多發(fā)性骨髓瘤殘留監(jiān)測(cè)的方法學(xué)進(jìn)展

胡建娥，孫秋艷，李良瓊，唐燕

重慶三峽中心醫(yī)院檢驗(yàn)科1、藥學(xué)部2，重慶 404000

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種惡性疾病，其特征是骨髓或髓外(很少見)出現(xiàn)克隆增殖的異常漿細(xì)胞(PC)，產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白(IgG、IgA、IgD、IgE免疫球蛋白)和/或單克隆免疫球蛋白輕鏈(κ/λ)。近年來，多發(fā)性骨髓瘤的治療方法迅速發(fā)展[1-3]。使用某些藥物，如沙利度胺、萊利多胺進(jìn)行高劑量化療(HDCT)后，然后進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植，使多發(fā)性骨髓瘤患者能夠?qū)崿F(xiàn)相當(dāng)高的總體生存率(OS)。靶向治療以及自體造血干細(xì)胞移植(AUTO-HSCT)促進(jìn)了多中心國(guó)際臨床研究。新型藥物的治療增加了完全緩解率(CR)，然而在高危和難治性的多發(fā)性骨髓瘤患者中，雖然有超過30%的MM病例達(dá)到CR，但是其中大多數(shù)患者都有復(fù)發(fā)。CR，甚至是嚴(yán)格意義的完全緩解(sCR)并不足以識(shí)別患者群體對(duì)治療的良好反應(yīng)和疾病進(jìn)展的低風(fēng)險(xiǎn)。因此有必要對(duì)使用高敏感度和高特異性的方法對(duì)緩解程度進(jìn)行更深層次的評(píng)價(jià)。AS-PCR和多色流式細(xì)胞術(shù)(MFC)是能夠最大限度的識(shí)別出在治療結(jié)束后仍存在的惡性漿細(xì)胞的主要方法。2011年，IMWG基于用AS-PCR和MFC檢測(cè)異常殘留漿細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，增加了免疫表型和分子緩解的條件[4]。本文對(duì)檢測(cè)和評(píng)估多發(fā)性骨髓瘤緩解的傳統(tǒng)方法以及新近出現(xiàn)的方法學(xué)做一簡(jiǎn)要的綜述。

1 骨髓形態(tài)學(xué)

骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)是目前最廣泛的評(píng)估腫瘤負(fù)荷的方法。CR的標(biāo)準(zhǔn)是骨髓涂片中的漿細(xì)胞＜5%。但是形態(tài)學(xué)研究應(yīng)與免疫學(xué)檢查相結(jié)合[5]。CHEE等[6]的一項(xiàng)研究表明，僅單克隆輕鏈(FLC)檢測(cè)不足以確定CR，10%的FLC比率正常的患者在BM涂片中存在＞5%的漿細(xì)胞。在一組92例免疫化學(xué)檢測(cè)結(jié)果陰性的患者中，13例患者(14%)在骨髓涂片中漿細(xì)胞大于5%，而這些患者的總生存率低于＜5%漿細(xì)胞的患者(分別為5.7年和7.9年)。通過骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)漿細(xì)胞的比例，不能很好的評(píng)估患者的預(yù)后及復(fù)發(fā)。

2 血清和尿液的免疫學(xué)檢測(cè)

通過電泳和免疫固定電泳法定量測(cè)定血清和尿液中的M-蛋白和FLC(游離單克隆輕鏈)，用于診斷和監(jiān)測(cè)MM的治療反應(yīng)。血清游離單克隆輕鏈(FLC)定量已成為常規(guī)檢測(cè)。FLC比率是MM的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子，并且能評(píng)估疾病的進(jìn)展[7]。然而，使用FLC定量評(píng)估MRD并不能有效地劃分不同的風(fēng)險(xiǎn)群體。根據(jù)MARTINEZ-LOPEZ等[8]的研究，在94例CR患者中，69例患者(73%)達(dá)到了sCR，但在CR和sCR組中，疾病的進(jìn)展時(shí)間(CR和sCR的平均進(jìn)展時(shí)間分別為53和62個(gè)月)沒有明顯的差異。在由LOPEZ-ANGLADA等[9]進(jìn)行的130例患者的研究中獲得了類似的數(shù)據(jù)。PAIVA等[10]的研究表明，根據(jù)GEM 05＞65歲的治療方案，在260例接受治療的MM患者中，43%達(dá)到CR，30%達(dá)到sCR，30%達(dá)到免疫化學(xué)特異性緩解(IR)。然而，在CR和sCR患者中，生存率沒有明顯的差異；與CR和sCR患者相比，IR患者表現(xiàn)出了較長(zhǎng)的無復(fù)發(fā)生存期(RFS)。此外，一些CR患者保留了陽(yáng)性的免疫固定電泳檢測(cè)結(jié)果，但在這些患者中沒有發(fā)現(xiàn)M蛋白。在MRD陽(yáng)性患者中，其免疫固定電泳檢測(cè)結(jié)果陰性，達(dá)到了IR，但在這些患者中，隨后又檢測(cè)到M-蛋白(中位數(shù)為3個(gè)月)。在sCR患者中觀察到類似的情況，在誘導(dǎo)治療后13個(gè)月表現(xiàn)出疾病進(jìn)展[11]。

3 細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)

有研究顯示，影響多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)展期和OS最重要的獨(dú)立參數(shù)是FISH檢測(cè)細(xì)胞遺傳畸變、IR及年齡(60歲以下或以上)[11]。發(fā)病時(shí)檢測(cè)到的染色體缺陷決定了MM的風(fēng)險(xiǎn)。用FISH方法預(yù)測(cè)疾病所需的基本組套包括染色體易位t(4；14)(p16；q32)(出現(xiàn)頻率：13%)、t(14；16)(q32；q23)(出現(xiàn)頻率：3%)和染色體缺失del17p13(出現(xiàn)頻率：12%)。除此之外還可包括t(11；14)(q13；32)(出現(xiàn)頻率：15%)、13q缺失(出現(xiàn)頻率：46%)、1號(hào)染色體的異常，如1q重復(fù)(出現(xiàn)頻率：38%)[12]。高危的多發(fā)性骨髓瘤包括t(4；14)、t(14；16)或del(17p)[13]。微小殘留病診斷(MRD)基于FISH檢測(cè)有一定的局限性，一方面由于治療后殘余漿細(xì)胞數(shù)量少，另一方面FISH方法的靈敏度不足(10-2～10-3)，只高于形態(tài)學(xué)檢查(10-1)一個(gè)數(shù)量級(jí)。

4 Allele-specific PCR

該方法是通過檢測(cè)免疫球蛋白基因可變區(qū)域的特異性重排來確定腫瘤漿細(xì)胞的克隆性。B細(xì)胞的正常成熟包括V、D和J片段的重排，這些片段的組合形成了復(fù)雜的Ig基因(IGH、IGκ和IGλ)，其編碼多個(gè)可變免疫球蛋白分子結(jié)構(gòu)域。在V(D)J段連接的位點(diǎn)上隨機(jī)插入和缺失，引起每一個(gè)B細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)獨(dú)特的可變區(qū)。在每個(gè)患者的骨髓瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的連接區(qū)域被用作特定于腫瘤特異性的靶標(biāo)，以設(shè)計(jì)特定于等位基因(或患者特異性)引物。自上世紀(jì)90年代以來，巢式PCR用于檢測(cè)克隆重組，隨之而來的是實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。

AS-PCR的缺點(diǎn)包括技術(shù)困難和適用性有限(沒有適當(dāng)?shù)哪康幕蚩梢苑治?。PUIG等[14]的研究顯示，AS-PCR只能在42%的多發(fā)性骨髓瘤病例中使用，而在SARASQUETE等[15]的研究中適用于75%的病例。然而，在SILVENNOINEN等[16]的研究中進(jìn)行的一系列修飾之后，AS-PCR的適用于100%的病例。此外，分子方法沒有考慮遺傳異質(zhì)性和克隆選擇，可能導(dǎo)致在疾病治療過程中一些亞克隆檢測(cè)不到[17-18]。然而，選擇更好的引物和探針[16]，或選擇除IgH-VDJ以外的靶點(diǎn)，如kappa缺失區(qū)[19]，可以提高ASO-PCR的特異性、敏感性和適用性。

5 下一代測(cè)序

下一代測(cè)序(NGS)是基于使用一套引物(而不是針對(duì)每一個(gè)患者)，它允許放大和測(cè)序給定樣本的免疫球蛋白基因的所有重組片段(≥105)。這個(gè)方法證明適用于超過90%的MM病例，其敏感性≤10-6。在MM初診時(shí)，檢測(cè)到Ig基因的克隆重組，其用于作為后面檢測(cè)MRD的靶標(biāo)[21]。在MARTINEZ-LOPEZ等[21]的研究中，MRD患者(n=133)被分成三組：高水平組(≥10-3)、中等水平組(10-3～10-5)和低水平組(＜10-5)；結(jié)果顯示各組在進(jìn)展時(shí)間上有很大差異(分別為27、48和80個(gè)月)。NGS定量檢測(cè)最小殘留病灶有一定的困難，尤其是在Ig基因的多克隆重組中，檢測(cè)到的克隆重排的比例取決于正常B細(xì)胞數(shù)量多少，其數(shù)量是變化的，并且與治療方式有關(guān)。NGS采用MM患者外周血評(píng)估MRD顯示出其優(yōu)勢(shì)，這是一種無創(chuàng)的檢測(cè)方法[21-22]。

6 全身磁共振成像(MRI)和正電子發(fā)射/計(jì)算機(jī)斷層攝影(PET/CT)

由于多發(fā)性骨髓瘤存在髓外復(fù)發(fā)的可能，MRI和PET/CT的使用使得BM中MRD陰性的患者能夠全面的評(píng)估緩解狀態(tài)。GALTSEVA等[23]在2015-2016年進(jìn)行的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，113例患者中，有4例BM中MRD陰性，但在血液中檢測(cè)到M蛋白，MRI檢測(cè)確認(rèn)存在髓外軟組織漿細(xì)胞瘤。全身MRI是檢測(cè)脊椎骨的病變、提供完整的相關(guān)組織損傷程度和性質(zhì)以及BM浸潤(rùn)的性質(zhì)(局限性、彌漫性等)的最敏感的非侵入性可視化方法。但是值得注意的是，無論患者對(duì)治療方案有無反應(yīng)，在治療后的幾個(gè)月，都會(huì)觀察到局部病變持續(xù)存在，這與反應(yīng)性的水腫或者殘留病變細(xì)胞的存在有關(guān)，導(dǎo)致血清學(xué)反應(yīng)與MRI對(duì)緩解評(píng)估不一致。所以建議在治療后3個(gè)月進(jìn)行MRI檢查[24]。PET/CT通過FDG的攝取評(píng)估髓外和髓內(nèi)病變的細(xì)胞代謝，從而定位病變，并識(shí)別溶骨損傷[25]。事實(shí)證明，HDCT和/或AUTO-HSCT后，存在異常的FDG攝取細(xì)胞，提示預(yù)后不良[26]。有研究顯示，采用沙立度胺/地塞米松誘導(dǎo)治療，然后進(jìn)行AUTO-HSCT，有63%的患者PET/CT顯示存在病變，這些患者顯示不好的預(yù)后；自體造血干細(xì)胞移植后3個(gè)月無異常FDG攝取的患者預(yù)后較好；CR患者中有23%顯示攝取FDG，這些患者生存期較短[27]。但是，PET/CT在感染或炎癥過程中可產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性[280]。對(duì)比全身MRI和PET/CT，表明PET/CT具有與MRI相似的敏感性，但特異性更強(qiáng)。

7 多色流式細(xì)胞

漿細(xì)胞是產(chǎn)生抗體終末期B細(xì)胞。盡管漿細(xì)胞幾乎可以在每個(gè)組織中產(chǎn)生，但大多數(shù)漿細(xì)胞是由抗原激活的B淋巴細(xì)胞通過多步驟轉(zhuǎn)化成熟而來的，從次級(jí)淋巴組織如淋巴結(jié)、脾臟和黏膜相關(guān)的淋巴組織開始產(chǎn)生[29]。這些組織中，新近產(chǎn)生的漿細(xì)胞通過外周血遷移，到達(dá)骨髓和其他外圍組織(如脾臟和胃腸黏膜)中存活下來，這些地方通常可以檢測(cè)到長(zhǎng)期存活的漿細(xì)胞[30]。因此，早期的漿細(xì)胞可以在次級(jí)淋巴組織和外周血中檢測(cè)到，而終端分化的漿細(xì)胞通常出現(xiàn)在骨髓中[31]。骨髓漿細(xì)胞通常缺乏大多數(shù)泛B細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)，如CD20、CD22和膜表面免疫球蛋白(SmIg)；此外，骨髓漿細(xì)胞顯示出異質(zhì)性的CD19的表達(dá)，CD45low和CD56-/low、CD38和CD138高表達(dá)[32]。值得注意的是，盡管骨髓漿細(xì)胞的常見免疫表型如此，但是骨髓漿細(xì)胞是由幾個(gè)不同表型的細(xì)胞亞群組成，其顯示了與成熟相關(guān)的特征[33]。例如，大多數(shù)正常/反應(yīng)的骨髓漿細(xì)胞表達(dá)CD19，但是其中有約三分之一的正常漿細(xì)胞CD19-；相似的是，盡管大多數(shù)CD19+、CD19-正常/反應(yīng)性骨髓漿細(xì)胞CD45+CD56-CD81+，但是一小部分CD45-CD81-CD56+的是正常/反應(yīng)性漿細(xì)胞，特別是CD19-骨髓漿細(xì)胞群中[34-35]。這些少量的小亞群的骨髓漿細(xì)胞的精確生理意義還有待進(jìn)一步研究，有可能與不同的成熟度的漿細(xì)胞有關(guān)，隨著細(xì)胞成熟度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少，例如，從主要CD19+CD56-細(xì)胞群到小的 CD19-CD56-和CD19-CD56+細(xì)胞群[36]。

骨髓瘤細(xì)胞的表型與正常的漿細(xì)胞不同。用于檢測(cè)骨髓瘤MRD相關(guān)的異?？乖磉_(dá)標(biāo)記包括CD19、CD56、CD45、CD38、CD27，以及較少的CD20、CD28、CD33、CD117和SmIg[37]。聯(lián)合檢測(cè)這些標(biāo)記(或其中部分標(biāo)記)和胞質(zhì)免疫球蛋白(CyIg)κ/λ輕鏈可進(jìn)一步確定可疑的克隆性漿細(xì)胞。近年來，新發(fā)現(xiàn)了一些骨髓瘤細(xì)胞的抗原標(biāo)記，其中，CD81、CD200、CD54和CD307等已成為最為熟知的標(biāo)記[38-39]。但是，骨髓瘤細(xì)胞出現(xiàn)每個(gè)異常標(biāo)記的頻率變化很大[40-41]，除此之外，標(biāo)記抗體所用的熒光素、抗體的克隆號(hào)及不同廠家生產(chǎn)的抗體都可能對(duì)骨髓瘤細(xì)胞表型產(chǎn)生影響?？偠灾?，不能采用單一的抗原表達(dá)異常來判斷正常漿細(xì)胞與腫瘤漿細(xì)胞。確定正常與腫瘤漿細(xì)胞，需要采用多種抗體標(biāo)記共同判定。例如，CD19在腫瘤性漿細(xì)胞上是不表達(dá)的，但是MM-MRD時(shí)CD19可以表達(dá)在腫瘤漿細(xì)胞上[42]，也有大約30%的病例，反應(yīng)性/正常漿細(xì)胞不表達(dá)CD19[43]，相似的，CD56被認(rèn)為表達(dá)在骨髓瘤細(xì)胞，但是，有少部分正常/反應(yīng)性的漿細(xì)胞出現(xiàn)CD56不同強(qiáng)度的表達(dá)[44]。CD28、CD45、CD81、CD27和CD200等異常標(biāo)記也表達(dá)在一些正常漿細(xì)胞。但是，到目前為止，CD117還未發(fā)現(xiàn)表達(dá)于正常漿細(xì)胞。因此，不能僅憑一個(gè)或者兩個(gè)細(xì)胞標(biāo)記判斷漿細(xì)胞的正常與否，對(duì)懷疑的小亞群漿細(xì)胞加做更多的抗原標(biāo)記，如cKAPPA或cLAMBDA，提高檢測(cè)的敏感度[45-46]。

8 質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)[47]

目前的流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)采用熒光基團(tuán)標(biāo)記抗體，熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜一般比較寬，會(huì)發(fā)生重疊，這一方面限制了檢測(cè)通道的數(shù)量，很多通道的信號(hào)需要復(fù)雜的補(bǔ)償計(jì)算；而質(zhì)譜流式細(xì)胞儀采用金屬同位素標(biāo)記，可以同時(shí)檢測(cè)大量的分子標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，相鄰?fù)ǖ篱g的干擾很少，無需計(jì)算補(bǔ)償；金屬元素在細(xì)胞中的含量極低，且金屬同位素與細(xì)胞組分的非特異性結(jié)合能力極低，所以信號(hào)背景也極低。采用飛行質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)大量的分子標(biāo)記，其不僅能檢測(cè)出極低量的骨髓瘤細(xì)胞，還可以分析其微環(huán)境，有助于評(píng)估新的治療方法和對(duì)耐藥的理解。質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)是利用質(zhì)譜原理對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)的流式技術(shù)。它繼承了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的高速分析的特點(diǎn)，又具有質(zhì)譜檢測(cè)的高分辨能力。針對(duì)細(xì)胞表面抗原的靶向治療的出現(xiàn)，相應(yīng)的就需要采用更多的抗體標(biāo)記來檢測(cè)殘留的異常細(xì)胞，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)通道間的低補(bǔ)償，可以同時(shí)檢測(cè)大量的分子標(biāo)記，這是未來MRD檢測(cè)的一個(gè)新的技術(shù)。

9 小結(jié)

靶向治療以及免疫治療等新的治療方法的出現(xiàn)大大提高了治療的有效性和緩解率。傳統(tǒng)的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫化學(xué)檢測(cè)方法并不能充分評(píng)估患者的生存率和無進(jìn)展生存期。MRD陰性的患者逐年增加，研究也證實(shí)了MRD陰性的患者具有更長(zhǎng)的PFS和OS。影像學(xué)檢查有助于全面評(píng)估患者的緩解狀態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)和分子檢測(cè)有具有較高的分析敏感性，但是每一種方法都有它自己的缺點(diǎn)。這也顯示出了平行分析各種檢測(cè)結(jié)果的重要性，尤其是在不同方法的檢測(cè)結(jié)果不一致的時(shí)候。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，識(shí)別罕見異常漿細(xì)胞的靈敏度可以達(dá)到10-6，分子檢測(cè)(AS0-PCR和NGS)、細(xì)胞檢測(cè)(MFC)都能有效的監(jiān)測(cè)多發(fā)性骨髓瘤的MRD，這些監(jiān)測(cè)方法也有助于臨床調(diào)整治療方案，而質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)將更有助于檢測(cè)出微量殘存的異常漿細(xì)胞。