穆盛田,唐潔,閻東莉,鄭振
(中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院,遼寧省腫瘤醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,沈陽 110042)
急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是目前危重癥領(lǐng)域常見且死亡率極高的一種臨床綜合征[1]。臨床上以急性呼吸窘迫和呼吸衰竭為特點(diǎn),可由膿毒癥、創(chuàng)傷、休克等多種因素引起。病理生理上以毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的毛細(xì)血管滲漏和彌漫性肺水腫為特點(diǎn),過度的全身和局部炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是其最主要的發(fā)病機(jī)制。近年來,過度的炎癥反應(yīng)引起的氧化應(yīng)激損傷以及氧化應(yīng)激產(chǎn)物過度釋放導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大已經(jīng)越來越引起臨床和基礎(chǔ)研究的關(guān)注[2]。
烏司他丁作為一種從健康人尿液中提取的胰蛋白酶抑制劑,是人體中重要的內(nèi)源性抑炎物質(zhì),可以抑制多種蛋白水解酶的活性,同時(shí)還可以調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的釋放,并有效抑制氧自由基的產(chǎn)生,臨床早期多用于急性重癥胰腺炎的治療。隨著研究的逐步深入,烏司他丁還用于膿毒癥、休克、缺血再灌注損傷以及多器官功能障礙等多種臨床綜合征的救治,它可以改善機(jī)體組織灌注損傷,具有保護(hù)臟器功能的作用[3-6]。已有臨床研究[7]發(fā)現(xiàn),烏司他丁可以改善ARDS患者的預(yù)后,但其具體的作用機(jī)制目前尚不明確。本研究探討了烏司他丁對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)引起的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMECs)屏障功能破壞的保護(hù)作用及可能機(jī)制。
HPMECs購自上海拜力生物技術(shù)有限公司;TNF-α和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)購自美國Sigma公司;烏司他?。▏帨?zhǔn)字 H19990134,10萬U/支)購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司;血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vasscular endothelial cadherin,VE-cadherin)抗體購自英國Abcam公司;一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。
HPMECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2飽和濕度的Thermo培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1~2 d換液1次。將無血清的DMEM培養(yǎng)基加入待實(shí)驗(yàn)細(xì)胞后2 h進(jìn)行分組處理,分為對照組,TNF-α組(給予10 ng/mL的TNF-α刺激HPMECs 6 h),TNF-α+烏司他丁組(給予TNF-α前30 min分別給予10、100和1 000 U/mL的 烏司他丁),TNF-α+NAC組(給予TNF-α前30 min給予1 mmol/L的NAC)。
應(yīng)用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋熒光劑(DCFHDA)至濃度10 μmol/L,取2 mL加至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,于培養(yǎng)箱孵育30 min后棄上清,用無血清培養(yǎng)基清洗,重復(fù)3次后檢測ROS表達(dá)。在Leica DMi8熒光顯微鏡(德國徠卡公司)下可觀察到綠色熒光,應(yīng)用Image J測量熒光值并計(jì)算,從而反映ROS的產(chǎn)生。
收集各組細(xì)胞上清液,置于EP管中超低溫冰箱保存待測。根據(jù)NO檢測試劑盒說明書,采用硝酸還原酶法測定NO含量。在波長540 nm處檢測吸光度值,計(jì)算NO含量。
選擇Transwell小室(美國Corning公司)種植和培養(yǎng)HPMECs,于上室均勻接種細(xì)胞1.5×105/孔,體積為100 μL,下室加入HPMECs培養(yǎng)液600 μL,于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。小室種完細(xì)胞后第1和3天換液,生長到第4天細(xì)胞融合,更換為無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓2 h,使細(xì)胞同步化后用于實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Millicell? ERS-2電阻儀(美國默克公司)檢測各組HPMECs的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(transendothelial electrical resistance,TEER)值。
應(yīng)用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配置不同濃度的FITC-dextran,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,細(xì)胞同步化后不同分組細(xì)胞在Transwell上下室分別加入相關(guān)試劑,之后將1 mg/mL的FITC-dextran 100 μL加入上室,避光、37 ℃、5%CO2孵箱孵育1 h,從下室提取 100 μL樣品后,熒光分光光度計(jì)檢測下室樣品的熒光能量值(激發(fā)波長494 nm,發(fā)射波長520 nm)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算和測得樣品的熒光能量值,計(jì)算透過Transwell小室的FITC-dextran的濃度(μg/mL)。
將HPMECs均勻種植在細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片上,待細(xì)胞爬片培養(yǎng)至80%~90%融合度后,應(yīng)用4%多聚甲醛固定,0.1% TritonX-100溶液透化,5%胎牛血清蛋白封閉,加入200 μL配置好的VE-cadherin一抗工作液(1∶200)4 ℃冰箱孵育過夜,加入200 μL配置好的Alexa Fluor? 488二抗工作液(1∶200)室溫避光下孵育1 h,5 μg/mL的DAPI室溫避光下染色2 min,將蓋玻片倒扣在滴有甘油的載玻片上,應(yīng)用Leica DMi8熒光顯微鏡觀察并保存圖像。
裂解、提取細(xì)胞蛋白,BCA法測定蛋白含量,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,Tris緩沖液洗滌,室溫下脫脂奶粉封,VE-cadherin一抗工作液(1∶1 000)4 ℃冰箱孵育過夜,Tris緩沖液沖洗后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫下孵育,免疫印跡化學(xué)發(fā)光法顯色,凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶。
應(yīng)用Graphpad Prism 6.0軟件分析數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示,2組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與對照組比較,TNF-α組和TNF-α+10 U/mL烏司他丁組細(xì)胞內(nèi)ROS生成量明顯增加(P<0.05);TNF-α組與TNF-α+10 U/mL烏司他丁組比較,ROS生成量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);TNF-α+100 U/mL烏司他丁組和TNF-α+1 000 U/mL烏司他丁與TNF-α組比較,ROS生成量明顯減少(P<0.05),這與TNFα+NAC組作用相似。見圖1。
圖1 免疫熒光法檢測各組ROS生成量Fig.1 ROS detected by immunofluorescence in each group of HPMECs
與對照組比較,TNF-α組和TNF-α+10 U/mL烏司他丁組細(xì)胞NO生成量明顯增加(P<0.05);TNF-α組與TNF-α+10 U/mL烏司他丁組比較,NO生成量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);TNF-α+100 U/mL烏司他丁組和TNF-α+1 000 U/mL烏司他丁與TNF-α組比較,NO生成量明顯減少(P<0.05),這與TNF-α+NAC組作用相似。見圖2。
圖2 硝酸還原酶法測定各組NO含量Fig.2 NO detected by the nitrate reductase method in each group of HPMECs
應(yīng)用Millicell? ERS-2電阻儀檢測Transwell小室單層HPMECs的TEER值。0 h時(shí),各組間TEER值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);6 h后,TNF-α組單層HPMECs的TEER值較對照組明顯降低(P<0.05);TNF-α+100 U/mL烏司他丁組和TNF-α+NAC組與TNF-α組比較,TEER值明顯升高(P<0.05)。見圖3A。
圖3 各組單層HPMECs的TEER和透過單層細(xì)胞的FITC-dextran濃度Fig.3 TEER and the influx of FITC-dextran across the monolayer of HPMECs in each group
通過熒光分光光度儀檢測透過Transwell小室單層HPMECs的FITC-dextran濃度。TNF-α組與對照組比較,透過HPMECs的FITC-dextran明顯增加(P<0.05);TNF-α+100 U/mL烏司他丁組和TNF-α+NAC組與TNF-α組比較,透過內(nèi)皮細(xì)胞的FITC-dextran明顯減少(P<0.05)。這表明烏司他丁可以通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),改善TNF-α刺激HPMECs引起的內(nèi)皮屏障功能破壞。見圖3B。
對照組VE-cadherin主要在內(nèi)皮細(xì)胞周邊表達(dá),內(nèi)皮細(xì)胞間連接緊密。TNF-α組HPMECs中VE-cadherin表達(dá)減少,尤其是細(xì)胞周邊,引起細(xì)胞間隙增大。而TNF-α+100 U/mL烏司他丁組和TNF-α+NAC組與TNF-α組比較,VE-cadherin表達(dá)增加。見圖4A。
Western blotting結(jié)果進(jìn)一步證明了TNF-α組HPMECs中VE-cadherin表達(dá)減少,而TNF-α+100 U/mL烏司他丁組和TNF-α+NAC組與TNF-α組比較,VE-cadherin表達(dá)明顯增加(P<0.05)。這表明烏司他丁可以通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),改善TNF-α刺激HPMECs引起VE-cadherin表達(dá)減少。見圖4B。
ARDS目前仍然是危重癥領(lǐng)域研究的主要熱點(diǎn)問題之一,因?yàn)槠浒l(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性,臨床尚缺少有效的治療手段,尤其是中重度ARDS,臨床病死率接近50%[1]。目前已經(jīng)證實(shí)過度的炎癥反應(yīng)是其主要的發(fā)病機(jī)制之一,TNF-α等炎性細(xì)胞因子大量釋放可引起肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能破壞,導(dǎo)致毛細(xì)血管滲漏,引起彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫。近年來,越來越多的研究[2,8]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)在膿毒癥及ARDS中發(fā)揮非常重要的作用。過度釋放的炎性細(xì)胞因子可以通過激活中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞促進(jìn)ROS等氧自由基產(chǎn)生,后者可以通過激活鈣離子通道調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能,從而造成內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加[3]。有研究[9]發(fā)現(xiàn),抗氧化應(yīng)激治療可以保護(hù)ARDS過程中受損的內(nèi)皮屏障功能。
圖4 免疫熒光染色和Western blotting檢測各組VE-cadherin表達(dá)Fig.4 The expression of VE-cadherin detected by immunofluorescence and Western blotting in each group of HPMECs
烏司他丁作為一種人尿液中提取出來的胰蛋白酶抑制劑,具有抑制蛋白酶活性、調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子釋放的作用;同時(shí)作為一種糖蛋白,還可以穩(wěn)定溶酶體膜,能夠減少溶酶體酶的合成和傳遞,從而清除多種氧自由基,發(fā)揮保護(hù)作用。因此,烏司他丁廣泛用于臨床膿毒癥、休克、胰腺炎等危重疾病的救治。近年研究[7,10]發(fā)現(xiàn),烏司他丁可以改善ARDS患者的預(yù)后,但其機(jī)制目前尚不十分明確。2014年發(fā)表的一項(xiàng)meta分析[7]結(jié)果顯示,烏司他丁可以降低ARDS患者ICU內(nèi)的病死率,但并不改變患者的28 d病死率,烏司他丁可以改善ARDS患者的氧合,同時(shí)減少患者的住院時(shí)間。近期發(fā)表的臨床研究[10]也發(fā)現(xiàn),烏司他丁聯(lián)合機(jī)械通氣治療ARDS,除了可以減少患者TNF-α及白細(xì)胞介素(interlenkin,IL)-6等炎性細(xì)胞因子的過度釋放,還可以增加患者體內(nèi)丙二醛、超氧化物歧化酶和總抗氧化能力水平。關(guān)于烏司他丁在ARDS過程中的保護(hù)機(jī)制,目前大多數(shù)基礎(chǔ)研究認(rèn)為烏司他丁可以通過抑制過度的炎癥反應(yīng),在ARDS過程中發(fā)揮保護(hù)作用。早期的研究[11]發(fā)現(xiàn),烏司他丁能顯著降低燒傷大鼠血漿及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的水平,可以抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和髓過氧化物酶的分泌。近期又有研究[12]發(fā)現(xiàn),烏司他丁可以通過抑制Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路的激活和減少炎癥介質(zhì)來保護(hù)脂多糖引起的急性肺損傷。但有關(guān)其對氧化應(yīng)激損傷及肺血管通透性的研究較少。近期有基礎(chǔ)研究[13]發(fā)現(xiàn),烏司他丁可以通過抑制氧化應(yīng)激損傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡來保護(hù)血管內(nèi)皮的通透性。本研究通過免疫熒光和ELISA方法也發(fā)現(xiàn),烏司他丁的確可以減少TNF-α刺激HPMECs后產(chǎn)生的ROS和NO,并且呈一定程度的劑量依賴性。這也直接說明烏司他丁的確可以抑制炎性細(xì)胞因子刺激產(chǎn)生的過度的氧化應(yīng)激損傷。
肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為膿毒癥及ARDS損傷的主要靶細(xì)胞,其屏障功能障礙是目前基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)問題,甚至有研究認(rèn)為內(nèi)皮損傷的生物標(biāo)志物可以幫助鑒別ARDS的病因及預(yù)后評估,但有關(guān)烏司他丁在ARDS過程中如何保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制目前尚不清楚。近期有研究[14]發(fā)現(xiàn),烏司他丁可能通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞表面的多糖包被及抑制肝素酶的活性來改善ARDS時(shí)肺血管內(nèi)皮的屏障功能。還有研究[15]發(fā)現(xiàn),烏司他丁可以通過RhoA/ROCK信號通路直接改善炎癥引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。本研究通過檢測Transwell小室單層內(nèi)皮細(xì)胞TEER值及采用熒光分光光度儀檢測透過Transwell的FITC-dextran,發(fā)現(xiàn)烏司他丁及NAC的確可以保護(hù)TNF-α刺激HPMECs引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,進(jìn)一步通過免疫熒光和Western blotting發(fā)現(xiàn),烏司他丁和NAC均可以增加TNF-α刺激HPMECs引起的內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin表達(dá)下降,后者是影響肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接的重要蛋白。近期有研究[16]顯示,烏司他丁可能是通過抑制VE-cadherin的Tyr658位點(diǎn)磷酸化來增加VE-cadherin的表達(dá),從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。
綜上所述,烏司他丁可以通過減少TNF-α刺激HPMECs引起的ROS和NO過度釋放從而改善內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。本研究為臨床應(yīng)用烏司他丁治療ARDS提供了新的理論依據(jù),但還需要更深一步的機(jī)制研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)。