《結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測及臨床應(yīng)用專家共識》解讀

梁建琴 吳雪瓊

結(jié)核病是威脅全球公共衛(wèi)生健康的傳染病之一。人類感染結(jié)核分枝桿菌后，大部分呈潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)狀態(tài)。LTBI者中只有5%～10%存在終生罹患活動性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)[1]，而機(jī)體的免疫抑制進(jìn)一步增加了這種風(fēng)險(xiǎn)。這說明宿主先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答在結(jié)核病控制中的重要作用。因此，對結(jié)核病患者免疫狀況的評估、了解其臨床免疫學(xué)特征是近年來研究的熱點(diǎn)之一。臨床上評價(jià)患者免疫狀況的實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目主要是外周血淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子水平。為此，《中國防癆雜志》編輯委員會、中國醫(yī)療保健國際交流促進(jìn)會結(jié)核病防治分會基礎(chǔ)和臨床專業(yè)學(xué)術(shù)部組織專家共同擬定《結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測及臨床應(yīng)用專家共識》(以下簡稱《共識》)[2]，全面介紹了我國結(jié)核病臨床診療常用的淋巴細(xì)胞亞群分析項(xiàng)目及其對檢測結(jié)果的正確判讀與分析；明確了結(jié)核病患者檢測淋巴細(xì)胞亞群的用途，提出了可供臨床借鑒的具體建議；并對未來淋巴細(xì)胞亞群檢測的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。筆者就《共識》中淋巴細(xì)胞亞群檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，以及臨床如何正確客觀分析檢測結(jié)果進(jìn)行解讀，以供我國結(jié)核病臨床工作者借鑒和參考，指導(dǎo)臨床正確評估患者的免疫狀態(tài)，以便實(shí)施個性化的免疫干預(yù)措施。

關(guān)注淋巴細(xì)胞亞群檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)淋巴細(xì)胞亞群分析是一項(xiàng)操作相對復(fù)雜的技術(shù)，集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體，具有分析和分選細(xì)胞的功能。20世紀(jì)90年代，美國疾病預(yù)防控制中心(Centre for Disease Control and Prevention, CDC)、美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI)[原名為：美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS)]出臺了FCM淋巴細(xì)胞亞群分析的標(biāo)準(zhǔn)化方案[3-4]。此后，隨著FCM儀器和試劑的不斷更新，這些標(biāo)準(zhǔn)化方案也得到了進(jìn)一步完善。我國FCM在操作程序、質(zhì)量控制(簡稱“質(zhì)控”)、試劑和儀器選擇、結(jié)果參考范圍等方面存在許多問題，為此，原中華人民共和國衛(wèi)生部于2011年12月14日發(fā)布了中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS/T 360—2011 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》[5]。《共識》中的外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測方法即是參考該指南執(zhí)行的。淋巴細(xì)胞亞群分析是檢測機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。在免疫應(yīng)答期間，外周血T淋巴細(xì)胞發(fā)育為功能不同的亞群，并通過分泌特殊的細(xì)胞因子，影響細(xì)胞免疫，調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答。影響外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果的因素很多，和任何一項(xiàng)檢測技術(shù)一樣，必須嚴(yán)格執(zhí)行檢測操作程序和檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，包括標(biāo)本采集、儀器設(shè)備的校準(zhǔn)維護(hù)和正確使用、試劑質(zhì)量檢測、操作人員的培訓(xùn)、嚴(yán)格的室內(nèi)和室間質(zhì)控、結(jié)果報(bào)告解釋、質(zhì)控對照的設(shè)置等?！豆沧R》明確指出檢測的注意事項(xiàng)，尤其強(qiáng)調(diào)了報(bào)告結(jié)果的參考值范圍。參考值范圍是醫(yī)學(xué)上常用的給臨床診斷提供明確的數(shù)值依據(jù)，醫(yī)務(wù)人員以此作為診斷疾病的標(biāo)準(zhǔn)，對指導(dǎo)臨床治療意義重大。雖然少數(shù)地區(qū)的流式細(xì)胞室自己建立并統(tǒng)一了淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果的參考值范圍，但絕大多數(shù)區(qū)域的流式細(xì)胞室所采用的參考值范圍都是引用文獻(xiàn)，或由儀器生產(chǎn)廠家直接提供，而且不同的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室之間所采用的淋巴細(xì)胞亞群參考值范圍還存在一定的差異。不同廠家的儀器和試劑、環(huán)境和患者因素都會對結(jié)果影響很大，尤其是絕對計(jì)數(shù)的參考值范圍受性別、年齡、種族、營養(yǎng)和環(huán)境差異的人群、儀器類型及試劑來源的不同而存在差異[6-10]。從《共識》檢測報(bào)告內(nèi)容的圖1可以看出，淋巴細(xì)胞亞群的絕對計(jì)數(shù)參考值區(qū)間范圍較大，比如，總T淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)為955～2860個/μl，也從一個方面說明FCM淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果的影響因素較多。為了確保診斷的準(zhǔn)確性，不漏診不誤診，指導(dǎo)臨床有針對性地采取干預(yù)措施，建議各實(shí)驗(yàn)室需針對不同型號的儀器和不同廠家的試劑合理配套應(yīng)用，建立區(qū)域人群淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果的參考值范圍及評價(jià)體系，男性和女性、成人和兒童應(yīng)分別建立參考值范圍[11-12]。力爭實(shí)現(xiàn)區(qū)域性淋巴細(xì)胞亞群檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

重視結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測的臨床應(yīng)用

淋巴細(xì)胞亞群是一群表型多樣，功能復(fù)雜并存在復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的細(xì)胞群[13]，反映了機(jī)體的免疫功能，與疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。T細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，表達(dá)CD3抗原，其中，T細(xì)胞又包括輔助T細(xì)胞(Th)和抑制T細(xì)胞(Ts)，它們分別表達(dá)CD4和CD8抗原；B細(xì)胞主要參與體液免疫，表達(dá)CD19抗原；自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)表達(dá)CD16和(或)CD56抗原，在機(jī)體中不依賴抗原刺激而自發(fā)地發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)?！豆沧R》具體提出7類活動性結(jié)核病患者要進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測，而且要在治療前后進(jìn)行檢測結(jié)果的比較，即老年患者、復(fù)治和久治不愈的患者、病變范圍廣泛嚴(yán)重的患者、并發(fā)嚴(yán)重感染尤其是HIV感染/AIDS的患者、并發(fā)糖尿病的患者、并發(fā)腫瘤和嚴(yán)重營養(yǎng)不良的患者、并發(fā)免疫抑制或有免疫缺陷家族史的患者。通過對不同亞群淋巴細(xì)胞相對計(jì)數(shù)、絕對計(jì)數(shù)的分析，可以評估結(jié)核病患者的免疫狀況，及時實(shí)施干預(yù)措施，監(jiān)測治療效果?！豆沧R》通過檢索復(fù)習(xí)文獻(xiàn)指出，老年結(jié)核病患者CD3+、CD4+、CD8+、自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell，NKT細(xì)胞)和B淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)顯著低于中青年結(jié)核病患者，而NK細(xì)胞無明顯降低[11,14]，說明老年患者的適應(yīng)性免疫功能較差，而固有免疫功能沒有明顯降低，這直接影響了老年患者的治療效果和治愈時間。臨床可通過應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑提高老年患者的免疫力，輔助控制老年結(jié)核病。復(fù)治、耐藥、病情嚴(yán)重的肺結(jié)核患者淋巴細(xì)胞亞群的各項(xiàng)檢測值均較低[15-18]；有學(xué)者報(bào)道， CD4+和CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞在單肺病變組高于雙肺病變組[16, 19]，與其治療效果差、痰菌轉(zhuǎn)陰慢、病情遷延有密切關(guān)系，可通過免疫治療促進(jìn)病情恢復(fù)。研究表明，糖尿病并發(fā)結(jié)核病患者CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)降低，NKT細(xì)胞相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)顯著增高。糖尿病改變了活動性結(jié)核病患者中T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞亞群分布[20]。NKT是T淋巴細(xì)胞的一個獨(dú)特亞群，細(xì)胞表面同時有T細(xì)胞受體和NK細(xì)胞受體。NKT細(xì)胞在功能上不同于傳統(tǒng)的CD4+和CD8+T細(xì)胞，對脂質(zhì)抗原反應(yīng)較對肽抗原反應(yīng)迅速，并分泌大量的Th1和Th2細(xì)胞因子[21]。有報(bào)道稱，NKT細(xì)胞在結(jié)核病并發(fā)2型糖尿病患者中顯著增加[20]，其原因可能是這些患者存在較高的細(xì)菌負(fù)擔(dān)[22]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，肺結(jié)核是否并發(fā)糖尿病對淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果無顯著影響[23]。這說明多種因素可以影響淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果，可能是患者因素，比如被研究患者的病變分期和嚴(yán)重程度等，也有可能是檢測方法或者干擾因素等。所以，要重視結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測的臨床應(yīng)用，全面綜合分析檢測結(jié)果，客觀正確評估患者的免疫功能，有針對性地進(jìn)行治療干預(yù)。

結(jié)核病的發(fā)生與機(jī)體免疫失衡有關(guān)，而淋巴細(xì)胞亞群分析是檢測免疫功能的重要指標(biāo)。但是，目前臨床只注重抗結(jié)核藥品化學(xué)治療，對結(jié)核病患者的免疫功能評價(jià)的關(guān)注還明顯不夠，免疫治療沒有引起足夠重視。《共識》在“淋巴細(xì)胞亞群分析在結(jié)核病患者臨床診療中的應(yīng)用”一節(jié)中每個段落都提出一個建議，涵蓋了臨床上常見結(jié)核病及其并發(fā)癥，如老年結(jié)核病、活動性結(jié)核病、HIV與MTB雙重感染、活動性肺結(jié)核并發(fā)糖尿病、腫瘤、貧血、低蛋白血癥等重癥結(jié)核病患者等，體現(xiàn)了淋巴細(xì)胞亞群檢測分析的必要性和對結(jié)核病患者免疫評估的重要性，須引起業(yè)界臨床同行的高度重視，以期推動結(jié)核病的免疫治療，造?；颊?。

從問題與展望中提高認(rèn)識并獲得經(jīng)驗(yàn)

《共識》在最后一節(jié)“對結(jié)核病患者淋巴細(xì)胞亞群檢測與分析的建議和展望”中，客觀評價(jià)了淋巴細(xì)胞亞群檢測目前存在的問題和改進(jìn)措施。結(jié)核分枝桿菌感染的免疫機(jī)制復(fù)雜而精密，各種免疫細(xì)胞和免疫因子之間不是孤立的起作用。淋巴細(xì)胞亞群之間相互作用、相互影響，從檢測報(bào)告看，同一類型的結(jié)核病患者檢測結(jié)果可能不同，不同類型結(jié)核病患者檢測結(jié)果可能相同。對于患者個體而言，并不是單一的淋巴細(xì)胞亞型檢測水平發(fā)生變化，可能會出現(xiàn)多個亞型檢測結(jié)果的升高和(或)降低?！豆沧R》拋磚引玉，強(qiáng)調(diào)淋巴細(xì)胞亞群相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)要同時檢測和分析，合理選擇淋巴細(xì)胞亞群檢測與分析的方法，結(jié)合臨床特征進(jìn)行綜合評估，才能指導(dǎo)臨床正確診斷和治療。

結(jié)核病免疫不僅需要各種免疫細(xì)胞的參與，還需要各種細(xì)胞因子的共同作用。隨著人們對結(jié)核病免疫機(jī)制研究的不斷深入，淋巴細(xì)胞亞群檢測方法從定性到定量、檢測項(xiàng)目從少到多，并且不斷有新的淋巴細(xì)胞亞型和細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)分析[24-25]；淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子激活和(或)募集靶細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，比如參與抗結(jié)核分枝桿菌感染的主要細(xì)胞因子有γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素、穿孔素、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等[26]。但是，目前臨床檢測分析淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)目和分類有限，還沒有廣泛開展細(xì)胞因子的檢測，對淋巴細(xì)胞亞群功能的評價(jià)不足；為解決臨床免疫治療問題，在檢測分析目前有限的淋巴細(xì)胞亞群基礎(chǔ)上，需要對更多的淋巴細(xì)胞亞型和細(xì)胞因子的作用機(jī)制和功能進(jìn)行更深入的研究。

綜上，《共識》是國內(nèi)第一部關(guān)于結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測及臨床應(yīng)用的專家共識，全面總結(jié)了結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測的重要臨床意義和應(yīng)用價(jià)值，對指導(dǎo)和提升醫(yī)務(wù)人員對淋巴細(xì)胞亞群檢測的認(rèn)識提出了指導(dǎo)性建議。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，抗結(jié)核分枝桿菌感染免疫機(jī)制將會更加清晰，本《共識》會及時修訂，以滿足臨床應(yīng)用的需要，服務(wù)于結(jié)核病患者。