其次，有學者[9]指出miRNAs 在實體腫瘤的病程演變中，也起到了至關(guān)重要的提示作用，在臨床診療方面也具有較大的潛力，同時還參與了SC 形成的多樣通路信號。Lin PH 等[10]在FFPE 標本中應用二代測序技術(shù)，分析其生物學信息，研究組織標本的RNA 降解、片段化程度。結(jié)果顯示，在新鮮冰凍的標本中提取RNA 具有完整保存的效果，而從石蠟中提取RNA，則會出現(xiàn)程度不同的降解現(xiàn)象，同時28S 和18S 的波峰相對來說表達并不明顯；miRNAs 的表達譜在新鮮冰凍標本中，相關(guān)系數(shù)為0.91，而在FFPE 標本中則為0.85，均提示FFPE 標本中的miRNAs 保存度更為完整，且可以通過二代測序技術(shù)進行SC病理組織的檢測。二代測序技術(shù)規(guī)模性和專業(yè)性較強，在SC 組織中的檢測可以準確描述細胞轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)情況，并提示基因表達和結(jié)構(gòu)變化的特征，揭示了腫瘤分子的分型。

2.3 肝癌（HCC）

HCC 是外科中常見的惡性腫瘤之一，目前臨床上對于肝臟惡性腫瘤的發(fā)病機制仍在研究中，大多數(shù)學者普遍認為其病因是多因素、多復雜的演變過程，但主要是受到飲食因素和環(huán)境因素的影響所致。目前，臨床上用于HCC 診斷的種類較多，傳統(tǒng)的檢測方法包括CT、核磁共振、超聲等，同時仍需要采取腫瘤標態(tài)物檢測，在檢測過程中對于腫瘤的體積有一定的要求，因而存在漏檢率較高的不足之處。而二代測序技術(shù)在肝癌的早期篩查中早已有著廣泛的應用，研究表明[11]，許多癌基因的分化發(fā)展與肝癌的易感性存在密切的關(guān)聯(lián)性。Stephens等[12] 在HCC 多個基因突變和發(fā)病機制研究中，發(fā)現(xiàn)許多癌基因與HCC 易感性關(guān)聯(lián)密切，進一步提出HCC 并不是單基因突變的惡性腫瘤這一概念，并且將腫瘤組織的基因作為篩查重點，對早期HCC患者進行血液檢測，提取其DNA 文庫，通過二次測序技術(shù)檢測患者血液中是否存在肝癌相關(guān)的基因樣本，即CtDNA。這提示二次測序可以用于HCC的早期診斷中，篩查率較高，確診率不斷向100%的方向靠近，同時還能依據(jù)檢測出現(xiàn)的靶點予以治療方案的指導，在研究靶點藥敏性中也具有明顯優(yōu)勢和成效。

2.4 肺癌（LC）

在臨床上，LC 是發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤。在2019 年，英國有關(guān)研究人員提出了一種新的檢測技術(shù)，即將血液檢測和計算機斷層掃描成像相結(jié)合，以便于早期LC 的識別和干預[13]。但是對于LC 伴隨EGFR 基因突變的患者來說，這種檢測方法效果較差，并且難以對臨床治療提供判斷方向。有研究表明[14]，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑在治療晚期非小細胞肺癌（non-small lung cancer，NSCLC）中具有明顯優(yōu)勢。而在二代測序技術(shù)的應用中，研究機體EGFR 基因突變的進程，可發(fā)現(xiàn)基因變化產(chǎn)生的區(qū)域均存在于酪氨酸激酶中。Barras 等[15]在表皮生長因子受體絡(luò)氨酸激酶抑制劑的研究中發(fā)現(xiàn)，NSCLC 伴EGFR 基因突變患者的治療效果，并提出EGFR 突變類型包括外顯子點突變、缺失突變、插入突變，主要發(fā)生于18 ～20號的外顯子。相關(guān)文獻報道表明[16]，EGFR 基因突變的不同程度均對臨床療效產(chǎn)生不同的指示性特征。然而，在實際的檢測工作中，由于LC 病理組織的活檢標本難以重復獲得，并且受到檢測時間的影響，待結(jié)果呈現(xiàn)之時癌細胞早已轉(zhuǎn)移或擴散，增加了手術(shù)治療的難度。約有54% 的組織基因突變患者，通過二代測序技術(shù)對EGFR 進行鑒定突變的測試，可以給予此類患者更多可選擇的治療機會[17]。針對此類情況，有學者[18]指出這是由于腫瘤細胞含量較低所致，因此在二代測序技術(shù)的應用中，還應同時加入更為靈敏的檢測方法，例如液體活檢。在液體活檢中，可以評析機體血液樣品標本中的CfDNA 水平，以確定靶向治療的患者，并對患者予以分子動態(tài)變化的檢測。

2.5 結(jié)直腸癌（CRC）

CRC 的發(fā)病率居于全球惡性腫瘤發(fā)病率的第三位，好發(fā)于老年男性群體，嚴重威脅著老年患者的生命安全，而在近年來，由于人們飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，CRC 的發(fā)病趨勢呈現(xiàn)出了低齡化的特點。在腫瘤細胞的發(fā)展進程中，EGFR 全程參與其中，具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞的作用，對其生長功能、修復功能以及侵襲、轉(zhuǎn)移方面都存在一定程度的影響，而在臨床治療中多以藥物的相互組合作為靶點治療的方法。但是，有學者指出[19]，EGFR 的單克隆抗體治療，即西妥昔單抗或者帕尼單抗，都難以普遍應用到臨床CRC 患者的治療中，因此需要非癌細胞轉(zhuǎn)移患者應用二代測序技術(shù)檢測用藥治療的反應，減少患者在治療過程中的不必要醫(yī)療支出，同時能夠更好地監(jiān)測不良反應的發(fā)生情況。RAS 蛋白作為一種下游效應子，旨在將基因功能的變化情況從EGFR 傳輸至細胞內(nèi)，成為信號傳輸?shù)闹匾獦酥荆欢鳮RAS 用于預測生物標志物的有效性，對于具有KRAS 突變的患者來說，可以起到抑制劑的抵抗作用[20]。大約45% 的KRAS 外顯子2 的患者，難以從靶向藥物的提示中獲得理想的診療方向，而CRC 中的基因突變或者下游突變，受到遺傳基因異常改變因素的影響，導致抗EGFR 的耐藥性逐漸升高，臨床療效并不明顯，因此CRC 病理組織的異常特性是預測CRC 治療的關(guān)鍵。

2.6 其他腫瘤

除了上述五個比較常見的實體腫瘤外，二代測序技術(shù)在其他實體腫瘤的診斷、治療以及預后中的應用也是比較廣泛的。如食管癌、黑色素瘤、甲狀腺癌瘤等。喬云等[21]研究指出，在食管癌患者中應用二代測序技術(shù)探索敏感基因，可以提高放射治療的敏感性，這提示二代測序技術(shù)在食管癌患者的個體化治療中能夠予以特殊的干預和指導。Mari 等[22]通過NGS 來研究散發(fā)性甲狀腺髓樣癌的診斷分層，發(fā)現(xiàn)二代測序技術(shù)可以對甲狀腺癌的診治提供診療方向，更好地區(qū)分甲狀腺結(jié)節(jié)的分類變化，降低并發(fā)癥的發(fā)生率，改善診斷性穿測的發(fā)生情況。Adan 等[23]用二代測序技術(shù)、免疫組織學這兩種方法檢測黑色素瘤，包括檢測靈敏度、時間、成本等，結(jié)果顯示，二代測序技術(shù)對于黑色素瘤的檢測效果更為顯著，并且也闡述了分子診斷的多種優(yōu)勢，倡導臨床不斷推進二代測序技術(shù)的應用。此外，Illumina 公司的TruSight Tumor 主要用于查看實體瘤中的體細胞變異情況，包括肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、胃癌和卵巢癌，可以準確提示腫瘤患者基因突變的概率，并分析機體變異的具體情況[24-26]。而在實體腫瘤的預后方面，二代測序技術(shù)的應用可以為腫瘤篩查、診斷和治療提供新的方向，在臨床使用中具有巨大的發(fā)展?jié)撃堋?/p>

3 小結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)的蓬勃發(fā)展，臨床上逐漸將信息數(shù)據(jù)的模式應用于診療工作中，在實體腫瘤的診療過程中更是做到了個體化治療的精準結(jié)合，有效提高了診斷率和治療效果。而在現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)的應用中，二次測序技術(shù)作為一種新的檢測手段，旨在通過DNA 片段的深度探查，來獲得機體或疾病的基因組信息，明確腫瘤在病情發(fā)展階段的細胞變化情況。此外，二代測序技術(shù)具有靈敏度高、檢測時間段廣泛、通量高、信息量大等優(yōu)點，在實體腫瘤的診療中起到了十分重要的作用。

綜上所述，二代測序技術(shù)的應用為實體腫瘤的診療工作帶來了更深層次的變革，特別適用于基因遺傳、變異等相對復雜的疾病種類研究中。在未來幾年，隨著二代測序技術(shù)的深入研究和應用，有望將其引進血液癌癥的診療中，不斷完善基因組譜的評估情況和臨床實踐，提高測序技術(shù)的實用性。與此同時，還應加強對第三代測序技術(shù)的研發(fā)，彌補原有測序技術(shù)的局限和不足，為臨床診治補充更為豐富的技術(shù)要點。在基因組學不斷變化發(fā)展的當下，測序技術(shù)也應適應新模式的轉(zhuǎn)變，有望將二代測序技術(shù)與三代測序技術(shù)相互聯(lián)合，應用于臨床實體腫瘤的診療工作中。