大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷及炎癥反應(yīng)特點(diǎn)

梁兆俊，袁雨，李佳儀，劉康妮，石強(qiáng)，馮婭妮

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.麻醉科；2.神經(jīng)外科，沈陽 110001）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）多是由于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起，具有較高的致死率和致殘率［1-2］。以往研究［3］認(rèn)為SAH后引起的腦血管痙攣對(duì)疾病的發(fā)展以及對(duì)患者預(yù)后起關(guān)鍵性作用，但對(duì)腦血管痙攣治療發(fā)現(xiàn)并未明顯改善患者預(yù)后。最近研究［4］表明，SAH導(dǎo)致的早期腦損傷（early brain injury，EBI），即發(fā)病72 h內(nèi)產(chǎn)生直接及繼發(fā)性顱腦損傷對(duì)患者預(yù)后有重要意義。有研究［5］稱炎癥反應(yīng)在SAH后早期腦損傷中起重要作用。最近研究［6］發(fā)現(xiàn)大鼠SAH早期腦損傷模型建立后，在大鼠腦皮質(zhì)中有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）表達(dá)，但在大鼠海馬神經(jīng)元中是否表達(dá)未見報(bào)道。GOU 等［7］研究發(fā)現(xiàn)SAH造模后對(duì)海馬神經(jīng)元損傷最明顯。本研究探討大鼠SAH早期腦損傷特點(diǎn)及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑、動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)試劑包括戊巴比妥鈉，兔抗鼠NLRP3（美國NOVUS公司），兔抗鼠IL-1β、兔抗鼠IL-18（美國Abcam公司），β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗（中國中杉金橋公司）。

雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量280～320 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室恒溫（24±2）℃，相對(duì)濕度40%飼養(yǎng)。每籠5只大鼠，大鼠可以隨時(shí)獲得食物和水，所有操作均按照國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)完成。

將大鼠隨機(jī)分組：假手術(shù)組（n=12）和SAH組（n=60）。SAH組根據(jù)出血后時(shí)間又分為SAH6 h、12 h、24 h、36 h、72 h 5組，每組12只。假手術(shù)組行枕大池二次注射生理鹽水；SAH組行枕大池二次注血法，分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠并獲取海馬組織，-80 ℃低溫冰箱保存。

1.2 SAH大鼠模型建立

采用經(jīng)典枕大池二次注血法［8］制作SAH大鼠模型。使用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠。用立體定向頭架固定大鼠頭部，備皮消毒后沿頭正中線切開筋膜肌肉，暴露寰枕筋膜，用一次性無菌輔料保護(hù)切口區(qū)。然后將大鼠仰臥位，備皮消毒腹股溝股動(dòng)脈區(qū)，切開大鼠腹股溝區(qū)皮膚，充分暴露出股動(dòng)脈，并固定該動(dòng)脈，抽取自體非肝素化的股動(dòng)脈血（約0.10 mL/l00 g），再將大鼠俯臥位固定，從枕骨大孔進(jìn)針約1 mm（針穿過環(huán)枕膜時(shí)有突破感，回抽并有負(fù)壓感）后緩慢注射自體動(dòng)脈血（0.1 mL/min），注血完成停留5 min，拔出針頭后用止血棉封閉穿刺口，逐層縫合肌層和皮膚。大鼠置30°頭低腳高位約30 min，然后放入籠內(nèi)飼養(yǎng)。48 h后再取對(duì)側(cè)股動(dòng)脈血進(jìn)行2次注血，方法與第1次注血相同。假手術(shù)組枕大池內(nèi)注射等量生理鹽水（0.1 mL/100 g）。

1.3 大鼠腦水含量檢測(cè)

于各目標(biāo)時(shí)間將大鼠處死取腦，冰上快速分離腦組織，取左、右側(cè)大腦半球，用電子天平（精確到0.1 mg）測(cè)量左、右腦組織濕重，然后放入恒溫箱（68.7 ℃）烘烤48 h至恒重，冷卻后放電子天平測(cè)其干重（2次測(cè)量誤差＜0.1 mg），最后計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%［9］。

1.4 Western blotting

海馬組織超聲下裂解，使用總蛋白提取試劑盒（中國Beyotime 公司）提取總蛋白。10%SDS-PAGE膠，恒壓80 V電泳30 min，轉(zhuǎn)100 V繼續(xù)分離提取蛋白樣品，接著恒電流220 mA將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h；孵育一抗：兔抗鼠NLRP3（3∶1 000）、兔抗鼠IL-1β（1∶1 000）、兔抗鼠IL-18（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）4 ℃搖床中孵育過夜；次日1×TBST漂洗3次（10 min/次），使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶20 000）孵育2 h，1×TBST漂洗3次（5 min/次），采用發(fā)光液（中國BeyoECL Plus公司）與發(fā)光儀上顯影［10］。使用Image J軟件進(jìn)行相關(guān)蛋白分析。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)分：采用 Garcia神經(jīng)功能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［11］評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能，對(duì)大鼠體態(tài)的對(duì)稱性、自動(dòng)運(yùn)動(dòng)情況、前置伸展運(yùn)動(dòng)能力、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、本體感覺、兩側(cè)觸須反射和兩側(cè)身體觸覺反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分范圍3～18分。評(píng)分越低，神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.5.2 SAH評(píng)分：于不同目標(biāo)時(shí)間將大鼠處死取腦，并將大鼠基底池分為6部分，毎部分根據(jù)血凝塊的厚度進(jìn)行評(píng)分：0分，無蛛網(wǎng)膜下腔出血；1分，少量蛛網(wǎng)膜下腔出血；2分，中等量血凝塊，動(dòng)脈可肉眼分辨；3分，血凝塊覆蓋，動(dòng)脈不可見。6個(gè)部分所得評(píng)分相加后的總和即為SAH評(píng)分，總分0～18分。假手術(shù)組大鼠SAH評(píng)分為0分，評(píng)分＜8分大鼠認(rèn)為損傷較輕［10］，不納入本研究。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad Prism7軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能和SAH評(píng)分比較

與假手術(shù)組比較，SAH組大鼠各時(shí)間的神經(jīng)功能和SAH評(píng)分明顯改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SAH各時(shí)間組大鼠比較，出血12 h組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分最低、SAH評(píng)分最高（均P＜0.05）。見表1。

表1 6組大鼠神經(jīng)功能和SAH評(píng)分比較（）Tab.1 Comparison of neurological score and SAH score in the 6 groups（）

表1 6組大鼠神經(jīng)功能和SAH評(píng)分比較（）Tab.1 Comparison of neurological score and SAH score in the 6 groups（）

1）P ＜0.05 vs sham group；2）P ＜0.05 vs SAH 6 h，24 h，36 h，72 h groups.

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較

結(jié)果顯示，假手術(shù)組，SAH 6 h、12 h、24 h、36 h、72 h組腦組織含水量分別為（44.38±0.91）%、（64.29±0.93）%、（84.51±0.93）%、（73.82±1.10）%、（69.31±1.46）%、（60.30±3.33）%。與假手術(shù)組比較，各時(shí)間SAH組大鼠腦水含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；SAH組各時(shí)間大鼠比較，SAH12 h組腦水腫程度最明顯（均P＜0.05）。

2.3 各組大鼠NLRP3、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平比較

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)比較，SAH組各時(shí)間大鼠海馬神經(jīng)元中NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；SAH組各時(shí)間大鼠比較，SAH12 h組NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平升高最明顯（均P＜0.05），見表2、圖1。

表2 6組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)比較Tab.2 Comparison of NLRP3，IL-1β and IL-18 after subarachnoid hemorrhage in the 6 groups

圖1 炎性細(xì)胞因子NLRP3、IL-1β、IL-18在大鼠海馬組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of inflammatory cytokines NLRP3，IL-1β and IL-18 in rat hippocampus

3 討論

SAH是由于腦底部或腦表面血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床現(xiàn)象，約占急性腦卒中的10%［1］。研究［2］報(bào)道約80%SAH患者是動(dòng)脈瘤破裂引起的，其他原因則是血管畸形和血管炎等。本研究采用了枕大池二次注血法來建造大鼠SAH模型，該方法能夠有效模擬動(dòng)脈瘤性SAH過程［8］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠SAH造模后6 h就有神經(jīng)功能損傷、腦水腫，同時(shí)相關(guān)炎性細(xì)胞因子在海馬神經(jīng)元中表達(dá)；神經(jīng)功能損傷、腦水腫及相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)在12 h達(dá)到高峰。損傷后72 h內(nèi)隨著時(shí)間推移各指標(biāo)逐漸緩解，但與假手術(shù)組比較仍有損害。有研究［12］顯示對(duì)大鼠早期腦損傷最為嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)是在損傷后24 h，與本研究結(jié)果不同，分析原因可能是因?yàn)橐酝芯繖z測(cè)的是大鼠SAH后大腦皮質(zhì)的損傷，而本研究檢測(cè)的是大鼠SAH后海馬神經(jīng)元的損傷。

有研究［13］表明炎癥反應(yīng)在SAH后早期腦損傷發(fā)病過程中起重要作用，是引起腦組織繼發(fā)性損傷的重要因素之一。動(dòng)脈瘤破裂后，血液順勢(shì)流入蛛網(wǎng)膜下腔，此時(shí)紅細(xì)胞會(huì)因?yàn)楦鞣N外界因素破壞正常形態(tài)，降解產(chǎn)生了大量的血紅蛋白、含鐵血紅素等物質(zhì)，這些產(chǎn)物刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固有免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞通過增生而上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，炎癥細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-18、TNF-α等）［14］，從而引起顱腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。腦組織炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)會(huì)進(jìn)一步加重腦組織的繼發(fā)性損傷，WANG等［15］研究發(fā)現(xiàn)星性膠質(zhì)細(xì)胞可以通過釋放分泌性糖蛋白（sonic hedgehog，SHH）來維持血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的完整性，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IL-1β通過降低SHH蛋白的釋放來破壞BBB。BLIXT等［16］發(fā)現(xiàn)BBB破壞會(huì)進(jìn)一步引起早期腦水腫，從而加重腦組織損傷。引起腦水腫的另一重要因素是水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4），AQP4 分布最廣泛，功能非常強(qiáng)大，它參與許多水代謝障礙的調(diào)節(jié)過程，尤其是在腦缺血缺氧的過程中起到非常重要的作用，近期有研究［17］發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β等）對(duì)AQP4有破壞作用，能夠進(jìn)一步引起腦水腫。本研究結(jié)果顯示，SAH大鼠早期腦損傷中存在炎性細(xì)胞因子釋放，同時(shí)出現(xiàn)腦水腫，因此猜測(cè)神經(jīng)炎癥反應(yīng)是引起腦水腫的重要因素之一。

在固有免疫系統(tǒng)中，當(dāng)機(jī)體受到傷害性刺激時(shí)，可以激活模式識(shí)別受體，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體是重要的模式識(shí)別受體，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮著獨(dú)特功能，而NLRP3炎性體是目前研究較為廣泛的炎性體之一［18］。NLRP3激活后可以與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白（apoptosis associated speck-like protein，ASC ）及效應(yīng)蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶-1前體形成蛋白復(fù)合物，此時(shí)半胱氨酸天冬氨酸酶-1前體可以通過自切割形式產(chǎn)生有活性的半胱氨酸天冬氨酸酶-1，半胱氨酸天冬氨酸酶-1進(jìn)一步切割I(lǐng)L-1β前體和IL-18前體，形成有活性的IL-1β和IL-18，引起顱腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)［19］。因此NLRP3激活在炎癥反應(yīng)中成為一個(gè)中心環(huán)節(jié)。近期有研究［6］報(bào)道在動(dòng)物SAH模型中的大腦皮質(zhì)中有NLRP3表達(dá)，本研究結(jié)果顯示在SAH大鼠海馬神經(jīng)元中有NLRP3表達(dá)，并且在SAH后12 h表達(dá)達(dá)到峰值。

綜上所述，大鼠SAH后存在神經(jīng)功能損傷、腦水腫及海馬神經(jīng)元中炎性細(xì)胞因子表達(dá)，并且出血后12 h最為明顯，隨著時(shí)間推移損傷緩解。推測(cè)NLRP3、IL-1β、IL-18等炎性細(xì)胞因子參與了SAH后的炎癥反應(yīng)，并且在出血后12 h達(dá)到峰值。炎癥反應(yīng)可能是引起SAH患者臨床癥狀的原因之一。本研究是大鼠實(shí)驗(yàn)研究，并不能完全代表SAH對(duì)患者海馬神經(jīng)元的影響，因此還需要進(jìn)一步研究。