熱聚集對(duì)β-乳球蛋白消化行為及消化產(chǎn)物的抗氧化性的影響

林展拓，高志明,2,，杜徐楠，陳改亭，胡 猛，方亞鵬,2,，湯 虎

（1.湖北工業(yè)大學(xué)菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.湖北工業(yè)大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢 430068）

食物的抗氧化活性對(duì)人體健康有著重要意義。當(dāng)人體利用氧氣進(jìn)行某些代謝反應(yīng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生活潑的自由基，該自由基能導(dǎo)致人類超過100 種疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、胃炎、癌癥和急性艾滋病等[1]。因此，增加食物的抗氧化活性以穩(wěn)定自由基多余的電子具有重要的作用。有研究表明，一些蛋白質(zhì)酶解后形成的多肽或者寡肽具有一定的抗氧化性，如大豆蛋白[2-4]、螺旋藻蛋白[5-6]和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）[7-8]等。

蛋白質(zhì)在不同環(huán)境（例如不同溫度和酸堿度）下熱處理，會(huì)形成不同形式的聚集體，這些具有不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)聚集體在人體胃腸道中具有不同的消化行為。Zhang Sha等[9]在不同pH值下加熱乳清蛋白形成了不同聚集體，并發(fā)現(xiàn)這些不同的乳清蛋白聚集體在模擬胃液中有不同的消化率。Zhang Jie等[10]通過熱處理制備了大豆分離蛋白納米顆粒聚集體，并對(duì)其模擬胃部消化，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白納米顆粒聚集體的消化率比未經(jīng)熱處理的大豆分離蛋白的消化率高。因此蛋白質(zhì)的聚集形態(tài)對(duì)其消化行為有著重要影響。不僅如此，蛋白質(zhì)的聚集形態(tài)還與其消化產(chǎn)物的抗氧化性有一定聯(lián)系。Lin Suju等[11]在95 ℃下加熱乳清蛋白生成聚集體，并對(duì)其模擬胃腸道消化，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白加熱生成聚集體后，其消化產(chǎn)物的抗氧化性提高。Wang Xuefen等[12]在不同溫度下處理卵白蛋白，并模擬了胃腸道消化，發(fā)現(xiàn)在較高溫度處理下，卵白蛋白的消化產(chǎn)物中含有更多的抗氧化性肽段。由此可得，不同蛋白質(zhì)聚集體消化產(chǎn)物的抗氧化性差異明顯。

BLG是乳清蛋白的重要組成部分，約占乳清蛋白總量的1/2。BLG的分子質(zhì)量約為18.3 kDa，等電點(diǎn)是5.1～5.3，含有162 個(gè)氨基酸殘基[13]。在pH值小于3條件下，BLG具有穩(wěn)定的球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)，其疏水基團(tuán)在內(nèi)部形成高度疏水的“β-桶”結(jié)構(gòu)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)擬采用BLG作為原料蛋白，根據(jù)不同食品加工條件分別制備了納米顆粒聚集體（BLG nanoparticle aggregates，BLGN）、蠕蟲狀聚集體（BLG worm-like aggregates，BLGW）和纖維狀聚集體（BLG fibril aggregates，BLGF）3 種不同形式的熱聚集體，在此基礎(chǔ)上研究不同聚集方式對(duì)其消化行為和消化產(chǎn)物抗氧化性的影響，為蛋白質(zhì)食品的設(shè)計(jì)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛奶購(gòu)于武漢新東楊畜牧養(yǎng)殖專業(yè)合作社；胃蛋白酶（酶活力3 000 U/g）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（Gly） 上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為分析純級(jí)，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204型分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；LGJ-12型冷凍干燥機(jī) 鄭州宏郎儀器設(shè)備有限公司；納升電噴霧離子源-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Nanoelectron spray ionization liquid chromatography-tandem mass spectrometry，Nano-ESI-LC-MS/MS）儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 BLG的提取

在每升新鮮牛奶中加入0.5 g NaN3，置于40 ℃水浴鍋中加熱1 h。待其冷卻至室溫后，在5 000 r/min下離心30 min以去除乳脂，取其上清液并調(diào)節(jié)pH值至4.6，靜置過夜以沉淀酪蛋白，并在10 000 r/min下離心20 min以除去酪蛋白。接著在每升樣液里加入17.64 g檸檬酸三鈉和46.2 g檸檬酸以調(diào)節(jié)樣液pH值至3.6～3.7。接著將其置于50 ℃水浴鍋中加熱2 h后靜置過夜。將樣液先在4 000 r/min下離心20 min，再在10 000 r/min下離心20 min，離心后取上清液置于50 ℃水浴鍋中加熱2 h并靜置過夜，該過程重復(fù)3 次。將得到的樣液用0.45 μm水系濾膜抽濾2 次后，用7 000 Da透析袋在4 ℃下透析3 d，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為96%的BLG粉末。

1.3.2 BLG聚集體的制備

用超純水配制一定質(zhì)量濃度的BLG分散液（起始pH值約為7.4），通過0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，并在高溫下加熱一定時(shí)間，使BLG形成聚集體，之后迅速轉(zhuǎn)移至冰水浴中冷卻。將得到的樣液用相同pH值的水透析3 d（每隔2 h換一次水）后冷凍干燥得到BLG聚集體粉末。不同聚集體制備條件[16]如表1所示。

表1 不同BLG熱聚集體的制備條件Table 1 Preparation conditions for different BLG thermal aggregates

1.3.3 透射電子顯微鏡觀察

將凍干后的蛋白質(zhì)熱聚集體樣品分散在水中配制成0.5 mg/mL的分散液，以60%的功率水浴超聲15 min，促進(jìn)樣品分散。接著用移液槍吸取5 μL樣品滴至銅網(wǎng)上，自然晾干后用移液槍吸取10 mg/mL的磷鎢酸（水浴超聲30 min后用0.22 μm水相濾膜過濾）滴至樣品表層進(jìn)行負(fù)染，再次晾干后進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察。

1.3.4 表面疏水性的測(cè)定

采用ANS熒光探針法測(cè)定蛋白質(zhì)的表面疏水性。配制pH值為2.0、濃度為0.05 mol/L的Gly-HCl緩沖液，將蛋白質(zhì)樣品分散其中，其分散的質(zhì)量濃度范圍為0.05～1.00 mg/mL。配制8 mmol/L的ANS（現(xiàn)配現(xiàn)用，避光），取20 μL加入至2 mL樣品分散液中充分混合反應(yīng)，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量其反應(yīng)至3 min時(shí)的熒光強(qiáng)度。測(cè)量參數(shù)如下：激發(fā)波長(zhǎng)λex＝390 nm（狹縫5 nm），發(fā)射波長(zhǎng)λem＝470 nm（狹縫5 nm）。以樣品分散液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作曲線，曲線的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（S0）。

1.3.5 模擬胃部消化

將凍干后的蛋白質(zhì)聚集體樣品分散于超純水中，配制成1 mg/mL的樣品分散液。將樣品分散液和配制好的胃蛋白酶液（質(zhì)量濃度為20 mg/mL）在37 ℃下調(diào)節(jié)pH值至2.0。將胃蛋白酶液（酶與底物的體積比為1∶1.4）加入樣品分散液中，消化3 h后加入一定量的0.1 mol/L碳酸鈉溶液（V消化液：V碳酸鈉溶液＝9∶1）以滅酶。滅酶后將樣品置于4 ℃冰箱低溫保存以備用。

1.3.6 蛋白質(zhì)胃部消化率的測(cè)定

參照Chang Cuihua等[17]的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定1.3.5節(jié)滅酶后樣品的蛋白質(zhì)水解度。

OPA試劑的配制：配制40 mg/mL OPA的甲醇溶液，并避光保存。取1.906 8 g四硼酸鈉、0.1 g SDS和88 mg DTT于90 mL超純水中，待其充分溶解后，將OPA的甲醇溶液全部加入其中充分混合，然后全部轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中定容。

取0.2 mL待測(cè)液于1.5 mL的OPA試劑中充分混合反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其反應(yīng)至2 min時(shí)在340 nm波長(zhǎng)處的吸光度。其水解度（degree of hydrolysis，DH）按公式（1）計(jì)算。

式中：A0、At分別為水解前、水解后的吸光度；M為蛋白質(zhì)摩爾質(zhì)量/（g/moL）；ε為摩爾消光系數(shù)（6 000 L/（moL·cm)）；ρ為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；N為每個(gè)分子平均肽鍵數(shù)量。

1.3.7 Nano-ESI-LC-MS/MS分離鑒定消化產(chǎn)物

取1.3.5節(jié)中滅酶后的樣品10 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行Nano-EsI-LC-MS/MS分離鑒定，其參數(shù)和方法參照Wang Xuefen等[12]的實(shí)驗(yàn)。將得到的肽段序列放到BIOPEP的Bioactive peptides數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物活性分析，得到所選肽段中具有抗氧化活性的片段，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.8 抗氧化活性的測(cè)定

取1.3.5節(jié)中滅酶后的樣品10 000 r/min離心10 min，取上清液作為以下實(shí)驗(yàn)的樣品。

DPPH自由基清除能力測(cè)定[18]：將實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別為空白組（A組）和樣品組（B組），具體配制方法如下。A組：配制20 mg/L的DPPH乙醇溶液，取其2 mL與2 mL無水乙醇混合，并避光反應(yīng)30 min后，以無水乙醇作為空白對(duì)照，在517 nm處測(cè)其吸光度；B組：將A組中2 mL無水乙醇換成2 mL樣品，其余操作一致。DPPH自由基清除能力通過公式（2）計(jì)算。

式中：AA為A組溶液的吸光度；AB為B組溶液的吸光度。

羥自由基清除能力的測(cè)定：參照Venkatachalam等[1]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)。該實(shí)驗(yàn)分成3 組，分別是空白組、樣品組和對(duì)照組，具體配制方法如下。空白組：配制8.8 mg/mL過氧化氫溶液、9 mg/L水楊酸乙醇溶液和9 mg/L硫酸亞鐵溶液，均取2 mL并將其充分混合后，加入2 mL超純水，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，然后在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度；樣品組：將空白組中的超純水換成樣品分散液，其余操作一致。對(duì)照組：6 mL超純水與2 mL樣品混合均勻，在37 ℃水浴反應(yīng)30 min，然后在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度；所有樣品均用超純水稀釋一定倍數(shù)使吸光度在0.2～0.8范圍內(nèi)，樣品中的羥自由基清除活性按公式（3）計(jì)算。

式中：A0為空白組溶液的吸光度；A1為樣品組溶液的吸光度；A2為對(duì)照組溶液的吸光度。

超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定：該實(shí)驗(yàn)分為2組，分別為樣品組（A組）和空白組（B組），具體配制方法如下。A組：配制pH 8.2、50 mg/L的Tris-HCl緩沖液，取其4.5 mL并加入4 mL超純水，再加入0.2 mL樣品分散液混合均勻。然后在25 ℃反應(yīng)10 min后加入0.3 mL 3 mg/mL的鄰苯三酚溶液（鄰苯三酚用10 mmol/L HCl溶液溶解）混勻，在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，每30 s測(cè)一次，測(cè)到5 min；B組：將A組中的樣品分散液換成超純水，其余操作一致。樣品的超氧陰離子自由基清除活性按公式（4）計(jì)算。

式中：k0為溶液B在5 min內(nèi)吸光度變化的斜率；k1為溶液A在5 min內(nèi)吸光度變化的斜率。

還原能力的測(cè)定[19]：配制pH 6.6、50 mg/mL的磷酸鹽緩沖液與10 mg/mL的鐵氰化鉀，均取2 mL充分混合后，加入2 mL樣品混合均勻。在50 ℃反應(yīng)20 min，然后加入2 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，靜置1 h后在5 000×g下離心10 min，取2.5 mL上清液與0.5 mL 1 mg/mL的三氯化鐵和2.5 mL超純水混合均勻，反應(yīng)10 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度，吸光度越高，代表還原能力越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05時(shí)為顯著性差異，并用Origin 8.0、MATLAB等軟件處理數(shù)據(jù)并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BLG及其聚集體形貌

圖1 BLG及其聚集體的透射電子顯微鏡圖Fig. 1 Transmission electron micrographs of BLG and its aggregates

圖1 A是pH 5.8、85 ℃下加熱15 min得到的BLGN，從圖2A中可以看出BLGN粒徑為200 nm左右。Hoffmann等[20]在相同條件下制備的BLGN粒徑為170 nm左右，與本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果相近。圖1B是在pH 7.0、85 ℃下加熱15 min得到的BLGW，從圖2B中可以看出BLGW的長(zhǎng)度在60～225 nm之間，與Schmitt等[21]報(bào)道的結(jié)果相似。圖1C是在pH 2.0、80 ℃下加熱16 h形成的BLGF，從圖2B中可以看出BLGF的長(zhǎng)度在300～1 000 nm之間，由于經(jīng)過凍干和重新分散，這些聚集體的長(zhǎng)度分布較寬。Adamcik等[22]通過原子力顯微鏡表征了蛋白質(zhì)納米纖維的精細(xì)結(jié)構(gòu)，認(rèn)為蛋白質(zhì)納米纖維最初形成“原纖維”即單股聚集體，然后經(jīng)過螺旋纏繞逐步形成多股螺旋結(jié)構(gòu)，形成成熟的納米纖維。圖1D是未變性的BLG，從圖2A中可以看出BLG是粒徑為3 nm左右的球狀顆粒，這與報(bào)道的結(jié)果[13,16]一致。

圖2 BLG及其聚集體的粒徑或長(zhǎng)度分布Fig. 2 Particle size or length distribution of BLG and its aggregates

2.2 不同聚集體表面疏水性

圖3 BLG及其聚集體的表面疏水性Fig. 3 Surface hydrophobicity of BLG and its aggregates

如圖3所示，BLG及其聚集體的表面疏水性大小依次為BLGN＞BLGW＞BLGF＞BLG，三種不同聚集體的表面疏水性均大于BLG本身，說明熱聚集能導(dǎo)致BLG的表面疏水性增加，這與Nicolai等[16]報(bào)道的結(jié)果相似。根據(jù)該報(bào)道，蛋白質(zhì)加熱溫度超過80 ℃后，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露并發(fā)生聚集，提高了表面疏水性。由此可見，不同條件制備的BLG聚集體，表面疏水性不同。

2.3 熱聚集對(duì)水解度的影響

表2 模擬胃液中BLG及其聚集體的水解度Table 2 Hydrolysis degree of BLG and its aggregates in simulated gastric fluid

如表2所示，BLGN、BLGW、BLGF和BLG在模擬胃液中的水解度分別為（11.86±0.24）%、（10.55±0.22）%、（9.08±0.21）%和（3.46±0.16）%，差異顯著。BLG的水解度較其他3 種聚集體要低得多，根據(jù)Nicolai等[16]的報(bào)道，是因?yàn)锽LG獨(dú)特的“β-桶”結(jié)構(gòu)，使得疏水基團(tuán)被掩埋在BLG結(jié)構(gòu)內(nèi)部，胃蛋白酶的作用位點(diǎn)較少，導(dǎo)致水解度偏低。BLGN、BLGW、BLGF和BLG的水解度從大到小依次為BLGN＞BLGW＞BLGF＞BLG，該結(jié)果與其表面疏水性呈正相關(guān)。Zhang Sha等[9]等曾在乳清分離蛋白的消化研究中得到過類似的結(jié)果。該報(bào)道分別在pH 3.0、6.0、7.0，85 ℃下加熱30 min制備了不同的熱聚集體并模擬胃部消化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3 種pH值下制備的聚集體水解率從大到小依次為pH 6.0＞pH 7.0＞pH 3.0。Coligan等[23]發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶主要作用于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸殘基，這些殘基是形成表面疏水性的原因。因此這三種聚集體在胃液中的水解率與表面疏水性有關(guān)，表面疏水性越強(qiáng)，水解率越高。

2.4 消化產(chǎn)物的Nano-ESI-LC-MS/MS分離鑒定

圖4 BLG及其聚集體消化產(chǎn)物中鑒定到的肽段的種類Fig. 4 Molecular mass distribution of peptides identified in the digestion products of BLG and its aggregates

從BLGN、BLGW、BLGF和BLG的消化產(chǎn)物中分別鑒定到170、156、189、154 種肽段，肽段種類與水解度之間的相關(guān)性不明顯。有可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)條件下的分子質(zhì)量鑒定范圍為700～5 000 Da，BLGN和BLGW因水解度高，產(chǎn)生了更多分子質(zhì)量低于700 Da的寡肽甚至氨基酸，因此難以鑒定。

根據(jù)分子質(zhì)量不同，將4 種樣品消化產(chǎn)物分成了700～1 500、1 500～3 000 Da和3 000～5 000 Da三組。由圖4可知，經(jīng)胃蛋白酶消化后，鑒定到3 000～5 000 Da組肽段種類都最少，1 500～3 000 Da組肽段種類居中，700～1 500 Da組肽段種類最多，說明四種樣品消化后均生成了低分子質(zhì)量肽段，且種類較多。對(duì)于700～1 500 Da組，其肽段種類從多到少依次為BLGN＞BLGW＞BLGF＞BLG，分別為109、108、102和100。說明BLGN水解率高，多肽鏈水解更充分，形成的低分子質(zhì)量肽段相應(yīng)增多，該結(jié)果與2.3節(jié)中的水解度吻合。對(duì)于1 500～3 000 Da組，BLG及其不同聚集體消化產(chǎn)物中的肽段種類從多到少依次為BLGF＞BLG＞BLGN＞BLGW，分別為69、45、43和37。纖維聚集體消化后得到的中鏈肽段最多，可能是小分子質(zhì)量肽段重新組裝的結(jié)果。Bateman等[24]發(fā)現(xiàn)BLGF被水解后會(huì)自組裝形成新的肽鏈，因此導(dǎo)致分子質(zhì)量增加。對(duì)于3 000～5 000 Da組，BLGN、BLGW、BLGF和BLG消化后的產(chǎn)物中鑒定到的肽段種類分別為18、11、18和9。BLG鑒定到的肽段種類最少可能是因?yàn)槿杂性S多未水解的肽段分子質(zhì)量大于5 000 Da，導(dǎo)致鑒定不到。

圖5 BLG及其聚集體消化產(chǎn)物中鑒定到的肽段的維恩圖Fig. 5 Venn diagram of peptides identified in the digestion products of BLG and its aggregates

圖5 直觀地顯示了BLG及其不同聚集體的消化產(chǎn)物的共有肽段和獨(dú)有肽段。BLG及其聚集體的消化產(chǎn)物中有90 種共有肽段，這表明這些肽段在BLG熱聚集過程中不受溫度和pH值影響。在各消化產(chǎn)物中，BLGN有14 種獨(dú)有肽段，BLGF有59 種獨(dú)有肽段，BLGW有13 種獨(dú)有肽段，BLG有21 種獨(dú)有肽段。說明不同聚集方式對(duì)BLG的消化產(chǎn)物具有顯著影響。

Bromley[25]、Hernández-Ledesma[26]等發(fā)現(xiàn)氨基酸序列為WYSLAMA（色氨酸-酪氨酸-絲氨酸-亮氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸）和HMIRL（組氨酸-蛋氨酸-異亮氨酸-精氨酸-亮氨酸）的肽鏈具有很強(qiáng)的抗氧化活性，如果肽鏈中含這些序列，則該肽段可能具有抗氧化性。WYSLAMA的抗氧化性主要是因?yàn)閃、Y和M的存在及它們?cè)谛蛄兄械奈恢肹25]；HMIRL的抗氧化性主要是因?yàn)镸的存在[26-27]。因此理論上講，含氨基酸序列為WYSLAMA與HMIRL的肽段數(shù)量越多，其抗氧化性應(yīng)越強(qiáng)。根據(jù)Nano-ESI-LC-MS/MS分離鑒定結(jié)果，BLGN、BLGW、BLGF和BLG的消化產(chǎn)物中，含氨基酸序列WYSLAMA的肽段種類分別為16、10、22和8，占各自總肽段的9.4%、6.4%、11.6%和5.2%；含氨基酸序列HMIRL的肽段種類分別為10、9、16和11，占各自總肽段的5.9%、5.8%、8.5%和7.1%。由此可以看出，BLG及其不同聚集體的消化產(chǎn)物中均含有具有抗氧化活性的肽段，但聚集方式對(duì)其消化產(chǎn)物中具有抗氧化活性的肽段的組成及總數(shù)具有明顯影響，其中BLGF的消化產(chǎn)物具有較多的抗氧化性肽段。

圖6 BLG及其聚集體消化產(chǎn)物中鑒定到的抗氧化肽段的維恩圖Fig. 6 Venn diagram of the antioxidant peptides identified in the digestion products of BLG and its aggregates

圖6 直觀地展示了BLG及其聚集體消化產(chǎn)物中含氨基酸序列為WYSLAMA和HMIRL的肽段的分布情況。根據(jù)圖6，鑒定到BLG及其聚集體消化產(chǎn)物中含氨基酸序列為WYSLAMA與HMIRL的共有肽段分別有7 種與6 種，這說明這些抗氧化肽段在BLG聚集前后空間結(jié)構(gòu)或所處的微環(huán)境沒有發(fā)生改變，因此酶切位點(diǎn)不變。BLGF中含氨基酸序列為WYSLAMA與HMIRL的獨(dú)有肽段分別有8 種與9 種，多于BLGN、BLGW和BLG消化產(chǎn)物的獨(dú)有肽段種類。這說明BLGF的形成有利于產(chǎn)生更多的抗氧化性肽段。

2.5 抗氧化活性分析

蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物是一個(gè)混合體，它包含了部分未水解的蛋白、不同分子質(zhì)量的肽以及不同的氨基酸，而這些組分的抗氧化機(jī)制不完全相同。物質(zhì)的抗氧化性主要包括氧自由基淬滅能力、金屬離子螯合能力和還原能力等，因此本實(shí)驗(yàn)通過DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率以及總還原能力多個(gè)方面綜合分析了BLG及其不同聚集體的消化產(chǎn)物的抗氧化活性。

圖7 BLG及其聚集體消化產(chǎn)物的抗氧化活性Fig. 7 Antioxidant activity of the digestion products of BLG and its aggregates

DPPH自由基是一種含有機(jī)氮的很穩(wěn)定的自由基，它在517 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的光吸收，當(dāng)加入抗氧化物質(zhì)時(shí)，DPPH自由基的醇溶液顏色變淺導(dǎo)致的吸光度變化與清除自由基能力呈正相關(guān)，故可以用來評(píng)價(jià)作為氫供體或者自由基捕獲劑作用的物質(zhì)的抗氧化能力高低[28]。從圖7A中可以看出，BLGN、BLGW、BLGF和BLG的模擬胃液消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率分別為（48.00±5.62）%、（45.91±7.64）%、（51.99±15.33）%和（97.48±5.65）%，其中BLG胃部消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，3 種聚集體的DPPH自由基清除率沒有顯著性差異。

羥自由基是人體所含的活性最強(qiáng)的一種水溶性自由基，它易與細(xì)胞成分和生物分子發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)從而對(duì)人體造成傷害，因此測(cè)定羥自由基清除活性具有重要意義[17]。從圖7B中可以看出，經(jīng)過胃部消化后BLGN、BLGW、BLGF和BLG的羥自由基清除率分別為（8.73±1.23）%、（10.07±0.69）%、（17.74±1.57）%和（19.59±2.35）%，其中水解度較低的BLGF和BLG的羥自由基清除率較高，水解度較高的BLGN和BLGW的羥自由基清除率較低，與楊瑾[29]的報(bào)道一致。在該報(bào)道中，雞蛋蛋清蛋白水解度與羥自由基清除率呈負(fù)相關(guān)。這是因?yàn)檫^高的水解率導(dǎo)致具有抗氧化活性的肽段被水解，從而使得羥自由基清除率較低。

超氧陰離子自由基是人體含量較多的一類親水性氧中心自由基，它可以作為電子受體形成其他的活性氧自由基[30]。鄰苯三酚在堿性條件下自氧化生成超氧陰離子自由基和在320 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈吸收的有色中間體，在反應(yīng)初期（5 min左右），有色中間體的積累量與反應(yīng)時(shí)間成正比。當(dāng)加入抗氧化劑后，阻礙了鄰苯三酚的氧化，使其超氧陰離子自由基和有色中間體產(chǎn)生減少，因此抗氧化能力可以通過有色中間體的吸光度來間接測(cè)定。根據(jù)圖7C可知，經(jīng)過胃部消化后BLGN、BLGF、BLGW和BLG的超氧陰離子自由基清除率分別為（13.29±0.26）%、（14.61±0.20）%、（15.61±0.26）%和（16.11±0.29）%，其中BLGF和BLG的消化產(chǎn)物的超氧陰離子自由基清除率最高，BLGW其次，BLGN最低，也是因?yàn)檫^高的水解率引起抗氧化性肽段水解，進(jìn)而導(dǎo)致超氧陰離子自由基清除率低。

還原能力是評(píng)價(jià)抗氧化劑提供電子能力的一個(gè)指標(biāo)，一般認(rèn)為，物質(zhì)的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的原理是通過測(cè)定鐵氰化鉀中的三價(jià)鐵被還原成的二價(jià)鐵在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度，來反映樣品的還原能力，吸光度越高代表還原能力越強(qiáng)，抗氧化能力就越強(qiáng)[18]。根據(jù)圖7D，經(jīng)過胃部消化后的還原能力從強(qiáng)到弱依次為BLGF＞BLGN＞BLGW＞BLG，該趨勢(shì)與含氨基酸序列為WYSLAMA的肽段種類一致，即含氨基酸序列為WYSLAMA肽段種類越多，還原能力越強(qiáng)。由此可見，含氨基酸序列為WYSLAMA的肽段與還原能力呈正相關(guān)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在不同條件下制備了BLG的3 種聚集體，并對(duì)BLG及其不同聚集體模擬胃部消化，其消化率從小到大依次為BLGN＞BLGW＞BLGF＞BLG。其原因與其表面疏水性有關(guān)。

通過模擬胃液消化BLG及其不同的聚集體，得到不同分子質(zhì)量的肽段。其中BLGF和BLGN兩種聚集體的消化產(chǎn)物中的抗氧化肽段或潛在的抗氧化肽段種類比BLG消化產(chǎn)物多，而BLGF消化產(chǎn)物中最多。BLG消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，3 種聚集體的DPPH自由基清除率沒有顯著性差異。BLG和BLGF消化產(chǎn)物的羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率最高，且沒有顯著性差異。BLGF消化產(chǎn)物的還原能力最強(qiáng)，BLG消化產(chǎn)物的還原能力最弱，其原因可能與含氨基酸序列為WYSLAMA肽段種類有關(guān)，含氨基酸序列為WYSLAMA肽段種類越多，還原能力越強(qiáng)。由此可以得出，BLG消化產(chǎn)物的抗氧化性主要?dú)w功于自由基清除能力，BLG聚集體消化產(chǎn)物的抗氧化性主要?dú)w功于還原能力。