超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質譜法同時測定連翹藥材中的多元活性成分

魏麗芳，梅余琪，鄒立思，劉訓紅，陳佳麗，談夢霞，王程成，蔡芷辰，林麗群

(南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023)

連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl的干燥果實，收載于2015年版《中國藥典》，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱之功效，用于治療癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風熱感冒等癥[1]。研究表明，連翹主要含有苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮類及酚酸類等多元活性成分[2]。其中，苯乙醇苷類成分具有抗菌[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]、抗氧化[6]、抗內(nèi)毒素[7]及保肝[8]等作用；木脂素類成分具有抗炎[9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]及保肝[12]等作用；黃酮類和酚酸類成分具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒等作用[13-16]。中藥療效的發(fā)揮是多種活性成分協(xié)同作用的結果，建立連翹中多種藥效成分同時測定的方法，對于探討多指標成分的綜合評價體系具有實用性和有效性。

目前，關于連翹藥材的質量評價研究多以少數(shù)幾個活性成分含量為評價指標，尚少見對多元活性成分同時測定的研究報道。2015年版《中國藥典》以連翹酯苷A和連翹苷為質控指標，然而，單一或少數(shù)幾個活性成分的含量難以客觀反映中藥的整體質量[17]。文獻報道的連翹藥材中成分分析的方法有高效液相色譜法(HPLC)[18-19]、液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC-MS)[20-21]等。但上述方法僅測定連翹藥材中含量較高的幾個成分，較難客觀反映連翹藥材的整體質量。HPLC法難以有效分離極性相似的組分，且存在分析時間長、靈敏度低等缺點，不能很好地滿足檢測需求[22]。三重四極桿/線性離子阱質譜(QTRAP-MS/MS)兼具三重四極桿質譜的多種掃描功能以及線性離子阱質譜的多級質譜打碎能力，其多反應監(jiān)測模式(MRM)可根據(jù)分子量和碎片質量的不同使色譜行為相似的物質得到完全分離，并可同時進行多個化合物的定量分析，大大縮短了分析時間[23]。此外，線性離子阱可將離子聚焦于一條線上，與三維離子阱相比，增加了離子的存儲量，使儀器靈敏度得到提高[24]。因此，LC-QTRAP-MS/MS具有高選擇性、高通量、高靈敏度的特點，適合于中藥等復雜體系的組分分離分析。

本實驗采用響應面法優(yōu)化了連翹藥材提取條件，基于超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)技術，建立了同時測定連翹中苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮類及酚酸類共21種活性成分含量的方法。該方法可在較短時間內(nèi)實現(xiàn)多種成分的分離分析，使同分異構體達到基線分離，有效提高了檢測通量和檢測速度，且能夠檢測藥材中的痕量和超痕量組分，可為連翹藥材內(nèi)在質量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-MS系統(tǒng)：Shimadzu SIL-20A XR 超快速液相色譜儀，包括LC-20AD二元輸液泵、STL-20A XR自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱(日本島津公司)；AB QTRAP 5500 三重四極桿/線性離子阱質譜儀，配有電噴霧離子源和Analyst 1.5.2軟件(美國AB SCIEX 公司)。 Q-500B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)；BSA224S型電子分析天平(感量萬分之一)、ME36S型電子分析天平(感量百萬分之一)購于德國賽多利斯公司；湘儀H1650-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；KQ-500B超聲波清洗機(超聲功率500 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)。

對照品：連翹酯苷A(批號lw18012502，下同)、連翹酯苷B(lw180210050)、連翹苷(lw18012210)、松脂醇(lw171207150)購自南京良緯生物技術有限公司；連翹酯苷I(S23N7D25441)、牛蒡子苷(R12O8F45507)、對香豆酸(15S4)、阿魏酸(H27J7L16718)、橙皮苷(P06D9F77001)、木犀草素(C24M8Q36543)、連翹脂素(Z04J9X62808)購自上海源葉生物技術有限公司；松脂醇-β-D-葡萄糖苷(151205)購自成都克洛瑪生物科技有限公司；蘆丁(0080-9705)、沒食子酸(110831-200302)、黃芩苷(110715-200514)、紫云英苷(11092001)購自中國藥品生物制品檢定所；槲皮素(100081-201509)、木犀草苷(111720-201408)、咖啡酸(110885-200102)、山奈酚(110861-201310)購自中國食品藥品檢定研究院；綠原酸(20160701)購自寶雞市辰光生物科技有限公司；經(jīng)HPLC測定，上述化合物的純度均大于98%。實驗用水為Milli-Q超純水；甲醇、甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

連翹原藥材實地采集于國內(nèi)主產(chǎn)區(qū)，商品藥材購自藥材公司，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院劉訓紅教授鑒定為木犀科(Oleaceae)植物連翹Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl的干燥果實。樣品信息見表1。留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定實驗室。

表1 連翹藥材樣品信息Table 1 The sample information of Forsythiae Fructus

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的制備精密稱取各對照品適量，加72%甲醇配制成對照品貯備液，沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷B、連翹酯苷I、蘆丁、對香豆酸、連翹酯苷A、木犀草苷、阿魏酸、松脂醇-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、橙皮苷、黃芩苷、連翹苷、牛蒡子苷、木犀草素、山奈酚、松脂醇和連翹脂素的質量濃度分別為985、1 000、990、1 075、985、990、2 018、5 060、1 000、1 235、1 100、1 170、1 885、976、1 015、1 025、985、1 004、1 006、1 180、990 μg/mL。取各對照品貯備液適量，加72%甲醇定容至5 mL配成混合對照品溶液，并逐級稀釋，得到一系列不同質量濃度的工作溶液，以0.22 μm微孔濾膜過濾，置于4 ℃ 冰箱保存，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備取過50目篩的連翹果實粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入19 mL 72%甲醇，密閉，稱定質量，超聲提取60 min(功率500 W，頻率40 kHz)，放冷至室溫，再次稱定質量，用72%甲醇補足失重，過濾。濾液以12 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋10倍，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：XBridge ? C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動相：A為水(含0.1%甲酸)，B為乙腈；梯度洗脫：0～0.01 min，2% B；0.01～6.5 min，2%～23% B；6.5～10.0 min，23%～24% B；10.0～14.0 min，24%～45% B；14.0～16.0 min，45%～55% B；16.0～17.0 min，55%～2% B；柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL/min；進樣量為2 μL。

1.3.2 質譜條件電噴霧離子化源(ESI)；多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測；離子源溫度(TEM)：550 ℃；噴霧電壓(IS)：正離子模式下為4 500 V，負離子模式下為-4 500 V；氣簾氣(CUR)流速：40 L/min；霧化氣(GS1)流速：55 L/min；輔助氣(GS2)流速：55 L/min；接口加熱，全程通入氮氣。

2 結果與討論

2.1 供試品制備方法的優(yōu)化

2.1.1 單因素優(yōu)化實驗由于提取溶劑、液料比及提取時間會對藥材的提取效率造成影響，實驗采用液相色譜法對藥典指標成分連翹酯苷A和連翹苷的含量進行檢測，以其提取率作為響應值，對提取溶劑(30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、100%甲醇)、液料比(20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g)及提取時間(15、30、45、60 min)進行了單因素考察(見圖1)。結果表明，當甲醇的體積分數(shù)為30%～70%時，連翹酯苷A、連翹苷的提取率及總提取率均隨著甲醇體積分數(shù)的增大呈上升趨勢，繼續(xù)增大甲醇體積分數(shù)，提取率反而下降。料液比及提取時間對提取率的影響均為隨著因素水平的增大而增大，但料液比達到35∶1 mL/g、提取時間達到45 min后，三者的提取率增速較慢。綜合考慮溶劑消耗和提取率，選擇70%甲醇作提取溶劑、液料比為35∶1 mL/g，超聲提取45 min。

圖1 甲醇體積分數(shù)(A)、液料比(B)及提取時間(C)對連翹脂苷A、連翹苷提取率的影響Fig.1 Effects of methanol volume fraction(A)，liquid to material ratio(B) and extraction time(C) on extraction rates of forsythiaside A and phillyrinphillyrin;forsythiaside A;total

2.1.2 響應面實驗設計與模型建立根據(jù)單因素實驗結果，以甲醇體積分數(shù)(A)、液料比(B)和提取時間(C)為考察因素，應用Box-Behnken中心組合方法[25]進行三因素三水平的實驗設計，以連翹酯苷A和連翹苷的提取率總和(Y)為響應值，進行響應面分析。實驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken

應用Design-Expert 8.0.6 對表2數(shù)據(jù)進行多元線性回歸和二項式擬合，得多元線性回歸方程為Y=-31.153+0.402A+1.428B+0.034C-2.625×10-3AB-6.167×10-4AC+1.267×10-3BC-1.863×10-3A2-0.017B2-2.122×10-4C2。

對該模型進行回歸方差分析和顯著性檢驗(表3)。結果表明，該模型F值為30.42(P<0.000 1，模型極顯著)，而失擬項的F值為2.38(P=0.210 8>0.05，不顯著)，表明該方程的擬合較好且具有統(tǒng)計學意義。各考察因素對響應值影響的程度為A>B>C，總體上因素A、B、C、A2、B2以及交互項AB均顯著影響連翹酯苷A和連翹苷的提取率。

表3 響應曲面方差分析及顯著性檢驗Table 3 Variance analysis and significant test for response surface

**P≤0.01 is extremely significant;*P≤0.05 is significant

根據(jù)回歸方程繪制不同影響因素對連翹酯苷A和連翹苷總提取率的響應曲面圖，結果見圖2。由圖2可知，甲醇體積分數(shù)與液料比的響應曲面較陡，表示其交互作用對連翹酯苷A和連翹苷提取率的影響顯著，而甲醇體積分數(shù)與提取時間、液料比與提取時間的響應曲面較平滑，影響較小，與表3方差分析結果一致。

圖2 各因素間交互作用對連翹酯苷A及連翹苷提取率的響應曲面圖Fig.2 Response surface diagram of interaction between various factors on extraction efficiencies of forsythiaside A and phillyrin

2.1.3 模型驗證利用Design-Expert 8.0.6對回歸方程進行求解，得到最優(yōu)的提取條件：甲醇體積分數(shù)為71.24%，液料比為37.81∶1 mL/g，提取時間為60 min，提取率預測值為11.53%。為便于實驗操作，將上述條件修正為甲醇體積分數(shù)72%，液料比38∶1 mL/g，提取時間60 min。在此條件下進行3次平行實驗，得平均提取率為11.41%，與理論值的相對誤差為1.04%，說明該提取條件參數(shù)可靠，因此選其作為連翹藥材的提取條件。

2.2 色譜-質譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化比較了SynergiTMHydro-RP 100?柱(2.0 mm×100 mm，2.5 μm)和XBridge?C18柱(4.6 mm× 100 mm，3.5 μm)對21種目標成分的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)兩柱對目標化合物的分離效果差別不大，但后者所得色譜響應略高且色譜峰形更對稱，因此選擇XBridge ? C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)作為分離柱。分別考察了水-甲醇、水-乙腈、水(含0.1%甲酸)-乙腈組成的流動相體系對21種目標化合物色譜行為的影響。結果表明，以水(含0.1%甲酸)-乙腈為流動相時，21種目標物能獲得較好的色譜峰形、分離效果和檢測靈敏度。因此，選擇水(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動相。

2.2.2 質譜條件的優(yōu)化分別將質量濃度為100 ng/mL(連翹酯苷I、連翹酯苷A、連翹脂素為1 μg/mL)的目標化合物標準溶液注入離子源中，在正離子和負離子模式下進行全掃描。結果顯示，紫云英苷、連翹苷、牛蒡子苷在正離子模式下有較強的離子響應，其他成分在負離子模式下的響應值更高。進而對分子離子峰進行二級質譜掃描(子離子掃描)，得到離子碎片信息和二級質譜圖,然后對解簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等參數(shù)進行優(yōu)化，使分子離子和特征碎片離子對的強度達到最佳。優(yōu)化得到的質譜參數(shù)見表4，MRM色譜圖見圖3。

表4 21種目標成分的質譜分析參數(shù)Table 4 MS/MS parameters of 21 constituents

圖3 21種目標成分混合對照溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of 21 constituents in reference solutionthe peak numbers denoted were the same as those in Table 4

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系、檢出限與定量下限精密吸取“1.2.1”中系列濃度的對照品溶液及混合對照品溶液各2 μL，按“1.3”色譜-質譜條件進行分析。以對照品的質量濃度(X，ng/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線并以最小二乘法進行線性回歸。分別以信噪比S/N≈3和S/N≈10時各對照品的質量濃度作為檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結果見表5。結果顯示，21種目標成分在一定質量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r)不小于0.999 0，檢出限為0.001～233.710 ng/mL，定量下限為0.002～771.250 ng/mL。

2.3.2 精密度、重復性與穩(wěn)定性精密吸取同一混合對照品溶液(各成分質量濃度約為10 μg/mL)2 μL，在1天內(nèi)連續(xù)進樣 分析6 次，計算得21種目標成分日內(nèi)峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.2%～4.0%；每天進樣3針，連續(xù)3天進樣分析，計算得日間峰面積的RSD為2.8%～4.0%(表6)，說明儀器精密度良好；取同一連翹樣品6份，每份0.5 g，精密稱定，分別按“1.2.2”制備供試品溶液，進樣分析，計算得21種目標成分峰面積的RSD為1.4%～4.0%(表6)，表明該方法重復性良好；取同一連翹供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，計算得21種目標成分峰面積的RSD為1.8%～4.0%(表6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

表5 21種化合物的線性關系、檢出限和定量下限Table 5 Linear relations,limits of detection and limits of quantitation of 21 constituents

2.3.3 加標回收率取已測知含量的連翹樣品0.25 g(各9份)，精密稱定，分別加入低、中、高3個水平(80%、100%、120%)的對照品適量，每個水平3份，按“1.2.2”制備加標回收供試品溶液，并按本方法進行測定，得到21種目標成分的平均回收率為98.6%～102%，RSD為0.89%～3.8%(表6)。結果表明該方法的準確度良好，符合定量分析要求。

表6 精密度、重復性、穩(wěn)定性及加標回收率結果(%)Table 6 Precisions,repeatabilities,stabilities and recoveries of 21 constituents(%)

2.4 樣品含量的測定

將表1中的樣品按“1.2.2”制成供試品溶液，取2 μL按本方法進行測定，根據(jù)相應的線性關系計算供試品溶液中21種目標成分的含量，結果見表7、圖4。結果表明，所分析的連翹樣品中，連翹酯苷A的含量均大于0.25%，連翹苷的含量均大于0.15%，均符合2015年版《中國藥典》要求。其中，以苯乙醇苷類成分的含量最高，占總質量濃度的69.51%～82.85%，木脂素類成分的含量次之，黃酮類及酚酸類成分的含量較低。不同產(chǎn)地和商品藥材中21種活性成分的含量存在一定差異，21種成分的總量以山西產(chǎn)藥材樣品(S2、S3、S4)最高，其中苯乙醇苷類、木脂素類成分的總量均以山西樣品(S2 、S3、S4)最高，這與連翹藥材的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)相吻合。說明連翹藥材的品質形成可能受產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境、藥材采收加工等諸多因素的綜合影響。

表7 連翹中21種目標成分的含量測定結果(n=3，μg/g)Table 7 Determined results of 21 constituents in Forsythiae Fructus(n=3，μg/g)

*the compound numbers denoted were the same as those in Table 4;**not detected

圖4 連翹中4類目標成分含量的柱狀堆積圖Fig.4 Columnar stacked diagram of 4 types of target constituents in Forsythiae Fructus

3 結 論

本文針對連翹多種藥效成分的特點，用響應面法優(yōu)化了樣品提取條件，建立了UFLC-QTRAP-MS/MS同時測定連翹中苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮類及酚酸類共21種活性成分含量的方法，并對連翹不同產(chǎn)地及商品藥材進行比較分析。本方法靈敏度高、準確可靠，實現(xiàn)了包括痕量組分在內(nèi)的多元活性成分的同時測定，可為連翹藥材內(nèi)在質量的綜合評價和全面控制提供參考依據(jù)。