DNA實時熒光恒溫擴增法在結(jié)核病臨床檢測中的應(yīng)用價值

楊翰 李愛芳 王佩 黨麗云

目前，臨床結(jié)核病病原學(xué)檢測方法包括傳統(tǒng)的涂片鏡檢、分離培養(yǎng)菌株、分子生物學(xué)方法等。隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展，各種分子生物學(xué)檢測技術(shù)都已經(jīng)應(yīng)用在結(jié)核病的檢測中，如傳統(tǒng)PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌DNA(FQ-PCR法)，利福平耐藥實時熒光定量核酸檢測(GeneXpert MTB/RIF法)檢測DNA，以及恒溫擴增技術(shù)檢測DNA、RNA。DNA實時熒光恒溫擴增法(簡稱“恒溫擴增法”)檢測結(jié)核分枝桿菌憑借其操作簡便、實驗儀器要求不高等特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基層定點醫(yī)院結(jié)核病診斷。本研究將恒溫擴增法與其他臨床常見分子生物學(xué)技術(shù)進行對比，探討該方法在臨床中的應(yīng)用價值。

資料和方法

一、資料收集

參照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[1]，本研究樣本量估算公式為：n=(μα/δ)2(1-P)P，其中(1)μα：檢驗水準(zhǔn)α=0.05，μα=Zα/2=1.960；(2)δ：判斷界值。一般定在0.05～0.10之間，本研究取δ=0.08；(3)P的確定：P敏感度=0.59；P特異度=0.85。將P敏感度=0.59代入公式后可計算試驗組樣本量得n(試驗)≈145。將P特異度=0.85代入公式后可計算對照組樣本量得n(對照)≈77，本研究為配對資料，因此樣本量不得少于試驗組所需樣本量n(試驗)=145。

收集2019年1—6月西安市胸科醫(yī)院收治的疑似肺結(jié)核患者2421例，其中共有356例患者留取的痰液標(biāo)本同時進行了痰涂片抗酸染色、GeneXpert MTB/RIF法、FQ-PCR法、結(jié)核分枝桿菌RNA實時熒光恒溫擴增(SAT-RNA法)、恒溫擴增法檢測，以上結(jié)果全部納入本次研究。同時收集121份恒溫擴增法陽性的核酸用熔解曲線法檢測利福平ropB基因。

二、研究方法

(一)儀器與試劑

Deaou-308C恒溫?zé)晒釶CR快速檢測系統(tǒng)、ABI7500熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)GeneXpert Dx System)(美國賽沛公司)、SLAN系列實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(廈門致善生物科技股份有限公司)、BACTECTMMGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)(美國BD公司)、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)試劑盒(美國BD公司)、GeneXpert MTB/RIF檢測試劑盒(美國賽沛公司)、結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫擴增檢測試劑盒(上海仁度生物科技有限公司)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群恒溫擴增核酸檢測試劑盒(廣州迪澳生物科技有限公司)、結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒 (廈門致善生物科技股份有限公司)。

(二)試驗方法

1.結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)：采用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)技術(shù)(簡稱“MGIT 960技術(shù)”)檢測痰標(biāo)本。痰標(biāo)本2 ml與6% NaOH溶液以1∶1～1∶2混合加入到50 ml離心管中，振蕩充分液化后，靜置15 min，加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)至45 ml， 3000×g離心20 min，棄上清，加入1 ml 0.1 mol/L PBS混勻，接種0.5 ml至MGIT 960培養(yǎng)管中，置于BACTEC MGIT 960培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 d。若BACTEC MGIT 960系統(tǒng)報告陽性，取出再經(jīng)涂片抗酸染色確認是否為抗酸桿菌，抗酸桿菌陽性則進行MPB64蛋白免疫膠體金法檢測鑒定菌種，MPB64蛋白陽性為結(jié)核分枝桿菌，陰性為非結(jié)核分枝桿菌；若BACTEC MGIT 960系統(tǒng)報陰性，則分枝桿菌培養(yǎng)陰性。

2. FQ-PCR法[2]：取1 ml標(biāo)本加入1.5 ml離心管中，15 000×g離心5 min，棄上清，加入1 ml生理鹽水渦旋振蕩后，15 000×g離心5 min，棄上清。向沉淀中加入50 μl核酸提取液并轉(zhuǎn)入帶磁珠的核酸提取管中，提取儀快速振蕩10 min，然后95 ℃水浴5 min。取2 μl提取好的核酸溶液加入18 μl PCR擴增試劑中進行擴增：37 ℃、300 s(1個循環(huán))，94 ℃、180 s(1個循環(huán))，94 ℃、15 s(40個循環(huán))，60 ℃、30 s(40個循環(huán))，50 ℃、10 s(1個循環(huán))；熒光采集點選擇60 ℃、30 s，同時檢測結(jié)核分枝桿菌拷貝通道和分枝桿菌拷貝通道。結(jié)果判讀：樣本曲線與閾值線交點的橫坐標(biāo)讀數(shù)循環(huán)閾值(Ct值)<40的樣本為陽性，Ct值>40或無數(shù)值的為陰性。

3. GeneXpert MTB/RIF法[3]：將樣本加于 50 ml 帶有螺旋蓋的前處理管；視樣本性狀，將樣品處理試劑加入前處理管中； 旋緊處理管的螺旋蓋；在渦旋振蕩器上振蕩 1 min左右直至樣本充分液化；將前處理管置于生物安全柜內(nèi)，室溫靜置 15 min；使用無菌移液管將2 ml液化的樣品緩慢加入檢測匣。上機測試。結(jié)果自動導(dǎo)出。

4. SAT-RNA法[4-5]：將標(biāo)本加入等量4% NaOH溶液將其液化。取出1.5 ml離心管，對應(yīng)標(biāo)本編號，置于離心管架上。吸取1000 μl已液化好的痰液標(biāo)本加入到相應(yīng)編號的離心管中。15 000×g離心8 min，將上清液倒掉，加入1.0 ml生理鹽水，混勻；15 000×g離心8 min，倒掉上清液，用加樣槍將剩余上清液吸棄干凈，加50 μl稀釋液，旋渦振蕩混勻。置于分枝桿菌細胞超聲破碎儀中處理15 min。15 000×g離心5 min，上清液即為制備好的RNA。取2 μl提取好的RNA加入含30 μl擴增檢測液的潔凈微量反應(yīng)管中，放置于恒溫干浴器內(nèi)，60 ℃ 10 min，42 ℃ 5 min，加入SAT酶。上機檢測，擴增工作程序(42 ℃ 1 min，40個循環(huán)，每分鐘采集一次熒光，選取FAM通道。分析條件設(shè)定與結(jié)果判讀：根據(jù)分析后圖像調(diào)整基線和閾值線。樣本曲線與閾值線交點的橫坐標(biāo)讀數(shù)(Ct)<40的樣本為陽性，Ct值≥40或無數(shù)值的為陰性。

5. 恒溫擴增法[6]：用一次性吸管吸取 200 μl(濃痰 100 μl)的痰液加入到樣品管中，混勻。100 ℃恒溫處理 10 min，取出樣品管，冷卻至室溫。取下吸附管的管帽，將樣品管順時針旋入吸附管，將液化液和吸附劑充分混勻，平放靜置 1 min。吸附管橫向，靠近濾嘴端將折斷鍵折斷，濾嘴朝下，用手擠壓吸附管，將液滴擠入離心管中備用。將模板 DNA加入到對應(yīng)的反應(yīng)管中，瞬時(5 s)離心混合以上試劑。打開恒溫擴增熒光檢測儀，按程序擴增，報告結(jié)果。

6. 熔解曲線方法[7-8]：(1)核酸提取，為使用恒溫擴增法處理樣本后剩余核酸。(2)試劑配制，取出相應(yīng)藥物試劑盒平衡至室溫溶解，將MixA、MixB(PCR反應(yīng)體系包含：Mg2+、引物、dNTP等)旋渦振蕩充分混勻，分別吸取19.6 μl MixA、MixB與0.4 μl 酶液(逆轉(zhuǎn)錄酶、T7聚合酶)混合加入八連管。在相應(yīng)管中加入5 μl提取的DNA，瞬時(5 s)離心混合，彈去氣泡，上機檢測并進行結(jié)果判讀及分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析及ROC曲線繪制，計數(shù)資料使用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析其余4種試驗的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、符合率、Kappa值。同時分析涂陽、涂陰肺結(jié)核患者中的各分子生物學(xué)方法的陽性率。

結(jié) 果

1. 4種分子生物學(xué)方法的檢測效能：以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，4種臨床常用分子生物學(xué)方法比較，恒溫擴增法的敏感度低于GeneXpert MTB/RIF，高于FQ-PCR、SAT-RNA等其他兩種試驗，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。ROC曲線中，GeneXpert MTB/RIF的曲線下面積最大(0.910)，隨后依次為恒溫擴增法(0.860)、FQ-PCR法(0.854)、SAT-RNA法(0.789)。以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，4種檢測方法在臨床有較好的診斷價值，見圖1。4種檢測方法在痰涂片陽性肺結(jié)核患者中，恒溫擴增法陽性率為89.23%(58/65)，低于GeneXpert MTB/RIF法的93.85%(61/65)，高于FQ-PCR法的73.85%(48/65)及SAT-RNA法的64.62%(42/65)；在痰涂片陰性肺結(jié)核患者中，恒溫擴增法陽性率為22.34%(65/291)，低于GeneXpert MTB/RIF法的34.36%(100/291)，高于FQ-PCR法的21.31%(62/291)及SAT-RNA法的14.43%(42/291)。

2. 恒溫擴增法陽性核酸標(biāo)本耐藥基因檢測結(jié)果：121份恒溫擴增法陽性核酸標(biāo)本用熔解曲線法檢測對利福平耐藥的ropB基因，其中dt值在15～25之間共36份，26～30之間共31份，31～35之間共21份，36～45之間共33份，可發(fā)現(xiàn)當(dāng)恒溫擴增法陽性核酸熒光信號出現(xiàn)的時間dt值(1dt=1 min)>30時ropB耐藥基因的檢出率較低，dt值<30時ropB耐藥基因的檢出率均在90%以上。恒溫擴增法提取的原始核酸和稀釋5倍后核酸比較，稀釋后核酸dt值15～25時ropB耐藥基因的檢出率高于原核酸，dt值26～30時則檢出率低于原核酸(表2)。

圖1 GeneXpert MTB/RIF法、FQ-PCR法、SAT-RNA法、恒溫擴增法ROC曲線圖

表1 不同分子生物學(xué)檢測方法效能比較

表2 不同dt值對利福平耐藥的ropB基因檢出率

討 論

目前應(yīng)用于結(jié)核病檢測的分子生物學(xué)方法很多，恒溫擴增法具有快速、簡單、不需要大型儀器等特點，普遍應(yīng)用于結(jié)核病定點醫(yī)院。本研究通過對比4種不同的分子生物學(xué)方法，研究恒溫擴增法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值。

本研究比較了4種分子生物學(xué)方法的檢測效能，結(jié)果顯示恒溫擴增法的敏感度優(yōu)于傳統(tǒng)FQ-PCR法，因在恒溫擴增法中DNA解鏈?zhǔn)冀K處于單鏈狀態(tài)，擴增過程持續(xù)進行，不需要傳統(tǒng)PCR解鏈、退火、延伸的步驟，所以恒溫擴增法的擴增效率高于傳統(tǒng)FQ-PCR法，并且反應(yīng)的時間更短。恒溫擴增法敏感度優(yōu)于SAT-RNA法，在RNA恒溫擴增中RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，通過T7 RNA多聚酶等作用又形成新的RNA，RNA恒溫擴增的擴增狀態(tài)同樣一直持續(xù)進行，但RNA存在于活的結(jié)核分枝桿菌中[10]，這可能是SAT-RNA法敏感度低于恒溫擴增法的原因。恒溫擴增法敏感度低于GeneXpert MTB/RIF法，GeneXpert MTB/RIF法是基于傳統(tǒng)PCR擴增的半巢式PCR法，該方法因其技術(shù)特點能夠?qū)颖局械牡涂截惸康幕蜻M行有效的擴增，能夠檢出標(biāo)本中低水平結(jié)核分枝桿菌，使得GeneXpert MTB/RIF法的敏感度高于恒溫擴增法[11]。

關(guān)于4種分子生物學(xué)檢測方法在痰涂片陽性及陰性肺結(jié)核患者中的檢出率，本研究對痰涂片陽性及痰涂片陰性患者的痰標(biāo)本進行恒溫擴增法檢測，其陽性檢出率均高于FQ-PCR法及SAT-RNA法，均低于GeneXpert MTB/RIF法，這與各種方法的原理有關(guān)，恒溫擴增法在痰涂片陽性及陰性肺結(jié)核患者中均具有較好的應(yīng)用價值。

通過ROC曲線下面積分析4種分子生物學(xué)檢測方法的診斷效能，以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，4種檢測方法在臨床有較好的診斷價值。其中恒溫擴增法的曲線下面積大于FQ-PCR法，診斷價值相對于FQ-PCR法更好。馬曉光等[6]的研究顯示，恒溫擴增法與痰培養(yǎng)結(jié)果具有高度的一致性。本研究中，4種分子生物學(xué)方法與痰培養(yǎng)均具有較高的符合率和一致性，說明恒溫擴增法與傳統(tǒng)培養(yǎng)及其他臨床常用的分子診斷方法均具有較好的診斷效能。

近年來針對結(jié)核病病原學(xué)診斷方法較多，尤其在分子生物學(xué)檢測方法方面，包括分枝桿菌檢測及相關(guān)耐藥基因檢測。因傳統(tǒng)培養(yǎng)及藥敏時間需要1.5個月甚至更久，耐藥基因的檢測對于早期發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病有重要價值[7，12]。本研究中使用的恒溫擴增法，雖然僅能夠?qū)Σ≡M行檢測，但該試驗中提取的核酸是否能夠應(yīng)用于耐藥基因檢測，是此次研究的目的。不同的核酸提取方法[13-14]對細菌核酸提取的效率不同，恒溫擴增法采用化學(xué)裂解、高溫煮沸、雜質(zhì)吸附等步驟進行核酸提取，應(yīng)用于耐藥基因檢測具有一定可操作性。研究以試驗中dt值為標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)估提取核酸中結(jié)核分枝桿菌基因拷貝數(shù)，以不同dt值進行分組，分析不同結(jié)核分枝桿菌基因拷貝數(shù)對耐藥基因檢測的影響。試驗結(jié)果可以看出dt值<35時，提取的原核酸是可以檢測到ropB耐藥基因片段的。dt值在31～35時，ropB耐藥基因檢出率僅為9.52%，基因拷貝數(shù)在此范圍內(nèi)較低，臨床檢驗中若使用恒溫擴增法提取的核酸進行耐藥基因檢測時不應(yīng)當(dāng)考慮此范圍的標(biāo)本，避免試劑成本的浪費。dt值在15～30時，ropB耐藥基因檢出率均高于90%?？紤]到恒溫擴增法提取核酸為化學(xué)及高溫裂解等原理，核酸純度不夠，可能存在大量的鹽離子物質(zhì)，以及高的基因拷貝數(shù)等因素影響耐藥基因檢測的PCR反應(yīng)。本研究同時對原核酸標(biāo)本進行了5倍稀釋，結(jié)果顯示dt值在15～25時，稀釋后的核酸ropB耐藥基因檢出率明顯高于原核酸，這得益于核酸的稀釋降低了鹽離子物質(zhì)濃度，以及提供了合適的模板濃度。dt值在26～30時，稀釋后的核酸ropB耐藥基因檢出率略低于原核酸，可能是核酸稀釋后模板濃度降低所致。研究結(jié)果提示，在不同的dt值條件下可以適當(dāng)?shù)叵♂尯怂針颖具M行檢測，提高耐藥基因檢出率，同時也可節(jié)約試劑和人工等成本。

綜上所述，通過與各種檢測技術(shù)比較，恒溫擴增法具有臨床應(yīng)用價值，并適用于基層醫(yī)院的結(jié)核病診斷。