高脂飲食和鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的影響因素

黎婭，吳穹，馬曉雨，常秀君，韓蕙竹，何敏，解安達(dá)，范培云

（青海大學(xué)，青海 西寧 810001；*青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007）

糖尿病的患病率逐年增加，據(jù)估計(jì)，到2040年全球約有6.24億人患有糖尿病[1]。其中2型糖尿病占糖尿病總數(shù)的90%～95%[2]。2型糖尿病有著復(fù)雜的病理過程，患者通常會(huì)經(jīng)歷高胰島素血癥、胰島素抵抗和血脂異常的肥胖狀態(tài)，這個(gè)時(shí)期常常表現(xiàn)為糖耐量異常，稱為糖尿病前期。隨著病程的發(fā)展，繼而出現(xiàn)胰島素缺乏，進(jìn)展為高血糖狀態(tài)。為了更好的模擬這一發(fā)病過程，建立具有臨床相關(guān)的2型糖尿病（T2DM）動(dòng)物模型，高脂飲食（HFD）聯(lián)合鏈脲佑菌素（STZ）這一方法廣泛應(yīng)用于糖尿病研究。

1 HFD-STZ-T2DM發(fā)展歷史

1963 年，STZ被首次用于誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型。1976年，A.Like等[3]發(fā)現(xiàn)單次靜脈或腹腔注射小劑量的STZ可以成功誘導(dǎo)T2DM模型。2000年，Reed等[4]發(fā)現(xiàn)用40%脂肪供能比飼料喂的SD大鼠，表現(xiàn)出比對(duì)照組更高的血清胰島素水平，但血糖水平并無差異，其特點(diǎn)類似于人類2型糖尿病前期。隨后Reed等繼續(xù)給予STZ（50 mg/kg）尾靜脈注射，大鼠血糖水平明顯升高，HFD聯(lián)合STZ成功誘導(dǎo)了T2DM模型，這也是該模型首次被報(bào)道。Srinivasan等[5]在之后的研究中將STZ注射方式改為腹腔注射并采用較低劑量STZ（35 mg/kg）。Zhang等[6]在該模型基礎(chǔ)上，將STZ注射改為小劑量連續(xù)兩次注射，據(jù)報(bào)道，該方法能夠避免單次大劑量誘導(dǎo)β細(xì)胞快速死亡。至今，以上三種方法被廣泛用于建立2型糖尿病動(dòng)物模型，但受不同方面因素的影響，造模方式也存在一些差異。

2 HFD

HFD能夠很好地模擬糖尿病前期肥胖、胰島素抵抗、糖耐量減低、血脂紊亂等特征。盡管HFD被廣泛用于T2DM大鼠模型制備，但高脂飼料的種類及喂養(yǎng)時(shí)間卻不盡相同?，F(xiàn)今常用的高脂飼料有兩大類：第一類在普通飼料的基礎(chǔ)上添加一定比例的動(dòng)物油、糖、蛋黃、膽固醇、膽酸鈉等，改變飼料中脂肪和碳水化合物的能量供應(yīng)比，如加入12%豬油、10%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%膽鹽[7]。在基礎(chǔ)飼料中添加上述物質(zhì)，看似操作簡(jiǎn)單，但飼料中所有的營養(yǎng)物質(zhì)含量都產(chǎn)生了相應(yīng)變化，基礎(chǔ)飼料中各營養(yǎng)成分被稀釋，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在攝取高脂飼料的同時(shí)，可能會(huì)造成營養(yǎng)物質(zhì)攝入不均衡，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有研究者[8-9]為了避免蛋白質(zhì)減少會(huì)添加適量奶粉、雞蛋或酪蛋白，盡管酪蛋白氨基酸充足，仍然無法避免蛋氨酸攝入不足。第二類為純化的飼料，進(jìn)一步細(xì)分了各組分營養(yǎng)物質(zhì)的配比，包括酪蛋白、淀粉、蔗糖、纖維素、動(dòng)植物油脂、無機(jī)鹽和維生素等。具有營養(yǎng)物質(zhì)含量準(zhǔn)確、配方規(guī)范、開放性高、易于修改、不含對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有干擾的雜質(zhì)、易于設(shè)置平衡對(duì)照組等優(yōu)點(diǎn)[10]，但純化飼料造價(jià)昂貴，生產(chǎn)企業(yè)較少，限制了其應(yīng)用。除了高脂飼料種類不同，脂肪供能比也有所不同，30%～60%[11-13]均有報(bào)道。脂肪供能比10%為低脂飲食，30%～50%為HFD，而大于50%被認(rèn)為是極高脂肪飲食。HFD的目的是讓大鼠達(dá)到超重或肥胖狀態(tài)，這與2型糖尿病患者大多伴有肥胖癥狀類似。HFD可以在不改變胰島素受體親和力的情況下導(dǎo)致胰島素受體總體減少[14]，從而誘發(fā)胰島素抵抗。但這并不意味著飼料脂肪比越高越好，高脂肪比飼料的成型與儲(chǔ)存存在極大難度。除了脂肪比，肥胖的程度往往還取決于高脂喂養(yǎng)的周期。短期的高脂飲食（2周）往往達(dá)不到肥胖，只會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗和（或）葡萄糖耐量減低，而相對(duì)較長的飲食（5周～3個(gè)月）會(huì)導(dǎo)致身體脂肪比例增高，這其中也包括內(nèi)臟脂肪。HFD-STZ喂養(yǎng)的大鼠常常出現(xiàn)血脂代謝異常。多數(shù)大鼠在注射STZ之后，持續(xù)高脂飲食，后期大鼠通常會(huì)存在血脂異常；若給予STZ處理后，將高脂飲食替換為普通飲食的糖尿病大鼠，是否也依然存在血脂異常，需要進(jìn)一步研究。且往往人類2型糖尿病發(fā)病常在肥胖、血脂紊亂、高胰島素血癥的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)血糖升高。因此，對(duì)STZ注射之前的血脂監(jiān)測(cè)，將更有利于證明2型糖尿病大鼠發(fā)病過程。有研究認(rèn)為高脂飲食的種類及喂養(yǎng)時(shí)間與STZ劑量密切相關(guān)[15]，即喂養(yǎng)時(shí)間越長，所需STZ劑量越少。

3 STZ

STZ是從無色鏈霉菌中提取的一種抗生素，本質(zhì)上是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲。由于它具有胰島β細(xì)胞毒性被用于1型和2型糖尿病動(dòng)物模型制備。其亞硝基脲部分是損傷胰島β細(xì)胞的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)STZ通過葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2（GLUT-2）轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，從而影響糖代謝水平，GLUT-2在腎臟、肝臟和小腸中也有表達(dá)，因此對(duì)這些器官也有一定程度的影響[16-17]。STZ通常被溶于生理鹽水或檸檬酸鈉緩沖液中（PH4.5），其水溶液極不穩(wěn)定，一般在15～20分鐘后降解，加之STZ具有光敏性，因此要求現(xiàn)配現(xiàn)用，避光，冰浴[18-19]。STZ常常采用腹腔（IP）或尾靜脈注射（IV），IP操作更簡(jiǎn)便、快速，IV給藥操作難度更大，但誘導(dǎo)的糖尿病模型也更穩(wěn)定、重復(fù)性較好[20]。當(dāng)給予IP時(shí)，應(yīng)避免藥物進(jìn)入皮下或腸道，否則可能會(huì)增加死亡率或降低糖尿病的原發(fā)病作用。，而在同等條件下，IV所需STZ劑量更小。一般認(rèn)為STZ劑量＞65 mg/kg為高劑量，40～55 mg/kg為中等劑量，＜35 mg/kg為低劑量[16]。 Gheibi等[21]以高脂喂養(yǎng)大鼠2周后單次腹腔注射STZ 30 mg/kg建立T2DM。Gomaa等[22]以高脂喂養(yǎng)大鼠4周單次腹腔注射STZ 25 mg/kg建立T2DM。Anupam等[23]以單次腹腔注射STZ 55 mg/kg建立Ⅰ型糖尿?。═1DM）。STZ的劑量對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞的殘存量起到?jīng)Q定性的作用。臨床研究在診斷T1DM時(shí)，患者通常60%～80%的胰島β細(xì)胞功能喪失[24]，在診斷T2DM的15年后，β細(xì)胞數(shù)量減少了54%，這些數(shù)據(jù)表明，早期T1DM與晚期T2DM胰島β細(xì)胞數(shù)量存在相似。T1DM與T2DM在疾病發(fā)展的不同階段存在類似的病理表現(xiàn)，因此在用STZ誘導(dǎo)不同類型的糖尿病大鼠模型時(shí)，我們很難真正區(qū)分究竟是T1DM還是T2DM。T2DM的早期往往以胰島素抵抗為主，一些方法如：糖耐量、胰島素耐量及胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型（HOMA-IR）常常用來進(jìn)一步驗(yàn)證T2DM大鼠模型，需注意的是STZ引起的糖尿病可能會(huì)導(dǎo)致胰島敏感性的增加[25]，從而減輕胰島素抵抗，這也許與大鼠機(jī)體代償調(diào)節(jié)有關(guān)。綜上所述，胰腺的病理狀態(tài)也許對(duì)評(píng)價(jià)糖尿病模型鼠的類型及分期更為關(guān)鍵，但很少有研究提到這一參數(shù)。此外，大鼠空腹和非空腹?fàn)顟B(tài)可影響STZ的藥效，有人建議STZ注射前禁食4 h[18]，也有人建議隔夜禁食[26]。禁食可增加胰島細(xì)胞對(duì)STZ的敏感性。大鼠是夜間進(jìn)食動(dòng)物，夜間禁食，往往會(huì)導(dǎo)致禁食時(shí)間過長，禁食會(huì)激活多種生理反應(yīng)，所以最好早上開始禁食[18]，大鼠的適宜禁食時(shí)間為7∶00～15∶00時(shí)之間的6～8 h。

4 鼠齡和體重

在絕大多數(shù)研究中，大鼠的鼠齡＜6個(gè)月，為年輕的糖尿病模型，而T2DM人群主要為老年人，而以青幼年的大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象并不能很好地模擬臨床上T2DM的疾病進(jìn)程。使用鼠齡較大的鼠建造T2DM模型也同樣存在巨大的挑戰(zhàn)，鼠齡較大的鼠往往體重也更大，鼠齡相同的鼠，體重也不完全一致，不同的高脂飼料導(dǎo)致大鼠的體脂分布差異。Reed等[4]的研究表明，同樣的STZ劑量給予不同體重的大鼠，這些大鼠并沒有表現(xiàn)出相同的血糖水平。這可能與STZ不與脂質(zhì)相互作用有關(guān)[27]。鼠齡小的大鼠盡管體重適宜，但它們有較強(qiáng)的胰島β細(xì)胞代償功能，能夠通過增加β細(xì)胞的數(shù)量減輕甚至治愈糖尿病[28]。

研究結(jié)果顯示：（1）高脂飼料的脂肪含量并不是越高越好，不同來源的大鼠對(duì)相同脂肪比含量的飼料適口性也不同，大鼠的進(jìn)食量將對(duì)大鼠的體重起到?jīng)Q定性作用。大鼠在給予STZ后體重一般存在下降趨勢(shì)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)周期較長的研究者來說，基礎(chǔ)體重過輕的大鼠在給予STZ后，往往不能夠喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。（2）大鼠喂養(yǎng)的條件應(yīng)基本一致，每籠的數(shù)量相當(dāng)，一般一籠不要超過3只，鼠太多會(huì)存在搶食，導(dǎo)致體重差異較大，難以掌握STZ的劑量。盡管如此，即使保持相同的喂養(yǎng)條件，大鼠之間依然存在體重差異，因此在正式給予STZ之前最好能夠挑選不同體重的大鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，將大大降低造模的死亡率。（3）造模成功的大鼠，尿量明顯增加，保持墊料的干燥以及尾靜脈測(cè)血糖后涂抹四環(huán)素軟膏，將降低大鼠因感染引起的死亡率。（4）不同的糖尿病病程，選擇的降糖藥物也有所不同，在臨床上這往往取決于胰島β細(xì)胞的殘余功能儲(chǔ)備，因此檢查大鼠的胰島病理狀態(tài)，有利于更深入的探究糖尿病的分期，有利于不同階段藥物的研究。