PACAP38及其受體PAC1在偏頭痛作用中的研究進展

張井艷，吳欣彤，郭 雪綜述，陳金波審校

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide ，PACAP)是一種神經(jīng)活肽類物質(zhì) ，屬于血管活性腸肽(VIP )-胰高血糖素-生長激素釋放因子-促胰液素超家族。由位于染色體18上的ADCYAP1基因編碼，并以兩種生物活性形式存在：38個氨基酸形式(PACAP38)和截短的27個氨基酸形式(PACAP27)。在哺乳動物中，最普遍的形式是PACAP38[1]。PACAP38的作用是通過三個G蛋白偶聯(lián)受體(PAC1，VPAC1-2)介導(dǎo)的。 PACAP及其相關(guān)受體廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織中，包括與偏頭痛相關(guān)的疼痛傳遞途徑的幾個區(qū)域，例如三叉神經(jīng)節(jié)(TG)和三叉尾神經(jīng)核(TNC)[2]。關(guān)于偏頭痛的機制仍有很多待闡明，但最近的注意力集中在信號分子PACAP38上。PACAP38是一種能夠在沒有先兆的偏頭痛患者中誘發(fā)偏頭痛發(fā)作的血管擴張劑。PACAP38對PAC1受體的選擇性高親和力使該受體成為偏頭痛治療的高度有趣且潛在的新靶標(biāo)。

1 PACAP38和PAC1

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)是1989年由Arimura和他的團隊從綿羊下丘腦組織中分離出的一種新的神經(jīng)肽，它能刺激大鼠垂體前葉細(xì)胞培養(yǎng)物中腺苷酸環(huán)化酶的產(chǎn)生。其主要存在形式PACAP38的N末端序列(1-28)與血管活性腸多肽(VIP)具有近70%的同源性，但PACAP38的腺苷酸環(huán)化酶的刺激活性至少是VIP的1000倍。PACAP38在進化過程中一直是保守的，它的氨基酸序列在哺乳動物中都是相同的[3]。PACAP38存在于三叉神經(jīng)節(jié)的一級神經(jīng)，三叉神經(jīng)尾核(TNC)的二級神經(jīng)元和人脊髓的背角。此外，PACAP38還在耳神經(jīng)節(jié)和碟腭神經(jīng)節(jié)，以及大腦皮層，小腦，腦干和下丘腦中被發(fā)現(xiàn)[2]。PACAP38的作用是通過三個G蛋白偶聯(lián)受體(PAC1，VPAC1，VPAC2)介導(dǎo)的，其中兩個(VPAC1-2)對PACAP38和VIP具有相同的親和力，而PAC1受體對PACAP38和VIP的親和力更高。在三叉神經(jīng)，耳神經(jīng)和頸上神經(jīng)節(jié)以及腦膜和腦膜動脈中都記錄了所有三種受體的分布[4]。

1.1 PACAP38的藥理特征 垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽 (PACAP)，是一種神經(jīng)活肽類物質(zhì) ，屬于稱為血管活性腸肽(VIP )-胰高血糖素-生長激素釋放因子-促胰液素超家族。由位于染色體18上的ADCYAP1基因編碼。最初表達(dá)成為一個前蛋白，然后被加工形成一個38個氨基酸的肽(PACAP38)，該肽具有一個裂解酰胺化位點，可以產(chǎn)生一個27個殘基酰胺化的片段(PACAP27)。在哺乳動物中，最普遍的形式是PACAP38[1]。Gr?nde等[5]的研究表明PACAP38舒張顱腦血管的作用在人和大鼠兩個物種之間沒有顯著差異，并且其在大鼠大腦中動脈MCA的遠(yuǎn)腔面應(yīng)用可產(chǎn)生強烈的血管舒張反應(yīng)，而在管腔應(yīng)用則無效。PACAP38是一個脂溶性較小的大分子，其PACAP38的流入常數(shù)(Ki)為2.86 μl/g/min。Banks及其同事[6]首先證明PACAP都可以穿越血腦屏障(BBB)主動轉(zhuǎn)運，它部分可能會被外排泵降解或返回，但其通過血腦屏障的轉(zhuǎn)運量足以影響腦功能。PACAP38通過飽和的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入大腦的速度卻比PACAP27快30%以上且PACAP38對大腦內(nèi)的降解更具抵抗力。有趣的是，PACAP38的通透性隨血液中PACAP38濃度的增加而降低。在小鼠或大鼠中進行的臨床前研究一致表明PACAP38通過位于內(nèi)皮中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)6(PTS-6)通過血腦屏障，但PACAP38不能以足夠的量穿過內(nèi)皮以激活動脈壁平滑肌細(xì)胞中的受體[7]。PACAP38在血液中的半衰期短，外周給藥效果不佳。Nonaka等[8]的研究表明鼻內(nèi)(i.n.)施用后，放射性標(biāo)記的PACAP38可以進入大腦，并且他們發(fā)現(xiàn)i.n.中包含的三種環(huán)糊精中的每一種注射產(chǎn)生I-PACAP在大腦區(qū)域之間的獨特分布模式。例如，β-環(huán)糊精大大增加了枕葉和下丘腦的攝取，α-環(huán)糊精增加了嗅球的攝取，而枕葉和紋狀體的攝取減少，(2-羥丙基)-β-環(huán)糊精增加了丘腦的攝取同時減少紋狀體的攝取。這些結(jié)果表明，可通過鼻內(nèi)給藥將治療量的PACAP遞送至大腦，并且環(huán)糊精可用于將肽治療性靶向特定大腦區(qū)域。

1.2 PACA1的藥理特點 PACA 1屬于B類GPCR，它在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)。GPCR的共同基本結(jié)構(gòu)是由三個細(xì)胞內(nèi)和三個細(xì)胞外環(huán)束縛的七螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域(7TM)。B類GPCR具有由120至160個殘基組成的N末端胞外域(ECD)，這對于識別肽配體的C末端區(qū)域至關(guān)重要[9]。與大多數(shù)具有相對較小的細(xì)胞外N末端結(jié)構(gòu)域的A類GPCR不同，B類受體已經(jīng)進化出大的ECD，以捕獲肽配體以呈現(xiàn)給7TM中的正構(gòu)受體激活位點。如今較為認(rèn)可的模型中，肽段的α螺旋C末端區(qū)域與B類GPCR的ECD域結(jié)合，從而允許將肽段N末端呈遞到7TM域內(nèi)的正構(gòu)位點，從而引起受體激活[10]。 ECD的開放構(gòu)象使PACAP結(jié)合位點更暴露于細(xì)胞外環(huán)境，因此更易于用于PACAP結(jié)合。在結(jié)構(gòu)上，PAC1R在跨膜結(jié)構(gòu)域中與VPAC1R和VPAC2R共享近60%的序列同一性。PACAP和VIP都以幾乎相等的高親和力與VPAC1R和VPAC2R結(jié)合[1]，而 PACAP與PAC1受體具有高親和力和特異性。Warfvinge K等[2]的研究發(fā)現(xiàn)整個大腦，小腦和腦干的許多區(qū)域都有PACAP-38和PAC1受體免疫活性的豐富表達(dá)。表達(dá)模式指向多種功能，包括與疼痛和對疼痛的反應(yīng)有關(guān)，但VPAC1和VPAC2受體免疫活性的表達(dá)非常稀疏。

1.3 PACAP38 及其PAC1受體的生理作用 PACAP38是在三叉神經(jīng)感覺和副交感神經(jīng)周圍血管中發(fā)現(xiàn)的一種強血管擴張劑。PACAP38以極高的親和力與PAC1結(jié)合[1]。PAC1受體激活后與Gs雙重偶聯(lián)以刺激腺苷酸環(huán)化酶(AC)，而后于Gq雙重刺激磷脂酶C(PLC)的激活。 細(xì)胞中cAMP的增加可以刺激蛋白激酶A(PKA)/ EPAC途徑，這些途徑可以相交并增強MEK / ERK信號傳導(dǎo)。 PAC1R的激活和β-arrestin的募集還導(dǎo)致受體的內(nèi)化作用以及用于長期MEK / ERK信號傳導(dǎo)的內(nèi)體信號傳導(dǎo)平臺的形成[11]。

2 偏頭痛

偏頭痛是臨床常見的原發(fā)性頭痛，其特征是發(fā)作性，多為偏側(cè)，中重度、搏動樣頭疼，一般持續(xù)4～72 h，可伴有惡心、嘔吐，光、聲刺激或日?；顒泳杉又仡^痛。被世界衛(wèi)生組織列為全球第七大致殘性疾病，在世界范圍內(nèi)患病率為11.7%，而在中國則為9.3%[12]?？煞譃闊o先兆偏頭痛、有先兆偏頭痛和慢性偏頭痛等。與偏頭痛相關(guān)的疼痛通常發(fā)生在額部，顳部，頂葉，枕部和較高的頸椎區(qū)域。世界比較公認(rèn)的機制其一是[13]：在三叉神經(jīng)節(jié)(TG)中存在豐富的傷害性神經(jīng)纖維叢，支配著腦膜，蛛網(wǎng)膜和硬腦膜血管，以及大的腦動脈這些顱內(nèi)結(jié)構(gòu)。這些傷害感受神經(jīng)纖維的軸突末端包含血管活性神經(jīng)肽，包括降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)，P物質(zhì)(SP)，神經(jīng)激肽A(NKA)，血管活性腸肽(VIP)和垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽( PACAP)?？傊谄^痛中，含有血管活性神經(jīng)肽的神經(jīng)纖維由于被激活從而導(dǎo)致血管活性腸肽的釋放，該肽特別能支配顱腦血管，引發(fā)偏頭痛。

2.1 偏頭痛和CGRP 降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是血管活性神經(jīng)肽的一種。在過去的十年中，通過臨床研究已牢固確立了CGRP在偏頭痛病理生理中的作用。 CGRP的輸注可以誘發(fā)偏頭痛，而CGRP受體拮抗劑可以改善偏頭痛。CGRP阻滯是偏頭痛患者的新治療靶標(biāo)[14]。此外很多類似隨機雙盲安慰劑對照試驗表明CGRP受體拮抗劑能確切的中止急性偏頭痛發(fā)作[1 5]。目前關(guān)于CGRP拮抗劑對偏頭痛治療主要討論在于其抗體能否通過血腦屏障，及其如何更好的通過血腦屏障。Edvinsson等[16]認(rèn)為位于BBB之外的三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)在偏頭痛癥狀中具有關(guān)鍵作用，它可能是成功終止偏頭痛的新型CGRP藥物所針對的。

2.2 PACAP38 及其PAC1受體與CGRP的關(guān)系 血管活性神經(jīng)肽CGRP和PACAP都被認(rèn)為[17，18]是三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)在刺激后從支配硬腦膜的傷害性纖維中釋放出來的，從而導(dǎo)致硬腦膜血管舒張。這兩種肽的特征和功能非常相似：例如它們是有效的血管擴張劑，并且可以在傷害感受和神經(jīng)源性炎癥的傳遞中起作用。Warfvinge等[2]的研究還發(fā)現(xiàn)在大腦皮層，三叉神經(jīng)尾狀核，下丘腦和腦橋等多個區(qū)域中，Eftekhari等[19]的研究發(fā)現(xiàn)PACAP38與CGRP兩種神經(jīng)肽共定位在三叉神經(jīng)節(jié)中。其次CGRP和PACAP都作用于共享一個稱為受體活性修飾蛋白1(RAMP1)的輔助亞基的受體[20]。以此推斷這兩種神經(jīng)肽可以共享一些生物級聯(lián)反應(yīng)，但是PACAP誘導(dǎo)的偏頭痛發(fā)作也表明了PACAP在偏頭痛的發(fā)生中具有獨立的作用。

3 PACAP38、PAC1受體和偏頭痛

3.1 PACAP38 及其PAC1受體在偏頭痛動物實驗中的研究 目前常用的大鼠炎癥湯偏頭痛模型主要有弗氏完全佐劑和配方炎癥湯兩類。在K?rtési等[21]的研究中，大鼠口面注射弗氏完全佐劑(CFA)激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(TS)制造偏頭痛模型，導(dǎo)致三叉尾核(TNC)中大量CGRP和PACAP38釋放。注射CFA后72 h，神經(jīng)肽的水平達(dá)到最大值，并與面部異常性疼痛峰值相對應(yīng)。Han等[22]通過反復(fù)重復(fù)炎性湯進行硬腦膜刺激，建立了大鼠慢性偏頭痛的大鼠模型。研究表明血漿和三叉神經(jīng)節(jié)中PACAP38水平顯著降低，三叉神經(jīng)節(jié)中PAC1受體表達(dá)顯著增加，而三叉神經(jīng)尾核中沒有，并且VPAC1和VPAC2的表達(dá)沒有顯著差異。Zhang等[23]刺激有意識的大鼠硬腦膜建立了一種新型的重復(fù)性電刺激模型，發(fā)現(xiàn)電刺激增加了三叉神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)尾核中CGRP，PACAP和PAC1的表達(dá)。Hensley等[24]用免疫組化驗證了免疫活性物質(zhì)出現(xiàn)在了大鼠和人類的蝶腭神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元細(xì)胞體和三叉神經(jīng)脊束核，而三叉神經(jīng)節(jié)和硬腦膜血管中未檢測到染色。而大鼠和人類的原位雜交也顯示蝶腭神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元和三叉神經(jīng)脊束核中出現(xiàn)了較強的mRNA信號，在三叉神經(jīng)核中的信號較弱，在硬腦膜血管中無信號。Syed等[25]的一項離體研究發(fā)現(xiàn)PAC1拮抗劑逆轉(zhuǎn)了大鼠MMA中PACAP38誘導(dǎo)的血管舒張。此外，在體內(nèi)大鼠模型中，在靜脈內(nèi)注射AMG (301PAC1拮抗劑)抑制了三叉神經(jīng)-頸神經(jīng)復(fù)合體的誘發(fā)傷害活性，其結(jié)果與舒馬普坦所觀察到的抑制作用相當(dāng)[26]?？傮w而言，動物研究證實PACAP38會誘導(dǎo)血管舒張，同時以上數(shù)據(jù)也支持了PAC1受體在三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)中的作用，及其PACAP38會誘導(dǎo)血管舒張這些作用很可能是通過激活PAC1受體發(fā)揮的。

3.2 PACAP38 及其PAC1受體在偏頭痛臨床醫(yī)學(xué)中的研究 Birk等[27]進行了PACAP38對人腦血流動力學(xué)影響的首次研究，表明PACAP38輸注在健康受試者和偏頭痛患者中均引起頭痛和血管舒張，并且在偏頭痛患者中，PACAP38的輸注引起延遲的偏頭痛樣發(fā)作。Tuka等[28]用放射免疫測定法研究表明，和健康者相比偏頭痛患者血漿的PACAP38樣免疫反應(yīng)物質(zhì)在發(fā)作間期有顯著性降低，而在發(fā)作期確升高。Zagami等[29]用放射免疫測定法研究也同樣表明中度或重度偏頭痛患者在頭痛發(fā)作期間頸外靜脈PACAP38升高，而舒馬普坦6 mg治療后1 h開始減少。以上研究表明PACAP38和偏頭痛的發(fā)作有密切的關(guān)系。

Amin等進行的兩項人類MR血管造影術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在健康志愿者[30]和偏頭痛患者[31]中，靜脈輸注PACAP38對大腦中動脈(MCA)的功能沒有影響，但對腦膜中動脈(MMA)的持續(xù)擴張持續(xù)了17%～19%和2 h。有趣的是，體外研究報道了在腦膜和腦動脈中都存在PACAP受體。因此，我們推測MMA的選擇性擴張而不是MCA的擴張最有可能是靜脈內(nèi)施用的PACAP38沒有穿過血腦屏障。但Amin進一步的研究發(fā)現(xiàn)在PACAP38誘發(fā)偏頭痛發(fā)作之前和期間記錄了靜息狀態(tài)功能性MRI，發(fā)現(xiàn)PACAP38誘導(dǎo)的偏頭痛發(fā)作與大腦幾個大型功能網(wǎng)絡(luò)的連通性改變有關(guān)[32]。

偏頭痛發(fā)作之前通常會出現(xiàn)藥理上可能引起的先兆癥狀(PS)。Guo等[33]的臨床研究表明PACAP38可以誘導(dǎo)偏頭痛發(fā)作患者產(chǎn)生先兆癥狀(PS)，在發(fā)作患者中占到了48%。但在PACAP38輸注后未誘導(dǎo)偏頭痛發(fā)作的患者中也產(chǎn)生了先兆癥狀，同時不會在發(fā)作患者中誘發(fā)更多的PS。這表明PACAP38對先兆癥狀的誘導(dǎo)并不是誘發(fā)偏頭痛的必要機制。其次，PACAP在主動穿越BBB后迅速降解或運回[6]，因此，前兆癥狀有可能通過不受BBB保護的中央結(jié)構(gòu)的激活來介導(dǎo)。

除了持續(xù)的血管舒張外，肥大細(xì)胞脫粒也被認(rèn)為是PACAP38偏頭痛的誘發(fā)機制之一。然而在偏頭痛患者中未觀察到肥大細(xì)胞脫粒的外周血標(biāo)志物變化[34]。Vollesen等[35]進行了一項雙盲隨機安慰劑對照的雙向轉(zhuǎn)換研究。給予無先兆性偏頭痛的患者H1-抗組胺藥氯馬斯汀靜脈輸注預(yù)處理，隨后靜脈輸注PACAP38，在輸注開始后每隔10 min至90 min記錄偏頭痛/頭痛的特征，并收集血液以研究PACAP 38注入前后的肥大細(xì)胞脫粒以及炎癥標(biāo)志物類胰蛋白酶和INF-α。結(jié)果發(fā)現(xiàn)H1-抗組胺藥氯馬斯汀預(yù)處理無法預(yù)防PACAP38誘導(dǎo)的偏頭痛或頭痛，胰蛋白酶和INF-α在PACAP 38注入前后也無顯著性變化。因此我們推測在PACAP38誘導(dǎo)的偏頭痛中降低組胺釋放或肥大細(xì)胞脫粒的作用的可能性較小。所以在三叉神經(jīng)受到刺激后，神經(jīng)活肽類物質(zhì)PACAP38釋放并發(fā)揮舒張血管作用，進而引起硬腦膜和皮層血管的血管舒張，誘發(fā)偏頭痛的機制仍占主導(dǎo)地位。接下來仍需要我們可以通過進一步的臨床和動物實驗研究來發(fā)現(xiàn)PACAP38擴血管作用參與的分子機制。

4 展 望

偏頭痛是世界第七大致殘性疾病。最近，在臨床試驗中，阻斷降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)信號通路的小分子和治療性抗體減少了偏頭痛的發(fā)生并中止了偏頭痛的急性發(fā)作，并為發(fā)作性和慢性偏頭痛患者提供了預(yù)防。異質(zhì)性存在于每次診斷和患者對治療的反應(yīng)中，這表明偏頭痛是可能由多種機制激活的最終通用途徑，例如，并非所有偏頭痛發(fā)作都對抗CGRP藥理學(xué)干預(yù)有反應(yīng)或被預(yù)防。因此，偏頭痛發(fā)病機制的其他獨特機制可能會為藥物開發(fā)提出新的目標(biāo)。

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽38(PACAP38)是一種神經(jīng)活肽類物質(zhì)，引起了大家的廣泛關(guān)注，是治療偏頭痛的有吸引力的新型靶標(biāo)。在這里，我們回顧了PACAP38在偏頭痛的病理生理中的作用，以及涉及PAC1受體作為偏頭痛未來藥物靶點的數(shù)據(jù)。Loomis等[36]生成了對PACAP38和PACAP27都具有反應(yīng)的特異性、高親和力、中和性的單克隆抗體ALD1910。在體外，ALD1910通過VPAC1和VPAC2受體以及PAC 1受體有效拮抗PACAP38信號傳導(dǎo)。ALD1910識別PACAP內(nèi)的一個非線性表位并阻斷其與細(xì)胞表面的結(jié)合。為了測試針對內(nèi)源性PACAP38的ALD1910拮抗特性，我們開發(fā)了傘形酮誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)源性血管舒張和副交感性流淚模型。在體內(nèi)，該模型證明ALD1910的拮抗活性是劑量依賴性的，在低至0.3 mg/kg的劑量下仍保持效力。這些結(jié)果表明ALD1910代表潛在的治療性抗體，以解決PACAP38介導(dǎo)的偏頭痛。

盡管動物實驗和臨床實驗研究都表明PACAP38的輸注可以誘發(fā)偏頭痛，但目前尚無確鑿證據(jù)表明，PACAP38的外源性輸注后，其會通過BBB然后導(dǎo)致腦功能和腦血管改變直接來誘發(fā)偏頭痛。因此，PACAP38偏頭痛的誘導(dǎo)作用可能是由周圍機制引起的，有一種可能性是通過誘發(fā)腦膜變化或影響顱腦血管中缺乏BBB的傷害感受器引起的。 所以迫切需要未來先進的體內(nèi)人類研究和使用放射性標(biāo)記示蹤劑探索PAC1受體抗體，以闡明PACAP如何以及在何處導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)展。

在這里，我們回顧了垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽38(PACAP38)在偏頭痛的病理生理、藥理中的作用，以及涉及PAC1受體作為偏頭痛未來藥物靶點的數(shù)據(jù)。 關(guān)于偏頭痛的病理生理學(xué)還有很多尚待充分闡明， PACAP38對PAC1受體的選擇性親和力使該受體成為偏頭痛治療的高度有趣且潛在的新靶標(biāo)。 該受體拮抗作用的有效性應(yīng)在隨機臨床試驗中有很大的研究意義，并有望和CGRP一樣成為治療偏頭痛的重要靶標(biāo)。