甲狀腺乳頭狀癌術(shù)前細(xì)針穿刺標(biāo)本核酸檢測(cè)BRAF V600E方法的探討

顧華敏 曹學(xué)全 楊朝暉 章輝 潘海

超聲引導(dǎo)下甲狀腺細(xì)針穿刺結(jié)合鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（BRAF）基因V600E突變檢測(cè)（簡(jiǎn)稱BRAF V600E檢測(cè)）可在甲狀腺乳頭狀癌的術(shù)前輔助診斷中發(fā)揮重要作用[1]。目前，許多三級(jí)醫(yī)院病理科開展了BRAF V600E檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)若直接刮取液基細(xì)胞切片上的腫瘤細(xì)胞用于檢測(cè)前的質(zhì)控會(huì)破壞原來的液基細(xì)胞切片，而直接使用穿刺組織提取核酸則無法進(jìn)行質(zhì)控，結(jié)果有一定的盲目性，不能排除假陰性。本研究對(duì)兩種不同方法獲取的突變檢測(cè)結(jié)果，以術(shù)后常規(guī)腫瘤組織標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，探討使用剩余標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的可行性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2018年5至12月本院甲狀腺乳頭狀癌細(xì)針穿刺標(biāo)本101例，分兩組，均收集細(xì)胞學(xué)液基細(xì)胞切片及液基細(xì)胞學(xué)制片剩余標(biāo)本、對(duì)應(yīng)術(shù)后常規(guī)腫瘤組織標(biāo)本。第一組82例，細(xì)胞學(xué)鏡下均找到乳頭狀癌細(xì)胞（常規(guī)手術(shù)后病理診斷均為甲狀腺乳頭狀癌），且癌細(xì)胞個(gè)數(shù)≥200個(gè)；其中男29例，女53例；年齡40～68（43.0±11.5）歲。第二組19例，細(xì)胞學(xué)結(jié)果為可疑濾泡性腫瘤，且腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)≥200個(gè)，其中男5例，女14例；年齡 35～57（42.0±12.3）歲。所有患者均無高血壓、冠心病、肝腎功能障礙、精神異常及長(zhǎng)期應(yīng)用藥物及其他腫瘤病史。

1.2 主要試劑 人類BRAF基因V600E突變檢測(cè)試劑盒（24測(cè)試/盒，批號(hào)：11218103002X），核酸（DNA）提取試劑盒（36測(cè)試/盒，批號(hào)：12218112101X）均購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 方法一 直接在細(xì)胞學(xué)液基細(xì)胞切片上刮取足夠腫瘤細(xì)胞提取核酸進(jìn)行BRAF V600E檢測(cè)，具體如下：直接在液基細(xì)胞切片背面用金剛筆圈出達(dá)到質(zhì)控要求的腫瘤細(xì)胞范圍，去掉蓋玻片，用二甲苯洗去中性樹膠，滴加吐溫20，再用一次性刀片刮取標(biāo)記組織，小心移至1.5ml EP管備用，并在液基細(xì)胞切片上留足支持細(xì)胞學(xué)診斷依據(jù)的腫瘤細(xì)胞；加入1ml無水乙醇，振蕩混勻10s，室溫下13 000×g離心2min，小心去除上清液（勿吸到沉淀）；室溫開蓋放置10min或37℃下開蓋放置5min，使乙醇充分揮發(fā)。后續(xù)操作同術(shù)后常規(guī)腫瘤組織樣本核酸提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法一致，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書，依次加入裂解緩沖液液、蛋白酶K、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液1、洗滌緩沖液2、洗脫緩沖液提取DNA；之后，使用紫外分光光度計(jì)ND5000（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）測(cè)定DNA濃度，DNA濃度光密度（OD）260/OD280介于1.8～2.1之間。使用美國(guó)ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為第一階段：95℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；第二階段：95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15 個(gè)循環(huán)；第三階段：93℃25s，60℃ 35s，72℃ 20s，31 個(gè)循環(huán)。信號(hào)收集：第三階段60℃時(shí)收集外控信號(hào)和內(nèi)控信號(hào)，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，保存文件。每批次PCR反應(yīng)中，每份樣品必須和陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性對(duì)照共同進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.3.2 方法二 先通過細(xì)胞學(xué)液基細(xì)胞切片進(jìn)行腫瘤細(xì)胞質(zhì)控評(píng)估，再用制作同例細(xì)胞學(xué)切片的剩余標(biāo)本提取核酸進(jìn)行BRAF V600E檢測(cè)：將對(duì)應(yīng)液基細(xì)胞學(xué)切片剩余標(biāo)本導(dǎo)入50ml試管中，2 000r/min離心10min（細(xì)胞室離心機(jī)），移去上清液，剩余1ml左右，用1 000μl移液槍轉(zhuǎn)移入1.5ml的EP管中，13 000×g離心2min，去除上清液；如有紅細(xì)胞，再加入1ml 0.9%氯化鈉溶液破紅，振蕩，13 000×g離心2min，打開離心管蓋子，室溫或56℃晾干，約10min；后續(xù)步驟操作同術(shù)后常規(guī)組織標(biāo)本核酸提取及PCR檢測(cè)方法一致。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩種方法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌突變率和兩種方法結(jié)果對(duì)比符合率比較采用χ2檢驗(yàn)，兩種方法檢測(cè)可疑濾泡性腫瘤突變率比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌中BRAF V600E突變率比較 方法一和方法二檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌中BRAF V600E突變率分別為75.6%（62/82）和73.2%（60/82），兩種方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.128，P＞0.05）。

2.2 兩種方法檢測(cè)細(xì)胞學(xué)結(jié)果為可疑濾泡性腫瘤中BRAF V600E突變率比較 方法一和方法二檢測(cè)細(xì)胞學(xué)結(jié)果為可疑濾泡性腫瘤中BRAF V600E突變率分別為 5.26%（1/19）和 5.26%（1/19），兩種方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。

2.3 兩種方法與對(duì)應(yīng)術(shù)后常規(guī)腫瘤組織標(biāo)本檢測(cè)BRAF V600E結(jié)果的符合率比較 方法一與對(duì)應(yīng)術(shù)后常規(guī)腫瘤組織標(biāo)本檢測(cè)BRAF V600E結(jié)果的符合率為100.00%（101/101）；方法二與對(duì)應(yīng)術(shù)后常規(guī)腫瘤組織標(biāo)本檢測(cè)BRAF V600E結(jié)果的符合率為98.02%（99/101）；兩種方法符合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.020，P＞0.05）。

3 討論

本文第一組是先通過細(xì)胞學(xué)明確找到乳頭狀癌細(xì)胞和術(shù)后常規(guī)病理診斷為甲狀腺乳頭狀癌的條件初篩標(biāo)本，再通過“細(xì)胞學(xué)液基細(xì)胞切片進(jìn)行質(zhì)控評(píng)估腫瘤細(xì)胞≥200個(gè)”標(biāo)準(zhǔn)入選標(biāo)本，再對(duì)同一患者細(xì)胞學(xué)液基細(xì)胞切片和其細(xì)胞學(xué)制片剩余標(biāo)本分別提取核酸進(jìn)行BRAF V600E檢測(cè)，比較結(jié)果，探討方法二的可行性。兩種方法對(duì)比試驗(yàn)共進(jìn)行3批次，共246人份，同一患者標(biāo)本，都同批加樣擴(kuò)增分析（實(shí)驗(yàn)條件完全一樣），雖然提取的核酸濃度不一，造成熒光PCR結(jié)果外控信號(hào)曲線升起早晚不一，但最后PCR定性結(jié)果82例中，方法一和方法二的突變率分別為75.6%和73.2%，與文獻(xiàn)報(bào)道的突變率結(jié)果一致[2-4]。

第二組是收集細(xì)胞學(xué)結(jié)果為可疑濾泡性腫瘤的患者，即非乳頭狀癌標(biāo)本，比較結(jié)果，探討方法二的可行性。兩種方法對(duì)比試驗(yàn)共進(jìn)行2批次，共57人份，同一患者標(biāo)本均同批加樣擴(kuò)增分析（實(shí)驗(yàn)條件完全一樣），雖然提取的核酸濃度不一，但熒光PCR結(jié)果外控信號(hào)曲線均為水平線，未出現(xiàn)典型上升曲線。其術(shù)后常規(guī)病理診斷為：甲狀腺腺瘤6例，甲狀腺腺瘤伴包膜侵犯3例，甲狀腺腺瘤樣增生結(jié)節(jié)2例，甲狀腺濾泡癌5例，甲狀腺微小浸潤(rùn)型濾泡癌2例，甲狀腺濾泡性乳頭狀癌1例，故本組結(jié)果中1例濾泡性乳頭狀癌發(fā)生突變。

在所有PCR定性結(jié)果101例中，方法一和方法二所提取核酸作BRAF V600E突變檢測(cè)結(jié)果作對(duì)比，結(jié)果顯示兩種方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但方法一會(huì)對(duì)原始細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性切片產(chǎn)生不可逆的破壞，而方法二既可以保留原始細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性切片作為細(xì)胞學(xué)診斷依據(jù)，又可以對(duì)預(yù)丟棄剩余標(biāo)本廢物利用達(dá)到檢測(cè)目的，指導(dǎo)臨床后續(xù)治療，具有一定的臨床價(jià)值。由于本研究樣本量有限，無法進(jìn)行大數(shù)據(jù)比對(duì)，但使用剩余標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)具有一定的可行性。

有研究顯示甲狀腺細(xì)針穿刺標(biāo)本中BRAF V600E突變檢測(cè)方法可靠，與細(xì)針穿刺結(jié)合能提高甲狀腺結(jié)節(jié)診斷的準(zhǔn)確性，同時(shí)可能有助于篩選出高危甲狀腺癌患者，更好地發(fā)揮BRAF V600E輔助診斷的作用[5-6]。但對(duì)于BRAF V600E檢測(cè)出未突變的患者，應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)、血液及B超檢查征象等，惡性征象偏高的建議手術(shù)治療；惡性征象不高的建議門診隨訪，定期復(fù)查。