液浸速凍對(duì)牡蠣水分遷移及品質(zhì)的影響

梁鉆好，陳海強(qiáng)，梁鳳雪，羅宏悅，謝彥安，余 銘,

（1.陽(yáng)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，廣東 陽(yáng)江 529566；2.廣東省食品低溫加工工程技術(shù)研究中心，廣東 陽(yáng)江 529566；3.陽(yáng)江市程村鎮(zhèn)政府，廣東 陽(yáng)江 529821；4.陽(yáng)西縣程村鎮(zhèn)紅光蠔協(xié)會(huì)，廣東 陽(yáng)江 529821）

牡蠣，又被稱為蠔、生蠔，是目前我國(guó)乃至世界產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)貝類[1]。牡蠣以鮮銷為主，但是高含水量（約80%）的牡蠣離水只能存活3～5 d，開(kāi)殼后的牡蠣肉更不耐貯存[2]。冷凍能有效延長(zhǎng)牡蠣肉的貨架期[3]，但冷凍過(guò)程中大冰晶的形成、水分的遷移與凍結(jié)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞機(jī)械破損，解凍后汁液流失嚴(yán)重，影響肉質(zhì)和口感[4]。冰晶的大小和分布與冷凍速率密切相關(guān)，冷凍速率越大，食品內(nèi)部通過(guò)-1～-5 ℃“最大冰晶生成”溫區(qū)的時(shí)間越短，形成細(xì)小的胞內(nèi)晶。因此，冷凍速率是影響冷凍產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素，尋找一種快速冷凍技術(shù)是解決牡蠣由于冷凍變性而導(dǎo)致品質(zhì)下降的主要途徑。在食品工業(yè)中，目前常用的快速冷凍方式有鼓風(fēng)冷凍、平板速凍、流化床冷凍和低溫冷凍，它們的共同點(diǎn)是以氣體作為傳熱介質(zhì)。由于液體傳熱系數(shù)是氣體的20多倍；因此，與傳統(tǒng)的空氣對(duì)流冷凍方式相比，把食品直接浸泡在制冷液中的液浸速凍方式具有冷凍速率快、冷凍均勻、能耗低、干耗小的優(yōu)勢(shì)，形成的冰晶細(xì)小致密且分布均勻，避免了冰晶膨大引起的機(jī)械損傷和細(xì)胞脫水[5]。研究證明，一些果蔬[6-8]、漿汁[5]、水產(chǎn)[9-11]通過(guò)液浸速凍技術(shù)冷凍可最大限度保留食品原有的感官和品質(zhì)。雖然關(guān)于液浸速凍方面的研究還不夠系統(tǒng)，但該技術(shù)是目前快速冷凍技術(shù)中比較具有產(chǎn)業(yè)化前景的技術(shù)[8]。

低場(chǎng)核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）通過(guò)測(cè)定質(zhì)子在磁場(chǎng)中的弛豫特性來(lái)研究樣品中水分的含量、分布、遷移及其他相關(guān)品質(zhì)性質(zhì)[12]，其靈敏度高，且為無(wú)損檢測(cè)，在肉類[13]、水產(chǎn)[14-15]、果蔬[12]、酸奶[16]等多種食品的品質(zhì)鑒定中均有應(yīng)用。如通過(guò)利用LF-NMR研究食品水分遷移與分布特性，可以得出粉末的分子質(zhì)量與吸濕性的關(guān)系并以此推定貯藏穩(wěn)定性[17]，或是跟蹤干燥過(guò)程的水分動(dòng)態(tài)從而監(jiān)測(cè)干燥速率和食品干燥過(guò)程中的質(zhì)構(gòu)特性[18-19]。本研究基于LF-NMR技術(shù)分析牡蠣凍結(jié)后水分含量及遷移的變化，表征冷凍方式對(duì)牡蠣品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍液為體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液；牡蠣由紅光蠔協(xié)會(huì)提供。

牛血清白蛋白、Ca2+-ATPase測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；氯化鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MesoMR23-040V-I NMR成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；KQ-01液浸式速凍機(jī) 廣東科奇超速凍科技有限公司；小型氣流式速凍機(jī) 常州凱曼制冷設(shè)備有限公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)博勒飛公司；TR-52i溫度記錄儀 日本TANDD公司；BD/BC-768Q臥式冰柜 雪花（北京）科技有限公司；BC/BD-208DT臥式冷柜 合肥美菱股份有限公司；JD-8S型真空包裝機(jī)廈門捷鼎機(jī)械設(shè)備有限公司；SY204分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；FJ200-SH數(shù)顯高速分散均漿機(jī)上海標(biāo)本模型廠；TGL-18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 廣東省農(nóng)墾集團(tuán)進(jìn)出口有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理、凍結(jié)與解凍

清洗干凈的牡蠣開(kāi)殼，挑選新鮮無(wú)損傷、大小一致（質(zhì)量為7～12 g）的牡蠣肉進(jìn)行獨(dú)立真空包裝（真空時(shí)間約20 s，牡蠣不變形）。樣品于4 ℃冰柜預(yù)冷1 h，后隨機(jī)分成5 組進(jìn)行不同的冷凍處理：1）對(duì)照（鮮樣）；2）-18 ℃冰柜中靜置冷凍；3）氣流速凍機(jī)中冷凍（凍結(jié)溫度根據(jù)液浸速凍最優(yōu)溫度選擇）；4）液浸速凍，凍結(jié)溫度分別為-10、-18、-25、-35、-45 ℃和-55 ℃；5）-80 ℃超低溫冷凍。

當(dāng)牡蠣中心溫度凍至-18 ℃以下時(shí)，停止凍結(jié)，將樣品迅速轉(zhuǎn)移至-18 ℃冰柜中貯藏待用（24 h以內(nèi)）。測(cè)定指標(biāo)前先把牡蠣樣品轉(zhuǎn)移至4 ℃冰柜中解凍2 h，用于理化指標(biāo)的測(cè)定。對(duì)照組直接用于理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 凍結(jié)曲線和凍結(jié)速率的測(cè)定

凍結(jié)曲線和凍結(jié)速率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]。將溫度記錄儀傳感探頭插至牡蠣肉的中心位置，每隔1 s記錄一次溫度，待樣品中心溫度降至-18 ℃以下終止凍結(jié)，根據(jù)牡蠣肉中心溫度隨時(shí)間的變化，繪制凍結(jié)曲線。凍結(jié)速率采用國(guó)際制冷協(xié)會(huì)提出的方法（式（1））計(jì)算。

式中：δ0表示食品表面與熱中心的最短距離/cm；τ0表示食品表面達(dá)到0 ℃后至熱中心溫度達(dá)初始凍結(jié)點(diǎn)以下10 ℃所需的時(shí)間/h。

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 汁液流失率的測(cè)定

汁液流失率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[21]。用濾紙吸干牡蠣表面水分或汁液，分別稱量解凍前后牡蠣質(zhì)量，汁液流失率按式（2）計(jì)算。

1.3.3.2 蒸煮損失率的測(cè)定

蒸煮損失率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[22]。牡蠣樣品85 ℃恒溫水浴20 min，冷卻至室溫后用濾紙吸干表面水分或汁液，分別稱量蒸煮前后牡蠣質(zhì)量。蒸煮損失率按式（3）計(jì)算。

1.3.3.3 鹽溶性蛋白含量的測(cè)定

鹽溶性蛋白含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]。準(zhǔn)確稱取3.00 g樣品，加入30 mL 0.6 mol/L KCl溶液（4 ℃預(yù)冷），冰水浴中均質(zhì)4 min，4 ℃離心（5 000 r/min、20 min），取上清液3 mL，加入9 mL去離子水（4 ℃預(yù)冷）使肌動(dòng)球蛋白沉淀，4 ℃離心（5 000 r/min、20 min），取沉淀，加入3 mL 1.2 mol/L KCl溶液（4 ℃預(yù)冷），繼續(xù)4 ℃離心（5 000 r/min、20 min），取上清液備用。采用雙縮脲法測(cè)定鹽溶性蛋白含量。

1.3.3.4 Ca2+-ATPase活力的測(cè)定

Ca2+-ATPase活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]。準(zhǔn)確稱取3.00 g樣品，加入9 倍體積的8.5 g/L NaCl溶液（4 ℃預(yù)冷），在冰水浴中均質(zhì)搗碎，4 ℃離心（5 000 r/min，10 min），取上清液，加入8.5 g/L NaCl溶液稀釋到合適的質(zhì)量濃度，按Ca2+-ATPase測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)上的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.5 彈性的測(cè)定

以整只牡蠣為測(cè)定對(duì)象，沸水加熱3 min熟化，取出瀝水，待降至室溫后采用CT3質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定。設(shè)置參數(shù)如下：探頭型號(hào)TA44，測(cè)前探頭下降速率2.00 mm/s，測(cè)試速率1.50 mm/s，測(cè)后探頭回程速率1.50 mm/s，形變50.0%，觸發(fā)值25 g；實(shí)驗(yàn)類型：壓縮。

1.3.3.6 LF-NMR的測(cè)定及成像分析

選取質(zhì)量約為10.00 g的整只牡蠣，濾紙吸干表面汁液，稱質(zhì)量，真空包裝，進(jìn)行NMR測(cè)定，然后凍結(jié)處理，解凍后吸干表面汁液再次進(jìn)行NMR測(cè)定。

測(cè)定方法：放入玻璃試管（口徑40 mm），然后將樣品管置于核磁探頭中，使用CPMG序列測(cè)定橫向弛豫時(shí)間T2。其中參數(shù)設(shè)置如下：磁體溫度32 ℃；重復(fù)采樣等待時(shí)間TW＝2 500.00 ms；重復(fù)采樣次數(shù)NS＝8；回波時(shí)間TE＝0.20 ms；回波個(gè)數(shù)NECH＝12 500；采樣帶寬SW＝200 kHz。模擬增益RG1＝20.0 db；數(shù)字增益DRG1＝3 db；前置放大器增益PRG＝1 db。

核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）分析，參數(shù)設(shè)置：層數(shù)＝1；層厚＝3.0 mm；視野FOV＝100 mm×100 mm；重復(fù)采樣次數(shù)Average＝2；重復(fù)采樣等待時(shí)間TR＝2 000.00 ms；回波時(shí)間TE＝18.125 ms。根據(jù)鮮樣和處理樣的各峰信號(hào)幅度變化計(jì)算不同狀態(tài)水分的損失率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Execl 2010軟件進(jìn)行處理和作圖，橫向弛豫時(shí)間T2反演圖采用Origin 8.0軟件作圖。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍結(jié)溫度對(duì)液浸速凍牡蠣的品質(zhì)影響

凍結(jié)過(guò)程中大冰晶的形成會(huì)對(duì)牡蠣肉的細(xì)胞造成機(jī)械損傷，導(dǎo)致細(xì)胞持水性能變差，表現(xiàn)為解凍后汁液流失和蒸煮損失嚴(yán)重、彈性變差或無(wú)彈性。如表1所示，凍結(jié)溫度對(duì)牡蠣解凍后的汁液流失率和彈性影響不顯著（P＞0.05），可能是由于液浸速凍傳熱快，凍結(jié)速率較快（牡蠣凍至中心溫度低于-18 ℃用時(shí)2～15 min）。蒸煮損失方面，-10 ℃冷凍的牡蠣蒸煮損失略大，-55～-18 ℃之間的差異不顯著?？傮w而言，液浸速凍對(duì)冷凍牡蠣的汁液流失率、蒸煮損失率、彈性影響不大，可維持牡蠣良好的持水能力。

表1 不同溫度下液浸速凍的牡蠣品質(zhì)（n＝6）Table 1 Quality of oysters subjected to immersion freezing at different temperatures (n= 6)

牡蠣蛋白由水溶性的肌漿蛋白、鹽溶性的肌原纖維蛋白和不溶性的基質(zhì)蛋白組成。冷凍過(guò)程中的蛋白變性主要是由肌原纖維蛋白變性引起的，牡蠣在凍結(jié)過(guò)程中，肌原纖維蛋白發(fā)生冷凍變性導(dǎo)致其鹽溶性發(fā)生變化，鹽溶性蛋白含量減少[23]。Ca2+-ATPase活性來(lái)源于肌原纖維蛋白中的肌球蛋白，可表征肌原纖維蛋白頭部S-1片段的性質(zhì)，是衡量蛋白質(zhì)冷凍變性程度的另一重要指標(biāo)[24]。由表1可知，與鮮樣相比，冷凍牡蠣的鹽溶性蛋白含量以及Ca2+-ATPase活力均有不同程度的下降，表明在冷凍過(guò)程中牡蠣的肌原纖維蛋白發(fā)生變性[25-26]。液浸漬溫度從-10 ℃降到-35 ℃過(guò)程中，隨著凍結(jié)速率加快，牡蠣鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活力的下降程度降低，-35 ℃凍結(jié)的牡蠣樣品鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活力與鮮樣最接近，二者之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。但隨著凍結(jié)溫度繼續(xù)降低，牡蠣的鹽溶性蛋白含量反而下降，這可以解釋為凍結(jié)速率過(guò)快，小冰晶過(guò)細(xì)，在凍藏過(guò)程中會(huì)因?yàn)槔洳卦O(shè)備的溫度波動(dòng)而導(dǎo)致部分小冰晶更容易融化，融化后的冰水又在低溫下重新結(jié)冰，即發(fā)生融化再重結(jié)晶的現(xiàn)象[27]，此時(shí)再結(jié)晶更容易被旁邊的冰晶吸收，形成大冰晶。在此過(guò)程中，可能有以下原因?qū)е碌鞍鬃冃裕捍蟊У臄D壓導(dǎo)致蛋白聚集變性；水分遷移形成大冰晶的過(guò)程導(dǎo)致蛋白質(zhì)的水合狀態(tài)發(fā)生改變；體系水化程度降低導(dǎo)致蛋白質(zhì)開(kāi)鏈[28]。

總體分析，-35 ℃凍結(jié)的牡蠣汁液流失和蒸煮損失較少，可保持牡蠣肉固有的良好彈性，鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活力與鮮樣無(wú)顯著差異（P＞0.05），品質(zhì)保持最佳。

2.2 凍結(jié)方式對(duì)牡蠣水分遷移變化的影響

根據(jù)2.1節(jié)凍結(jié)溫度篩選，確定-35 ℃為最優(yōu)液浸速凍溫度，同時(shí)對(duì)比-18 ℃靜置冷凍、-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍效果。

2.2.1 凍結(jié)曲線

圖1 牡蠣凍結(jié)曲線Fig. 1 Freezing curve of oysters

表2 牡蠣不同冷凍方式的凍結(jié)速率（n＝3）Table 2 Freezing speeds of different freezing methods of oysers (n= 3)

由圖1和表2可知，-35 ℃液浸速凍的牡蠣中心溫度降至-18 ℃僅需要5.48 min，用時(shí)最短，凍結(jié)曲線最為陡峭，凍結(jié)速率最大，高達(dá)13.03 cm/h，按凍結(jié)速率等級(jí)劃分，屬于超速凍結(jié)（凍結(jié)速率＞10 cm/h）。-35 ℃液浸速凍的凍結(jié)速率是-18 ℃靜置冷凍的40.7 倍，分別是-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍的5.54、5.94 倍。-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍的凍結(jié)曲線也較為陡峭，二者的凍結(jié)速率和牡蠣中心溫度通過(guò)-1～-5 ℃最大冰晶生成區(qū)的時(shí)間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），屬于快速凍結(jié)（食品中心溫度通過(guò)-1～-5 ℃最大冰晶生成區(qū)的時(shí)間不超過(guò)30 min）。-18 ℃靜置冷凍屬于慢速凍結(jié)（凍結(jié)速率＜0.5 cm/h，食品中心溫度通過(guò)-1～-5 ℃最大冰晶生成區(qū)的時(shí)間超過(guò)30 min），其凍結(jié)曲線在-1～-5 ℃區(qū)間非常平緩。

大部分食品中心溫度從-1 ℃降至-5 ℃時(shí)，近80%的水分可凍結(jié)成冰，此溫度范圍稱為“最大冰晶生成區(qū)”。一般凍結(jié)速率越快，通過(guò)-1～-5 ℃溫區(qū)的時(shí)間越短，冰層向內(nèi)伸展的速率比水分移動(dòng)速率要快時(shí)，其冰晶就越細(xì)小，冰晶分布越接近新鮮物料中原來(lái)水分的分布狀態(tài)。-35 ℃液浸速凍的牡蠣通過(guò)最大冰晶生成區(qū)時(shí)間僅需2.15 min，其凍結(jié)速率比-35 ℃氣流冷凍或-80 ℃超低溫冷凍快約5 倍。

2.2.2 凍結(jié)方式對(duì)牡蠣水分分布的影響

鮮樣和凍結(jié)后解凍的牡蠣樣品LF-NMR橫向弛豫時(shí)間T2反演的標(biāo)準(zhǔn)譜圖見(jiàn)圖2。橫向弛豫時(shí)間T2反映了樣品內(nèi)部氫質(zhì)子的自由度及其所受束縛力的大小，且與其成反比關(guān)系[12]。牡蠣的T2反演圖有4 個(gè)峰，分別標(biāo)記為T21、T22、T23、T24。其中T21（0.2 ms）為強(qiáng)結(jié)合水，T22（2.3～3.5 ms）為弱結(jié)合水，T23（57～73 ms）為不易流動(dòng)水，T24（460～650 ms）為自由水。4 種凍結(jié)方式的牡蠣解凍后的T21峰和T22峰與鮮樣差異不大，但T24峰的幅度均有明顯降低，而T23峰幅度也有不同程度的降低。這表明，凍結(jié)對(duì)牡蠣的結(jié)合水影響不大，解凍后自由水大量流失，不易流動(dòng)水因凍結(jié)方式不同，損失率不同。

圖2 牡蠣凍結(jié)前與解凍后的橫向弛豫時(shí)間T2反演圖Fig. 2 Signal amplitude curves as a function of transverse relaxation time T2 for oysters before freezing and after thawing

圖3 牡蠣解凍后的不同狀態(tài)水分的損失率Fig. 3 Water loss of oysters after thawing

牡蠣在解凍后不易流動(dòng)水和自由水與鮮樣對(duì)比有不同程度的損失，表現(xiàn)為汁液流失。圖3A顯示，4 種凍結(jié)方式中，-18 ℃靜置冷凍的牡蠣解凍后不易流動(dòng)水損失率顯著高于其他組（P＜0.05），高達(dá)12%以上，其次是-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍，損失率分別為6.70%和4.75%，二者無(wú)顯著差異（P＞0.05），-35 ℃液浸速凍牡蠣的不易流動(dòng)水損失率最少（2.11%），僅分別為-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍的31.5%、44.4%。自由水束縛力最小，4 種凍結(jié)方式的牡蠣解凍后自由水損失率在81%～87%之間，差異不顯著（P＞0.05）。

不易流動(dòng)水存在于牡蠣肌原纖維細(xì)胞間質(zhì)和肌原纖維細(xì)胞內(nèi)，凍結(jié)解凍可能導(dǎo)致牡蠣肌纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化，引起水分遷移、變化[29]。而且不易流動(dòng)水是牡蠣水分的主要存在狀態(tài)，約占3 種水分的90%（通過(guò)T2反演圖峰面積計(jì)算），因此這部分水的損失直接影響到整體的汁液流失率。凍結(jié)方式導(dǎo)致牡蠣解凍后不易流動(dòng)水損失率的差異可以歸結(jié)于凍結(jié)速率，-18 ℃靜置冷凍方式的凍結(jié)速率最慢（圖1），凍結(jié)速率最小，細(xì)胞間隙的冰晶最大，刺破細(xì)胞膜，產(chǎn)生許多通道，可以使細(xì)胞內(nèi)容物在解凍時(shí)流出[30-31]；與此相反，液浸速凍速率最快，液浸速凍牡蠣的水分損失最少。

2.2.3 不同凍結(jié)方式牡蠣的MRI

MRI偽彩圖中的顏色深淺反映了質(zhì)子密度不同引起的弛豫時(shí)信號(hào)強(qiáng)弱差別[32]。由圖4中可知，-35 ℃液浸速凍的牡蠣解凍后，肉體內(nèi)部有大面積黃紅色區(qū)域，表明該區(qū)域水分含量較高，與鮮樣對(duì)比的信號(hào)差值圖顯示，肉體邊緣信號(hào)差值較低（綠色），內(nèi)部基本無(wú)信號(hào)差值（藍(lán)色），即解凍后牡蠣樣品邊緣有少量汁液流失，肉體內(nèi)部的水分含量和分布與鮮樣的差異不大。這一結(jié)果與上述液浸速凍牡蠣不易流動(dòng)水損失最少的結(jié)論一致。其他3 種凍結(jié)方式處理的牡蠣解凍后，NMR信號(hào)值普遍較低，僅有零星小面積的黃色區(qū)域，與鮮樣對(duì)比的信號(hào)差值圖整體偏藍(lán)綠色，或略微帶黃色。這表明其他3 種凍結(jié)方式處理的牡蠣解凍后整體均有汁液流失，細(xì)胞持水性減弱。

圖4 牡蠣鮮樣與解凍后的MRI偽彩圖Fig. 4 Magnetic resonance images of fresh oysters and frozen-thawed oysters

3 結(jié) 論

本研究采用液浸速凍方式凍結(jié)牡蠣，對(duì)解凍后的牡蠣進(jìn)行品質(zhì)分析，得出液浸速凍的最佳凍結(jié)溫度為-35 ℃，此凍結(jié)溫度下的牡蠣汁液流失和蒸煮損失較少，能較好地保持牡蠣肉固有的良好彈性，鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活力與鮮樣之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），品質(zhì)保持最佳。而且按凍結(jié)速率區(qū)分，-35 ℃液浸速凍屬于超速凍結(jié)。以-18 ℃靜置冷凍、-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍作對(duì)照，通過(guò)LF-NMR測(cè)定凍結(jié)后解凍的牡蠣水分含量和分布，結(jié)果表明：不同凍結(jié)方式的牡蠣解凍后的不易流動(dòng)水和自由水均有明顯損失，凍結(jié)方式對(duì)牡蠣自由水損失率無(wú)顯著影響，但對(duì)不易流動(dòng)水損失率影響顯著，其中-35 ℃液浸速凍牡蠣的不易流動(dòng)水損失率最小，僅分別為-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍的31.5%和44.4%。MRI成像也得出類似結(jié)論。