DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因致原發(fā)性卵巢功能不全的研究進(jìn)展

顏圣和，柴雪晨，方舒雨，夏小雨

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)與遺傳發(fā)育學(xué)系，上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，上海 200025)

近年來，原發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)發(fā)病率逐漸上升，且呈年輕化趨勢。POI是一種病因復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，約有20%～25%的患者攜帶遺傳突變[1]，另外還可能與病毒感染、代謝異常、自身免疫、醫(yī)源性及環(huán)境等因素相關(guān)。通過遺傳學(xué)研究，已發(fā)現(xiàn)多種可能導(dǎo)致POI的染色體異常，例如，以Turner綜合征為代表的染色體數(shù)目異常，以及POF1區(qū)域缺失或POF2區(qū)域易位等染色體結(jié)構(gòu)異常。已知與POI相關(guān)的候選基因涉及卵巢發(fā)育及卵子發(fā)生的各個環(huán)節(jié)，如參與原始生殖細(xì)胞遷移和增殖的基因(NANOS3)、調(diào)控細(xì)胞死亡的基因(PGRMC1和FMR1)、激素和受體(FSHR、AMH、AMHR2)、轉(zhuǎn)化生長因子β超家族(BMP15和GDF9)、染色質(zhì)及聯(lián)會復(fù)合物結(jié)構(gòu)蛋白(STAG3、SYCE1、SPIDR、NUP107)、轉(zhuǎn)錄因子(FIGLA、NOBOX、NR5A1、WT1、FOXL2)、調(diào)控線粒體功能的基因(MRPS22、POLG、TWNK、LARS2、HARS2、AARS2、CLPP、LRPPRC)等[2-9]。近年來，隨著基因組測序技術(shù)、尤其是全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)的飛速發(fā)展，更多的POI候選基因被發(fā)現(xiàn)，其中包含一系列DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因，主要通過調(diào)控減數(shù)分裂中的同源重組(homologous recombination，HR)過程從而影響卵子發(fā)生。本文將介紹卵子發(fā)生中的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，并對相關(guān)基因與POI發(fā)生的最新研究進(jìn)展作一綜述。

一、卵子發(fā)生中的DNA損傷修復(fù)機(jī)制

在減數(shù)第一次分裂前期(meiosis prophase I)，同源染色體配對、建立聯(lián)會復(fù)合體(synaptonemal complex，SC)，在此基礎(chǔ)上，發(fā)生DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)并修復(fù)。DSB可引入同源染色體之間的遺傳物質(zhì)交換，增加了基因組多樣性，對于物種的適應(yīng)和進(jìn)化非常重要。

在減數(shù)分裂同源重組過程中，DSB由SPO11蛋白催化形成。在人卵母細(xì)胞中，DSB修復(fù)持續(xù)時間超過四周，主要通過同源重組(HR)途徑。在HR途徑中，MCM8/MCM9蛋白復(fù)合體可以招募MRE11-RAD50-NBS1(簡稱MRN)復(fù)合體至斷裂位點(diǎn)，由后者切割形成單鏈DNA(single strand DNA，ssDNA)，并招募重組酶(recombinase)等下游蛋白。其中，RAD51和DMC1是同源重組途徑中重要的重組酶，其功能受許多因素調(diào)節(jié)，例如，MEIOB/SPATA22蛋白復(fù)合物可以穩(wěn)定RAD51、DMC1與DNA的結(jié)合，MND1/PSMC3IP 蛋白復(fù)合物可以激發(fā)它們的酶活性。在同源重組過程中，重組中間體(recombination intermediates)需要被穩(wěn)定以促進(jìn)交叉(crossover)的形成，這個步驟需要例如HFM1和MSH4/MSH5二聚體這一類的解旋酶(helicase)。當(dāng)交換完成后，同源重組的最后一步是重組交叉結(jié)構(gòu)(double Holliday junctions)的解離，這一過程需要異二聚體MLH1/MLH3的調(diào)控與核酸外切酶EXO1的參與。

除同源重組外，非同源末端連接(Nonhomologous end-joining，NHEJ)是DSB修復(fù)的第二種機(jī)制。已有報道稱，參與調(diào)控NHEJ機(jī)制的基因XRCC4和LIG4的突變可以導(dǎo)致POI及其它一系列表型[10-11]。

另一個重要的DNA修復(fù)途徑，是Fanconi貧血癥(FANC)通路，存在于包括生殖系在內(nèi)的眾多祖細(xì)胞中。這條通路涉及至少20種蛋白質(zhì)，包括FANCA、FANCC、FANCG和FANCM基因的蛋白產(chǎn)物，上述基因的突變有可能導(dǎo)致POI。例如，在2019年，Yang等[12]在散發(fā)POI病例中檢測到了兩種FANCA基因的罕見雜合突變。

二、已知與POI有關(guān)的DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因

在POI病例中檢出的已知基因突變涉及減數(shù)分裂中DNA損傷修復(fù)的各個環(huán)節(jié)，包括DNA單鏈末端處理、交叉形成、交叉解離等。現(xiàn)將相關(guān)基因及突變介紹如下。

1.MCM8和MCM9基因：微小染色體維持復(fù)合物組分8(Minichromosome Maintenance Complex Component 8，MCM8)基因位于染色體20p12.3，微小染色體維持復(fù)合物組分9(Minichromosome Maintenance Complex Component 9，MCM9)基因位于6q22.31。在體細(xì)胞中，MCM蛋白復(fù)合體調(diào)控DNA復(fù)制的起始。而在卵母細(xì)胞中，MCM8和MCM9蛋白形成功能復(fù)合體，促進(jìn)同源重組DSB修復(fù)的發(fā)生。MCM8/MCM9基因突變可能導(dǎo)致配子發(fā)生異常和基因組不穩(wěn)定性。Mcm8敲除雌鼠不育，并易伴發(fā)卵巢腫瘤，Mcm9敲除雌鼠同樣不育[13]。

已有多項研究報道，在原發(fā)性閉經(jīng)的患者家系中檢出了MCM8/9基因的純合突變[14-17]，患者并伴有高促性腺激素、小卵巢和幼稚子宮、第二性征發(fā)育延遲、身材矮小等癥狀，而雜合突變攜帶者無表型。該基因的純合突變同樣可對男性性腺發(fā)育造成影響，表現(xiàn)為睪丸功能或發(fā)育不全、少精癥或無精癥[18]。

2.DMC1基因：DNA減數(shù)分裂重組酶1(DNA meiotic recombinase 1，DMC1)基因位于染色體22q13.1。DMC1蛋白是減數(shù)分裂特異性重組酶。在Dmc1缺失雌鼠中，卵子發(fā)生在胚胎期卵巢內(nèi)中止，成熟小鼠卵巢中生殖細(xì)胞消失[19]。

Mandon-Pépin等[20]報道，在一例POI女性中發(fā)現(xiàn)了DMC1基因的純合突變。He等[21]報道，在一個中國家系中，在患有POI的女性成員和患有非梗阻性無精癥的男性成員中發(fā)現(xiàn)了DMC1基因的純合錯義突變。

3.MEIOB基因：MEIOB(meiosis specific with OB-fold)基因位于染色體16p13.3。MEIOB蛋白可結(jié)合單鏈DNA并具有3’-5’核酸外切酶活性。在同源重組過程中，MEIOB與SPATA22蛋白形成復(fù)合物，從而穩(wěn)定重組酶RAD51/DMC1與DSB位點(diǎn)的結(jié)合。Meiob敲除的雌、雄兩性小鼠均不育[22]。

近期，Caburet等[23]在一對患POI的姐妹中檢測出MEIOB基因的純合突變，突變造成的截斷MEIOB蛋白無法與SPATA22蛋白及DSB位點(diǎn)結(jié)合。這是第一例有關(guān)“單鏈DNA結(jié)合蛋白突變參與POI發(fā)生”的報道。

4.MND1基因：減數(shù)分裂核分裂蛋白1(meiotic nuclear division 1，MND1)基因位于染色體4q.31.3，其蛋白產(chǎn)物與PSMC3IP蛋白(見下節(jié))形成穩(wěn)定的異二聚體，通過與PSMC3/TBP1蛋白復(fù)合體的相互作用來激活RAD51和DMC1的重組酶活性，在同源重組過程中發(fā)揮不可或缺的作用。

Jolly等[24]對42例POI患者進(jìn)行外顯子測序，其中一對姐妹確診為高促性腺素性功能減退癥，在她們的基因組中檢測到了MND1基因的純合缺失突變。

5.PSMC3IP基因：蛋白酶體26S亞基ATP酶3相互作用蛋白(PSMC3 interacting protein，PSMC3IP)基因，又稱為HOP2，位于染色體17q21.2。PSMC3IP蛋白與MND1蛋白組成復(fù)合體，參與對同源重組的調(diào)控。Psmc3ip基因突變雌鼠的卵巢明顯縮小，卵泡缺乏[25]。

Zangen等[26]在一個巴勒斯坦家系中鑒定出了PSMC3IP基因的純合突變，該突變可造成雌激素信號通路的失活。Al-Agha等[27]報道了一個也門的近親婚配家系，該家庭的4個女兒均患有POI、1個兒子表現(xiàn)為無精癥，測序顯示這5名患者都存在PSMC3IP基因的純合突變。上述結(jié)果提示PSMC3IP蛋白在生殖細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

6.HFM1基因：減數(shù)分裂解旋酶1(helicase family member 1，HFM1)位于染色體lp22.2區(qū)域，在睪丸和卵巢中特異性高表達(dá)。在減數(shù)分裂同源重組過程中，HFM1參與維持重組中間體的穩(wěn)定，以促進(jìn)交換的形成。Hfm1敲除雌鼠不育，卵巢小，卵泡減少[28]。

Wang等[29]在兩名患POI的姐妹中發(fā)現(xiàn)HFM1基因的復(fù)合雜合突變(compound heterozygous mutations)，其父母則為表型正常的雜合突變攜帶者，說明該基因可通過隱性遺傳方式致病。此外，在多組對中國散發(fā)性POI患者的研究中也發(fā)現(xiàn)了HFM1基因的雜合突變[30-31]，進(jìn)一步提示HFM1基因突變與POI發(fā)生之間的關(guān)系。

7.MSH4和MSH5基因：DNA錯配修復(fù)蛋白同源物4(MutS homolog 4，MSH4)基因位于染色體1p31.1，DNA錯配修復(fù)蛋白同源物5(MutS homolog 5，MSH5)基因位于染色體6p21.33。與HFM1蛋白類似，MSH4/MSH 5異二聚體維持同源重組中間體的穩(wěn)定。Msh4或Msh5敲除小鼠不育[32-33]。

Carlosama等[34]在一個哥倫比亞POI家系中檢測到了MSH4基因的純合突變。Guo等[35]在一個中國POI家系中檢測到了MSH5基因的純合突變，并在200例散發(fā)POI患者中檢測到了3種MSH5基因的雜合突變。

8.ERCC6-PGBD3融合基因：切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因6(excision repair cross-complementation group 6，ERCC6)與相鄰的PGBD3(piggyBac transposable element derived 3)基因位于染色體10q11.23。ERCC6基因又稱為科凱恩氏綜合征互補(bǔ)組B(Cockayne syndrome complementation group B，CSB)，編碼的CSB蛋白可與DNA結(jié)合、參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA損傷修復(fù)，該基因的突變可導(dǎo)致科凱恩氏綜合征[36]。PGBD3蛋白功能不明確，可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。PGBD3基因可轉(zhuǎn)座插入ERCC6基因，形成ERCC6-PGBD3融合基因，其表達(dá)產(chǎn)物ERCC6-PGBD3融合蛋白在卵母細(xì)胞核中特異性高表達(dá)，可與RNA聚合酶II相互作用，參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA損傷修復(fù)[37]。

Qin等[37]在432個散發(fā)性POI病例和1個包含有4名POI患者的中國家系中，檢測到ERCC6-PGBD3融合基因的3種新突變。這3種雜合突變會造成DNA損傷修復(fù)機(jī)制的招募延遲或缺失，最終導(dǎo)致POI癥狀，證明CSB-PGBD3融合蛋白在卵子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

三、結(jié)語與展望

POI患者不僅罹受閉經(jīng)、不孕不育等生殖障礙，而且發(fā)生骨質(zhì)疏松、心血管疾病、抑郁焦慮綜合征、自我認(rèn)知障礙等疾患的風(fēng)險同樣增高，POI患者平均壽命較正常絕經(jīng)女性縮短，POI嚴(yán)重影響了女性身心健康。目前，尚無公認(rèn)有效的方法恢復(fù)或改善POI患者的卵巢功能，因此，對POI患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)尤為重要，其中，遺傳學(xué)病因研究是實現(xiàn)高危人群篩查和POI早期診治的關(guān)鍵之一。

隨著以全外顯子組測序(WES)為代表的下一代測序技術(shù)的快速發(fā)展，更多的POI候選基因突變將會被發(fā)現(xiàn)。然而，許多研究表明，許多POI患者攜帶多基因的復(fù)合雜合突變；即使在同一家系、相同基因位點(diǎn)的同一突變類型，POI的臨床表型也可以因人而異。這些現(xiàn)象說明，候選突變的功能效應(yīng)與致病機(jī)制需經(jīng)過審慎研究。

在未來有關(guān)POI致病突變的研究中，應(yīng)當(dāng)納入更多不同種族、地域的大樣本。此外，已經(jīng)確認(rèn)的POI突變致病基因、尤其是那些在卵子發(fā)生早期發(fā)揮作用的基因，是否也與男性生精障礙相關(guān)？在確診相關(guān)致病變異/基因后，是否可以利用基因編輯技術(shù)改進(jìn)卵巢機(jī)能？綜上所述，對POI遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究可以深入解析配子發(fā)生、生殖功能及不孕不育的分子基礎(chǔ)，在為POI患者提供遺傳咨詢和生育指導(dǎo)方面也同樣至關(guān)重要。