一氧化氮熏蒸處理對甜瓜采后細(xì)胞壁代謝及黑斑病控制的影響

石 玲，吳 斌，敬媛媛，李亞玲，李 玲，何 歡，廖?；?，朱 璇,

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊 830052）

甜瓜（Cucumis melo L.）在我國新疆廣泛種植，種植面積達(dá)8.22×108m2，年總產(chǎn)量達(dá)292.17萬 t[1]。甜瓜果實含水量高，采摘季節(jié)處于炎熱夏季，采后生理代謝活動旺盛，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)易受到破壞，貯藏過程中質(zhì)地變軟[2]，易受到病原微生物侵染產(chǎn)生病害，尤其是鏈格孢引起的黑斑病[3-4]，可造成嚴(yán)重的采后損失。

細(xì)胞壁作為植物細(xì)胞的第一層屏障，其構(gòu)成成分改變會影響到細(xì)胞的形狀、延展性和防御功能[5]。果膠和纖維素作為細(xì)胞壁主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，果膠物質(zhì)在多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（pectin methyl esterase，PME）的協(xié)同作用下由大分子質(zhì)量的非水溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子質(zhì)量的水溶性物質(zhì)，細(xì)胞壁骨架斷裂，纖維素被纖維素酶（cellulase，Cx）降解，導(dǎo)致果蔬細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能改變[6-7]。果實細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是否完整對抵抗病原菌侵染能力大小、果實的貯藏時間長短都起著重大意義[8]。研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)殺菌劑雖然在一定程度上可防治黑斑病，但存在著化學(xué)殘留、病菌產(chǎn)生耐藥性以及環(huán)境污染的問題，因此使用受到限制[9]。前人研究發(fā)現(xiàn)，采后處理可以誘導(dǎo)或激發(fā)果實細(xì)胞壁的抗性反應(yīng)，增強果實對病原菌侵染的抵抗能力[10]。

NO是一種具有廣泛作用的信號分子，能夠影響果蔬的品質(zhì)變化及抗逆反應(yīng)[11-12]。目前，研究表明利用NO處理枇杷果實[13]、蓮霧果實[14]、草莓[15]、番木瓜[16]，能夠減緩其細(xì)胞壁的解聚，抑制果實細(xì)胞壁水解酶的活性，使果膠和半纖維素分解速率減慢，有利于保持果實的品質(zhì)。Hu Meijiao等[17]發(fā)現(xiàn)NO處理有利于維持芒果果實硬度，并提高芒果對炭疽病的抗性。已有研究表明，外源NO處理能夠誘導(dǎo)采后果蔬獲得一定的抗病能力，達(dá)到增強果蔬抗病性及保持果蔬品質(zhì)的目的[18]。目前，研究多集中在采后NO處理對果實抗病效果的影響，NO處理對果實細(xì)胞壁代謝的影響和抗病性的關(guān)系則研究較少。

本實驗主要探究NO熏蒸處理對甜瓜果實采后細(xì)胞壁代謝和抗病性的影響，以期為NO廣泛應(yīng)用于果蔬采后的病害防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

用于甜瓜果實損傷接種的病原菌交孢鏈格孢（Alternaria alternata），由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供。

試材甜瓜品種為‘西州蜜25號'，于2017年7月18日在新疆鄯善縣甜瓜種植基地采摘，選取生長周期（可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～18%）和色澤相近、無機械損傷和病蟲害、果柄留有T形藤蔓的甜瓜果實，套發(fā)泡網(wǎng)裝箱后，及時運回，并于通風(fēng)陰涼處除去田間熱。

咔唑、半乳糖醛酸、溴麝香酚藍(lán)、羧甲基纖維素鈉、葡萄糖、結(jié)晶酚、3,5-二硝基水楊酸、戊二醛、濃硫酸、酒石酸鉀鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZKW-D-4電熱恒溫水浴鍋 北京中南路業(yè)儀器有限公司；HWJRL-2紅外加熱爐 北京科普瑞醫(yī)療儀器有限公司；FW-80高速萬能粉碎機 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；DELTA320分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZG-303A超純水儀 四川卓越水處理設(shè)備有限公司；Himac CR-20B2大型臺式冷凍離心機、SU8000新型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；GY-4型數(shù)顯式果實硬度計 樂清市艾德堡儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熏蒸處理

將甜瓜放入帶有風(fēng)扇的密封箱中。根據(jù)預(yù)實驗濃度篩選結(jié)果，采用60 μL/L NO熏蒸3 h，以置于密封箱中無NO熏蒸處理的甜瓜作為對照組。每處理30 個甜瓜，重復(fù)3 次。熏蒸處理結(jié)束后，將果實于（25±1）℃放置12 h后進(jìn)行損傷接種處理。

1.3.2 損傷接種

參照Deng Lili等[19]的方法并稍作修改。取在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的A. alternata，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80的無菌水20 mL，用無菌藥匙刮下PDA培養(yǎng)基上的孢子，轉(zhuǎn)移到50 mL三角瓶內(nèi)，搖晃混勻后用紗布濾除大塊絮狀物，將A. alternata孢子濃度調(diào)節(jié)至1×106個/mL。先用無菌水擦拭兩組甜瓜果實的表皮并晾干，再用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液擦洗消毒。晾干后用滅菌的鐵釘在甜瓜橫向中心線等間距穿刺5 個直徑3 mm、深4 mm的孔洞，每個孔洞分別注入20 μL孢子懸浮液，用膠帶封住孔洞。損傷接種后，將果實放入紙箱中于（25±1）℃ 下貯藏，每隔2 d取樣測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 病斑及發(fā)病率測定

每隔2 d測定并記錄貯藏期間各組的病斑直徑、病斑深度和發(fā)病率。

病斑直徑：接種部位果皮削去，用直尺在病斑處進(jìn)行十字交叉法測量病斑直徑，單位為mm。

病斑深度：將接種部位縱向切開，用直尺在病斑處測量病斑深度，單位為mm。

記錄出現(xiàn)病害的孔洞數(shù)量（病斑直徑大于4 mm的孔記為發(fā)病孔數(shù)），發(fā)病率按下式進(jìn)行計算。

1.3.3.2 硬度的測定

用刀片在甜瓜果實橫徑處切開，在距果皮5 mm的切面處選取等間距的6 點，用GY-4型數(shù)顯式果實硬度計進(jìn)行測定（探頭直徑3 mm），多次測定的平均值記為甜瓜果實硬度，單位為N。

1.3.3.3 細(xì)胞膜滲透率的測定

細(xì)胞膜滲透率參照曹建康等[20]的方法測定。

1.3.3.4 果膠物質(zhì)及纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

原果膠、可溶性果膠、纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參照曹建康等[20]的方法。

1.3.3.5 PG、PME、Cx活力的測定

PG活力測定參考Verma等[21]的方法。以每分鐘每克樣品于37 ℃下分解果膠產(chǎn)生1 μg的游離半乳糖醛酸為1 個酶活力單位（U）。

PME活力的測定參照Guo Qin等[22]的方法。以O(shè)D620nm每分鐘減少0.01為1 個酶活力單位（U）。

Cx活力的測定參照曹建康等[20]的方法。以每分鐘每克樣品40 ℃分解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μg的無水葡萄糖為一個酶活力單位（U）。

1.3.3.6 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

在甜瓜接種后第2、6、10天進(jìn)行隨機取樣，用干凈刀片從甜瓜赤道接種部位周圍取0.5 cm×1 cm×2 mm瓜皮，裝入含體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液的離心管中，于4 ℃的條件下固定，固定后分別在體積分?jǐn)?shù)為65%、75%、85%、95%、100%的丙酮溶液中脫水處理20 min，脫水后將瓜皮裁剪成3 mm×2 mm×2 mm的方塊，用導(dǎo)電膠粘在潔凈的工作臺上，通過E-1045離子濺射儀進(jìn)行噴金處理，放入掃描電子顯微鏡工作臺后開始觀察和拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SigmaPlot 12.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和制圖，采用SPSS 22.0軟件對測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯氏多重比較對差異顯著性進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO處理對甜瓜果實貯藏過程中損傷接種病斑的影響

如圖1A所示，NO熏蒸處理可明顯降低果實損傷接種A. alternata后的病斑直徑，貯藏第8天對照組果實病斑直徑為17.64 mm，NO處理組甜瓜果實病斑直徑為8.70 mm，NO處理組病斑直徑比對照組低50.68%，且整個貯藏期間處理組病斑直徑一直顯著低于對照組（P＜0.05）。

如圖1B所示，甜瓜果實在整個貯藏期間，果實病斑深度逐漸增加。在貯藏第6天處理組病斑深度為10.50 mm，對照組果實病斑深度為16.90 mm，對照組病斑深度比處理組深60.95%，且在貯藏第4天開始NO處理組甜瓜果實病斑深度一直顯著低于對照組（P＜0.05）。

如圖1C所示，甜瓜果實的發(fā)病率隨貯藏時間延長而升高，且整個貯藏期間，NO處理組果實發(fā)病率一直低于對照組。NO處理組甜瓜果實在前2 d未發(fā)病。在第8天，對照組果實發(fā)病率為100%，而NO處理組僅有46.70%甜瓜果實發(fā)病，NO處理組發(fā)病率比對照組低53.30%（P＜0.05）。

圖1 NO處理對甜瓜果實貯藏期間病斑直徑（A）、病斑深度（B）、發(fā)病率（C）的影響Fig. 1 Effect of NO treatment on lesion diameter (A), depth (B) and disease incidence (C) of melon fruit

2.2 NO理對甜瓜果實貯藏過程中硬度的影響

如圖2所示，兩組甜瓜果實硬度在貯藏期間均逐漸下降，但經(jīng)NO熏蒸處理后的甜瓜果實硬度在整個貯藏期均高于同期對照組果實。在貯藏結(jié)束時，NO處理組和對照組甜瓜果實硬度分別為24.14 N和17.70 N，與采收時相比分別降低21.37%和42.35%，兩組果實硬度差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

圖2 NO 處理對甜瓜果實貯藏期間硬度的影響Fig. 2 Effect of NO treatment on firmness of melon fruit

2.3 NO處理對甜瓜果實貯藏期間細(xì)胞膜滲透率的影響

圖3 NO處理對甜瓜果實貯藏期間細(xì)胞膜滲透率的影響Fig. 3 Effect of NO treatment on cell membrane permeability of melon fruit

由圖3可知，在整個貯藏過程中兩組果實細(xì)胞膜滲透率總體上呈現(xiàn)出升高趨勢，NO處理組的甜瓜果實細(xì)胞膜滲透率一直低于同期對照組。在第8天時，NO處理組甜瓜果實的細(xì)胞膜滲透率比同期對照組低10.66%（P＜0.05）。

2.4 NO處理對甜瓜果實貯藏期間果膠物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖4 NO處理對甜瓜果實貯藏期間原果膠（A）和可溶性果膠（B）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig. 4 Effect of NO treatment on propectin (A) and soluble pectin (B)contents of melon fruit

由圖4A可知，甜瓜果實原果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)在貯藏過程中呈現(xiàn)出持續(xù)下降趨勢，且NO處理后的甜瓜果實中原果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直比同期對照組高。第8天時，NO處理組甜瓜果實和對照組原果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.049%和0.036%，NO處理組果實中原果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)比同期對照組高36.11%（P＜0.05）。

由圖4B可知，隨著貯藏時間的延長，甜瓜果實可溶性果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，但NO熏蒸處理后的甜瓜上升較為緩慢，且對照組可溶性果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終高于NO處理組。對照組甜瓜果實內(nèi)可溶性果膠在2～8 d內(nèi)增加了48.00%。第6、10天時，NO熏蒸處理后甜瓜果實中可溶性果膠分別比同期對照組低23.60%和37.50%（P＜0.05）。

2.5 NO處理對甜瓜果實貯藏期間纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖5 NO處理對甜瓜果實貯藏期間纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig. 5 Effect of NO treatment on cellulose content of melon fruit

由圖5可知，隨著貯藏時間延長，甜瓜果實纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先上升后下降的趨勢。第6天時，NO處理組和對照組纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到最大值，分別為0.34%和0.30%，NO熏蒸后的甜瓜果實纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照組高13.33%（P＜0.05）。

2.6 NO處理對甜瓜果實貯藏期間PG、PME、Cx活力的影響

圖6 NO處理對甜瓜果實貯藏期間PG（A）、PME（B）、Cx（C）活力的影響Fig. 6 Effect of NO treatment on the activities of PG (A), PME (B) and Cx (C) in melon fruit

如圖6A所示，貯藏期間，甜瓜果實PG活力呈先上升后下降的趨勢，NO處理組PG活力在第2天后開始低于對照組。NO處理組和對照組在第6天達(dá)到最大值，分別為7 258.97 U和8 245.06 U，且NO處理組甜瓜果實PG活力比對照組低11.96%（P＜0.05）。

由圖6B可知，甜瓜果實PME活力隨著貯藏時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。貯藏第6天，NO處理組和對照組甜瓜果實PME活力達(dá)到峰值，分別為14.13 U和22.93 U，NO處理組甜瓜果實PME活力比對照組低38.37%（P＜0.05），兩處理組間的PME活力在貯藏結(jié)束時無顯著差異（P＞0.05）。

如圖6C所示，隨著貯藏時間延長，兩組甜瓜果實Cx活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，NO處理組的甜瓜果實和對照組果實的Cx活力分別在第8、6天達(dá)到最大值，分別為2 771.87 U和3 778.90 U。在貯藏第6天時，NO處理組甜瓜Cx活力為2 710.28 U，比此時對照組低28.28%（P＜0.05）。

2.7 NO處理對甜瓜瓜皮貯藏期間超微結(jié)構(gòu)的影響

圖7 NO處理對甜瓜貯藏期間瓜皮表面氣孔超微結(jié)構(gòu)的影響（×2 000）Fig. 7 Effect of NO treatment on stomatal ultrastructure of melon skin (× 2 000)

在損傷接種A. alternata第2天，NO處理組甜瓜果皮內(nèi)氣孔的結(jié)構(gòu)保持完整（圖7B1），但是對照組氣孔收縮，氣孔結(jié)構(gòu)被破壞（圖7A1）；接種后第6天，對照組果實瓜皮表面氣孔結(jié)構(gòu)遭到破壞，并且被凋亡的細(xì)胞和代謝產(chǎn)物堵塞難以分辨（圖7A2），而NO處理組瓜皮表面氣孔也受到破損，氣孔結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的塌陷（圖7B2）；在貯藏第10天時，NO處理組瓜皮表面氣孔結(jié)構(gòu)發(fā)生塌陷，并且可以看到少量菌絲已從氣孔長出（圖7B3），對照組甜瓜表皮的氣孔被菌絲、凋亡細(xì)胞和代謝物覆蓋，甜瓜表皮氣孔被嚴(yán)重破壞（圖7A3）。

圖8 NO處理對甜瓜貯藏期間瓜皮表面裂紋超微結(jié)構(gòu)的影響（×1 000）Fig. 8 Effect of NO treatment on the ultrastructure of surface cracks in melon fruit (× 1 000)

甜瓜果實在損傷接種A. alternata第2天，NO處理組甜瓜瓜皮裂紋處沒有出現(xiàn)菌絲的生長和擴散（圖8B1），但是對照果實的裂紋處開始出現(xiàn)菌絲生長的現(xiàn)象（圖8A1）；接種后第6天時，NO處理組甜瓜瓜皮裂紋處開始有少量菌絲分布（圖8B2），而對照果實的裂紋處裂紋的深度加深，伴有大量菌絲長（圖8A2）；接種后第10天時，NO處理組甜瓜瓜皮裂紋處裂紋加深并出現(xiàn)部分菌絲生長（圖8B3），而對照果實的裂紋處裂紋的寬度增加，菌絲生長密集（圖8A3）。

3 討 論

一般認(rèn)為細(xì)胞壁是果實發(fā)揮防御作用、抵抗病菌侵染的第一道屏障[23]。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性對果實抗病性有重要的意義，細(xì)胞壁被破壞會導(dǎo)致果實抗病性降低[24]。果蔬細(xì)胞壁的主要組成物質(zhì)有果膠、半纖維素以及纖維素等植物多糖。纖維素與果膠等結(jié)合在一起是組成細(xì)胞壁的基本物質(zhì)，起支撐作用，有利于保持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。采后果實細(xì)胞壁代謝過程中發(fā)生原果膠分解，可溶性果膠比例增高，細(xì)胞內(nèi)中膠層初生壁解體，喪失對原生質(zhì)體的支持力，引起膜破裂，果實抗病性降低[25]。

細(xì)胞壁降解酶引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，是導(dǎo)致植物病害的主要致病因子之一。本實驗結(jié)果說明適量的NO熏蒸處理能夠延緩甜瓜果實PME、PG、Cx活力的上升，可以有效地維持果實中原果膠的含量穩(wěn)定，抑制可溶性果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高，保持細(xì)胞內(nèi)纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對穩(wěn)定，減緩果實細(xì)胞壁代謝。這與高維亞等[26]采用NO熏蒸處理蓮霧果實、敬媛媛等[27]利用水楊酸處理甜瓜果實的研究結(jié)果一致。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時間的延長，甜瓜果實采后細(xì)胞膜滲透率持續(xù)升高，而NO熏蒸處理有利于保持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，抑制果實中細(xì)胞膜滲透率的增加，提高細(xì)胞抗病性。甜瓜果實接種后，果皮接種部位周圍出現(xiàn)突起，這可能是由于細(xì)胞抗病應(yīng)激反應(yīng)形成突起狀結(jié)構(gòu)的乳突，其主要成分是胼胝質(zhì)和木質(zhì)素[28]。隨著果實病情的加重，果皮結(jié)構(gòu)受到破壞，組織結(jié)構(gòu)崩塌，在病原體攻擊后，胼胝質(zhì)可以沉積在質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間或氣孔周圍[29]，作為物理屏障阻止微生物進(jìn)入宿主細(xì)胞或阻止其獲得宿主細(xì)胞的營養(yǎng)從而抑制病原菌生長[30]，而NO處理有效維持果實受侵染時氣孔結(jié)構(gòu)的完整性，NO熏蒸處理的甜瓜果實表面乳突較對照果實明顯變大并且保持時間更長，降低了病原微生物對果實的侵染力。這與She Xiaoping[31]和Tomoko[32]等的研究結(jié)果相近。通過果皮裂紋結(jié)構(gòu)的電子掃描顯微鏡圖片可以看出，對照果實裂紋及氣孔結(jié)構(gòu)遭到很大程度破壞，隨著貯藏時間延長，裂紋的深度和寬度增加，果皮裂紋中布滿菌絲。

本實驗表明采后NO處理可增強甜瓜果實對病原菌的抵抗能力，一方面是因為該處理能抑制甜瓜果實PG、PME和Cx的活力，有效保持了果實的硬度，同時能較好地維持細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、氣孔等結(jié)構(gòu)完整性，抑制細(xì)胞膜滲透率的上升；另一方面是因為采后NO處理能較好地維持細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、氣孔等結(jié)構(gòu)完整性，可有效抑制病原菌侵入。近年來也有研究表明NO可以通過阻礙黑斑病菌的生長來延長蘋果的貯藏時間[33]，說明NO增強果實采后抗病性是多方面的，其機理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

采后60 μL/L NO熏蒸處理能夠明顯抑制甜瓜果實貯藏期間PG、PME、Cx活力及可溶性果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，保持了果實硬度；同時，NO處理能夠有效維持細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、氣孔等結(jié)構(gòu)完整性，抑制細(xì)胞膜滲透率的上升，較好地抑制果實氣孔及裂紋部位菌絲的生長，顯著降低接種果實病斑直徑、病斑深度及發(fā)病率，說明NO熏蒸處理可以通過調(diào)節(jié)甜瓜果實采后細(xì)胞壁代謝，控制其采后病害的發(fā)生。