表面等離子共振技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用

王永智 葉華躍 聶利芳 吳宏斌 邱文娜 方朝東 雷高新 曾瑋喬

1.泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，江蘇泰州225300；2.江蘇華泰疫苗工程技術(shù)研究有限公司，江蘇泰州 225300；3.江蘇大同盟制藥有限公司，江蘇泰州225300

1 表面等離子共振技術(shù)的發(fā)展歷史及研究進(jìn)展

1902年R.W.Wood[1]在一次光學(xué)實(shí)驗(yàn)中觀察并記錄了金屬光柵的異常衍射現(xiàn)象，他稱之為“Wood異?！?，這是人們首次記錄的表面等離子共振（surface plasmon renounce，SPR）現(xiàn)象。1941年U.Fano依據(jù)金屬和空氣界面上表面電磁波的激發(fā)原理首次成功解釋了SPR現(xiàn)象[2]。Kretschmann于1971年提出Kretschmann結(jié)構(gòu)為SPR生物傳感器奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也促成了SPR技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用[3]。1983年，Liedberg等首次利用SPR進(jìn)行IgG與其抗原的反應(yīng)測定并取得了成功。1987年，Knoll等開始進(jìn)行SPR成像研究，1990年，Biacore AB公司推出了首臺(tái)商用SPR儀器，使SPR技術(shù)的應(yīng)用研究得到了更快速的發(fā)展[4]。

SPR的原理為當(dāng)一束單色偏振光透過玻璃照射到鍍?cè)诓ＡП砻娴慕鸹蜚y薄膜時(shí)，自由電子在金屬和玻璃介質(zhì)表面積聚，產(chǎn)生表面極化電荷。表面電荷的集體震蕩便產(chǎn)生了表面等離子體波（surface plasmon wave，SPW）。產(chǎn)生表面等必須將入射光與表面等離子波通過耦合器件進(jìn)行耦合，使二者發(fā)生共振，當(dāng)表面等離子波當(dāng)入射光的波向量與SPW的振蕩頻率相匹配時(shí)[5]，便產(chǎn)生了SPR現(xiàn)象。常用的耦合器件主要有棱鏡型[6]、光柵型[7]、光纖型[8-9]、光波導(dǎo)型[10]等，其中商品化的SPR儀器主要采用的是Kretschmann棱鏡結(jié)構(gòu)[10]。SPR發(fā)生后，SPW吸收了入射光的能量，反射光的能量則急劇下降以致完全消失，此時(shí)入射光的角度被稱作SPR角（共振角）。SPR角隨金屬薄膜附近介質(zhì)折射率變化而改變化，介質(zhì)折射率變化情況一般又會(huì)受到待測溶液中的物質(zhì)濃度的變化情況影響。因此通過測量SPR角的變化情況便可以反應(yīng)待測溶液中的一些產(chǎn)生反應(yīng)的情況[11-13]。

SPR技術(shù)主要的特點(diǎn)有[14-17]：（1）免標(biāo)記檢測。SPR 技術(shù)不需要標(biāo)記樣品或者對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理便可以檢測。這樣不僅保持了被檢測分子的性質(zhì)和狀態(tài)，而且避免了標(biāo)記過程對(duì)檢測結(jié)果的不利影響。同時(shí)方便了樣品處理，簡化了檢測流程。（2）實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析。SPR技術(shù)可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測分子相互作用的全過程，得到反應(yīng)速率及動(dòng)力學(xué)方程。（3）非破壞性檢測。SPR技術(shù)檢測過程不會(huì)對(duì)樣品造成任何化學(xué)或物理破壞。（4）高選擇、高靈敏性。利用生物識(shí)別、化學(xué)及物理識(shí)別等各種高特異性識(shí)別作用，需要樣品數(shù)量少。（5）應(yīng)用范圍廣。應(yīng)用SPR技術(shù)檢測分析的對(duì)象非常廣泛，既可以研究分子質(zhì)量很小的物質(zhì)（如金屬離子、氣體分子），又可以研究相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)數(shù)十萬的生物大分子（如蛋白質(zhì)）甚至細(xì)胞及病毒。

2 SPR技術(shù)的應(yīng)用

2.1 SPR技術(shù)在分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

生物分子發(fā)揮功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，生物分子結(jié)構(gòu)的維持取決于生物分子內(nèi)部集團(tuán)之間或者分子之間的各種相互作用力。生物分子之間特異地、可逆地識(shí)別及結(jié)合等相互作用是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。研究分子間的相互作用是生化領(lǐng)域的一個(gè)核心問題，它有助于闡明生物反應(yīng)的機(jī)制，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)[13]。SPR技術(shù)目前已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱門工具，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸及多糖等生物大分子之間的相互作用研究。

Margulies等[18]利用SPR技術(shù)分析了主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）與 抗 原 遞 呈 細(xì) 胞（antigen presenting cell，APC）遞呈的抗原（Ag）之間的相互作用、T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）與MHC/Ag之間的相互作用以及TCR與Ag之間相互作用的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。通過研究發(fā)現(xiàn)，TCR與MHC/Ag之間的相互作用具有親和力低、半衰期短的特點(diǎn)，表明通過短暫及低親和力的相互作用即可激活T淋巴細(xì)胞。

崔大付等[19]利用SPR技術(shù)建立了檢測6-氧甲基鳥嘌吟-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）的方法。MGMT是一種重要的DNA損傷修復(fù)酶，與DNA烷基化損傷修復(fù)密切相關(guān)[20]，對(duì)多種腫瘤具有重要的臨床意義[21-26]，MGMT的檢測可以為抗腫瘤藥物的開發(fā)、腫瘤的預(yù)防及治療方案提供依據(jù)。其建立的GMGT檢測方法檢測線可低至1.18×10-10mol/L，為進(jìn)一步推廣使用及臨床檢測的研究打下了基礎(chǔ)。

李雪玲等[27]利用SPR技術(shù)研究比較了抗酪氨酸磷酸化抗體與來源于胰島素樣生長因子Ⅰ受體（insulin-like growth factor 1，IGF-1R）的未磷酸化多肽序列及經(jīng)過含有相應(yīng)蛋白激酶的細(xì)胞裂解液處理后的多肽序列的相互作用差異。結(jié)果表明，抗酪氨酸磷酸化抗體與經(jīng)細(xì)胞裂解液在不同處理?xiàng)l件下（孵育時(shí)間不同、細(xì)胞裂解液成分不同）處理后的多肽序列相互之間作用存在明顯差異，可靈敏地區(qū)分出多肽酪氨酸磷酸化水平差異。胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF-1R）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與生物體細(xì)胞增殖、分化及抑制細(xì)胞凋亡等多種生理活動(dòng)密切相關(guān)，其建立的研究方法為受體磷酸化信號(hào)通路的研究提供了一種全新的手段。

2.2 SPR技術(shù)在環(huán)境污染檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著人類社會(huì)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，物質(zhì)和文明水平的不斷提高，環(huán)境污染問題也日趨嚴(yán)重。如何對(duì)環(huán)境污染物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測分析也越來越受到人們的重視[28]。選擇及開發(fā)適宜的環(huán)境污染物檢測技術(shù)，有助于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及科學(xué)性，甚至關(guān)系到環(huán)境污染評(píng)價(jià)及環(huán)境治理措施的制定[29-30]。SPR技術(shù)的出現(xiàn)及快速發(fā)展，因其具有檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高及檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，為環(huán)境污染物檢測提供了一種全新的方法，并逐步在環(huán)境污染檢測中得到越來越廣泛的應(yīng)用。

銅是動(dòng)植物生長必需的微量元素，通常以化合物的形式存在于環(huán)境之中[31]。環(huán)境中過量的銅則會(huì)導(dǎo)致銅在生物體內(nèi)積累而產(chǎn)生對(duì)動(dòng)植物體產(chǎn)生毒害作用，因此人們對(duì)銅造成的環(huán)境污染也特別關(guān)注[32]。Wenhua Wang等[33]利用改性殼聚糖（MCS）修飾的銀/金（Ag/Au）復(fù)合薄膜，研制了一種可重復(fù)使用的SPR傳感器，可實(shí)現(xiàn)銅離子的快速檢測。該研究采用四層Kretchmann半柱面棱鏡結(jié)構(gòu)，通過引入?yún)⒈裙馐?，提高了?shí)驗(yàn)系統(tǒng)的靈敏度和穩(wěn)定性。經(jīng)過優(yōu)化，MCS膜在傳感器芯片沖洗4次后的溶脹速率＜9×10-4/min，在MCS膜經(jīng)吸附Cu2+及多次沖洗后信號(hào)值下降＜1.5%。用0.5mmol/L的EDTA溶液對(duì)傳感器進(jìn)行5次洗脫后，洗脫率和容量率均在96%以上。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明該方法Cu2+的檢出限低至18ppb。

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）是存在于環(huán)境中的能干擾人類或動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)的外源性化學(xué)物質(zhì)[34]。內(nèi)分泌干擾物并不直接作為有毒物質(zhì)給生物體帶來毒害，而是通過擬激素或抗激素作用導(dǎo)致人類或動(dòng)物的內(nèi)分泌紊亂，甚至導(dǎo)致人類和動(dòng)物生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、生殖機(jī)能失常、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育延緩、智力損害甚至導(dǎo)致物種滅絕[35]。二噁英、多氯聯(lián)苯及諸多農(nóng)藥均屬于內(nèi)分泌干擾物。Shimomura等[36]利用SPR技術(shù)建立了一種基于競爭性免疫分析手段的快速測定2，3，7，8-四氯二苯并-對(duì)-二噁英（2，3，7，8-TCDD）、多氯聯(lián)苯（PCB）、除草劑阿特拉津的方法，三者的檢測限分別為0.1、2.5及5ng/mL，并且每個(gè)樣品分析時(shí)間僅需15min。

2.3 食品安全檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

俞婧等[37]基于SPR技術(shù)建立了快速測定豬肉中磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SM2）殘留的方法，該研究將SM2偶聯(lián)到傳感器芯片表面，通過優(yōu)化檢測條件，結(jié)果表明，建立的檢測方法在低（10μg/kg）、（20μg/kg）、高（100μg/kg）三個(gè)濃度水平的回收率為87.6%～107.4%。樣品檢測結(jié)果經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法確證，表明該方法可用于豬肉中SM2的快速篩查分析。

李輝等[38]利用實(shí)驗(yàn)室自行研制的SPR系統(tǒng)，通過化學(xué)偶聯(lián)，將萊克多巴胺衍生物固定于芯片表面，基于在一定濃度范圍內(nèi)的萊克多巴胺抗體與萊克多巴胺結(jié)合的響應(yīng)值呈線性關(guān)系的原理，經(jīng)過檢測條件的優(yōu)化，采用連續(xù)進(jìn)樣的檢測方法對(duì)萊克多巴胺進(jìn)行定量分析檢測。結(jié)果表明，該方法的檢測時(shí)間為15min，萊克多巴胺檢測限＜4μg/L，IC50值為8.5μg/L。并且通過觀察結(jié)合反應(yīng)傳感圖，發(fā)現(xiàn)萊克多巴胺的抗體與萊克多巴胺之間的結(jié)合反應(yīng)在檢測時(shí)間之內(nèi)遠(yuǎn)未達(dá)到飽和狀態(tài)。因此后期可通過延長反應(yīng)時(shí)間以擴(kuò)大萊克多巴胺檢測范圍，降低檢測限。

劉瑾等[39]利用SPR技術(shù)建立了牛奶中的氨芐青霉素殘留檢測方法，該研究從pH值、離子強(qiáng)度和配體濃度三個(gè)方面探討、優(yōu)化了氨芐青霉素-BSA固定至芯片表面的條件。通過檢測不同濃度的氨芐青霉素水溶液和牛奶溶液，最低檢測限分別達(dá)到了1.7ng/mL和1.8ng/mL，兩者均低于歐盟規(guī)定的最大檢出限4.1ng/mL，證明了該方法的可行性。

2.4 表面等離子體共振技術(shù)在藥物研究中的應(yīng)用

近年來，全球生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，新的生物藥分析檢測技術(shù)也層出不窮，SPR作為新興的生化分析檢測工具，憑借著其出色的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和高重復(fù)性，在藥物篩選、藥物作用機(jī)理研究、藥物評(píng)價(jià)等方面得到越來越廣泛的應(yīng)用[13]。

親環(huán)素A在許多細(xì)胞中發(fā)揮蛋白質(zhì)折疊伴侶及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)作用，有研究表明親環(huán)素A可通過與HIV-1 Gag蛋白相互作用并增強(qiáng)病毒的感染性。親環(huán)素A抑制劑如多環(huán)菌素A在體外可抑制HIV-1的復(fù)制[40]。Chen等[41]通過計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選及SPR分析技術(shù)，選擇了12種小分子化合物作為候選親環(huán)素A抑制劑。通過體外研究12種小分子化合物抑制親環(huán)素A酰脯氨酸順反異構(gòu)酶（peptidylprolyl cis-trans isomerase，PPIase）活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中五種化合物（FD5，F(xiàn)D8，F(xiàn)D9，F(xiàn)D10 and FD12）具有抑制PPIase及HIV-1感染的活性。

人血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質(zhì)，占了血漿所有蛋白總量的60%[42]，血清白蛋白能與許多內(nèi)源及外源性化合物結(jié)合，從而起到重要的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)作用[43]，藥物進(jìn)入人體后，與人血清白蛋白在體內(nèi)可產(chǎn)生不同程度的結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)藥效學(xué)和藥動(dòng)力學(xué)起著重要的作用[44]。Frostell等[45]將人血清白蛋白固定于芯片表面，利用SPR技術(shù)分析了19種藥物與血清白蛋白的結(jié)合作用，所得結(jié)果與已有報(bào)道一致。各藥物以單濃度進(jìn)樣（80mM），分析各個(gè)藥物與血清白蛋白結(jié)合作用，依據(jù)結(jié)合作用的強(qiáng)弱可將藥物分成高、中、低三個(gè)組。該研究建立的方法可實(shí)現(xiàn)24h內(nèi)篩選100個(gè)化合物，并且樣品消耗量低至8nmol。

在對(duì)抗體類生物類似藥與參照藥進(jìn)行比對(duì)研究時(shí)，抗體與抗原的親和力是質(zhì)量評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。稅雪等[46]利用表面等離子體共振技術(shù)比較分析了國產(chǎn)西妥昔單克隆抗體（Cetuximab）及國外已上市的西妥昔單抗Erbitux與重組人表皮生長因子受體（EGFR）的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，C225與Erbitux在與重組人EGFR的結(jié)合能力上，有相似的結(jié)合動(dòng)力學(xué)特性，為生物類似藥與參照藥比對(duì)研究評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。

3 SPR技術(shù)發(fā)展展望

自SPR技術(shù)出現(xiàn)以來，特別是自商品化的SPR分析儀投入市場以來，SPR技術(shù)就因其具有的獨(dú)特優(yōu)勢在分子生物學(xué)研究、環(huán)境污染物檢測、食品安全檢測、藥品研發(fā)等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用，SPR技術(shù)測定對(duì)象也已經(jīng)覆蓋了從小至金屬離子到大至病毒乃至細(xì)胞[47-48]。此外，SPR傳感器及分析儀研發(fā)也取得了長足的進(jìn)步，通過引入新的傳感方法[49]，進(jìn)行新的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)[7]，或在傳統(tǒng)分析儀的基礎(chǔ)上提高儀器的性能和實(shí)用性[50]。均有效提高了SPR分析儀的靈敏度和精度。筆者認(rèn)為SPR技術(shù)未來發(fā)展的方向除了繼續(xù)擴(kuò)大SPR技術(shù)檢測應(yīng)用領(lǐng)域以外，還要進(jìn)一步探索加快SPR技術(shù)與其他已有技術(shù)方法的聯(lián)用。Meyer等[51]將SPR技術(shù)與表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)（surface-enhanced raman scattering，SERS）結(jié)合起來，制作了SPR-SERS聯(lián)用儀并驗(yàn)證了該儀器應(yīng)用的可行性。其研究成果為SPR技術(shù)應(yīng)用開辟了全新的發(fā)展方向。SPR技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用也日趨廣泛，如SPR技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用可將SPR技術(shù)的藥物篩選、配體垂釣功能與質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)分析功能進(jìn)行整合，提高藥物篩選效率；SPR技術(shù)與電化學(xué)分析技術(shù)聯(lián)用，有助于大大提高檢測靈敏度，降低檢測限。除此之外，加大新型芯片的開發(fā)力度，降低分析物與芯片基質(zhì)表面的非特異性結(jié)合，提高分析的分辨率，開發(fā)更適宜小分子分析的芯片也將更加有力促進(jìn)SPR技術(shù)的應(yīng)用。