陰道微生態(tài)與不孕癥及其IVF-ET術(shù)后妊娠結(jié)局的相關(guān)性探討

鄧嵐蘭，宋學(xué)茹，楊慧鵬，黃建華*

(1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300308；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，天津 300052)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2010年報(bào)道[1]，全球不孕癥患病率約為15%。中國女性不孕癥發(fā)病率約為7.4%[2]。一項(xiàng)最新的多國家、多中心數(shù)據(jù)顯示在1990～2010年間，不孕癥患者人數(shù)從4 200萬增長(zhǎng)到4 800萬，雖然大部分地區(qū)的患病率未發(fā)生顯著變化，但不孕癥嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[3]。近30年來輔助生殖技術(shù)獲得突破性發(fā)展，已成為不孕不育治療的核心手段。然而國際范圍內(nèi)試管嬰兒的累積活產(chǎn)率僅為28%左右[4]，影響其成功的因素涉及到多方面，陰道微生態(tài)(vaginal microbiota)的改變目前逐漸引起學(xué)者關(guān)注。已有研究證實(shí)，特定的陰道微生態(tài)群落類型不僅影響生殖健康，還可能是不孕癥的病因之一[5]。進(jìn)一步的研究將關(guān)注陰道微生態(tài)菌群對(duì)生育力的影響，以及陰道微生態(tài)是否會(huì)對(duì)不孕癥IVF-ET治療結(jié)果產(chǎn)生影響。本文對(duì)陰道微生態(tài)與女性不孕癥的關(guān)系，以及不孕癥患者陰道微生態(tài)的改變對(duì)助孕結(jié)局的影響進(jìn)行綜述，以期為臨床不孕癥的治療提供新的思路和參考。

一、陰道微生態(tài)對(duì)女性生殖能力的影響

(一)健康女性陰道微生態(tài)

陰道微生態(tài)體系由陰道內(nèi)微生物菌群、機(jī)體內(nèi)分泌、局部免疫和解剖結(jié)構(gòu)共同組成。女性陰道壁粘膜有多種共生微生物定植，它們?cè)诒Ｗo(hù)陰道抵抗病原感染方面發(fā)揮著重要作用，對(duì)女性生殖健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[6]。目前認(rèn)為正常陰道菌群以乳桿菌為主，隨著高通量測(cè)序技術(shù)在微生態(tài)領(lǐng)域的應(yīng)用，人們對(duì)生殖道菌群分布有了更深層次的理解。育齡期婦女陰道菌群被歸為5類(Community State Types，CSTs)，CST-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ這4種類型都以乳桿菌為主(分別為卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、惰性乳桿菌和姜氏乳桿菌)，而CST-Ⅳ主要包含以厭氧菌為主的其他多種類型細(xì)菌[7]。其中，CST Ⅳ-A亞組包含中等量的乳桿菌(以惰性乳桿菌為主)，CST Ⅳ-B則主要包含與細(xì)菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)高度相關(guān)的菌種[8]。陰道微生態(tài)的分布因地域、種族不同而有顯著性差異，亞洲和白人健康婦女中陰道微生態(tài)菌群以乳桿菌為主的分別占到80.2%和89.7%，而在西班牙和黑人婦女中該比例卻僅為59.6%和69.1%[7]。另一項(xiàng)針對(duì)年輕健康黑人婦女陰道菌群的高通量測(cè)序顯示，僅37%的健康婦女陰道菌群以乳桿菌為主，約有25%的無癥狀婦女陰道菌群以非乳桿菌為主，但不是疾病狀態(tài)，往往此種類型婦女陰道分泌物中存在促炎癥細(xì)胞因子和激活的免疫細(xì)胞，提示此種類型的陰道微生態(tài)可能與感染有一定關(guān)系[9]，而且出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[10]。這就衍生了學(xué)者們對(duì)于健康的和最優(yōu)的陰道微生態(tài)的探討，即這種無癥狀的以非乳桿菌為主的陰道微生態(tài)環(huán)境可能是健康的但不是最優(yōu)的。研究發(fā)現(xiàn)惰性乳桿菌對(duì)維持正常陰道微生態(tài)并無促進(jìn)作用，還可能增加宿主感染沙眼衣原體的風(fēng)險(xiǎn)，是正常菌群向異常菌群轉(zhuǎn)變的過度狀態(tài)[11]。而絕經(jīng)前的健康婦女陰道微生態(tài)以卷曲乳桿菌為主，因此新的觀點(diǎn)認(rèn)為以卷曲乳桿菌為主的陰道微生態(tài)才是真正健康的標(biāo)志[12]。在陰道微生態(tài)領(lǐng)域還有許多問題值得挖掘。健康女性陰道菌群分布受到激素、月經(jīng)、性生活等多種因素的影響，并處在一種動(dòng)態(tài)平衡之中，這種平衡對(duì)維持女性生殖健康有重要意義。

(二)陰道微生態(tài)與不孕癥的相關(guān)性

引起不孕癥的病因較為復(fù)雜，常包括輸卵管因素、子宮因素、子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)等因素，而近年來生殖道感染已被證實(shí)與不孕癥的發(fā)生密切相關(guān)。將不孕婦女與健康婦女的陰道菌群對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)，不孕癥組陰道菌群以念珠菌(26.5%)和腸球菌(23.0%)為主，健康組則以乳桿菌(27.8%)和微球菌(15.3%)為主，二者的構(gòu)成有顯著差異[13]。一篇納入了12項(xiàng)以Nugent評(píng)分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的meta分析(n=3 229)顯示，在不孕女性中BV患病率比對(duì)照組高2倍[14]。對(duì)先天性不孕癥患者陰道分泌物進(jìn)行二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，先天性不孕癥患者陰道菌群譜與BV患者一致[15]。Wee等[16]的研究也證實(shí)有不孕癥史的婦女與有生育史的婦女相比陰道菌群分布有差異?？梢婈幍谰菏д{(diào)與不孕癥有一定相關(guān)性，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，原本被認(rèn)為是無菌的子宮內(nèi)膜、輸卵管等上生殖道也發(fā)現(xiàn)存在菌群，而陰道微生態(tài)失調(diào)也被越來越多的研究證實(shí)與輸卵管性不孕、子宮內(nèi)膜因素性不孕存在關(guān)聯(lián)。

1.陰道微生態(tài)與輸卵管性不孕癥的關(guān)系：輸卵管因素是引起不孕癥的常見病因之一，正常女性的宮頸發(fā)揮屏障作用可有效減少或防止微生物侵入上生殖道，但在某些病理情況下條件致病菌或某些外部侵入的病原菌可上行引起上生殖道感染，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致輸卵管炎癥使得輸卵管完全堵塞或破壞輸卵管內(nèi)膜導(dǎo)致瘢痕形成，影響輸卵管蠕動(dòng)，進(jìn)而引起輸卵管性不孕癥的發(fā)生。有研究對(duì)300例輸卵管性不孕癥患者盆腔積液和陰道分泌物中的病原菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輸卵管性不孕癥患者陰道分泌物中優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化，盆腔積液中病原菌檢出率升高，處于菌群失調(diào)狀態(tài)[17]。另一項(xiàng)研究顯示在輸卵管性不孕癥患者陰道分泌物中沙眼衣原體檢出率高，解脲支原體陽性率明顯高于對(duì)照組，且加德納菌和普雷沃菌的比例較正常受孕女性高，提示解脲支原體和沙眼衣原體感染與女性輸卵管性不孕癥有關(guān)，可能是引起女性不孕癥的主要因素之一[18]。而在患有BV的IVF婦女中，因輸卵管因素導(dǎo)致的不孕顯著高于未患BV的婦女(P=0.001)，提示與BV相關(guān)的細(xì)菌可能上行到上生殖道引起亞臨床感染和盆腔炎癥，引起輸卵管損害并降低生育力[19]，這可能與生殖道上皮組成的免疫屏障對(duì)許多細(xì)胞因子都較敏感，在BV中容易遭到破壞有關(guān)[20]。沙眼衣原體等常見的盆腔炎癥致病菌在患有BV的人群中更普遍[21]。由此可見，雖然在不同取材部位和不同人群中的研究結(jié)果有所差異，但輸卵管性不孕癥患者總體呈現(xiàn)陰道微生態(tài)失調(diào)狀態(tài)，且BV以及其他相關(guān)致病菌很可能上行感染引起輸卵管性不孕癥的發(fā)生，但目前尚缺乏對(duì)陰道微生態(tài)失調(diào)引起輸卵管性不孕癥的直接證據(jù)，未來還需更大樣本量和更規(guī)范的研究方法來進(jìn)一步探討二者之間的關(guān)系。

2.陰道微生態(tài)與子宮內(nèi)膜因素性不孕癥的關(guān)系：女性生育力主要取決于子宮內(nèi)膜容受性，其受激素、解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)的影響，而微生物群落影響著局部和全身免疫。自1989年Hemsell等[22]首次從健康婦女子宮中分離培養(yǎng)出多種定植細(xì)菌以來，越來越多的研究證明宮腔并非無菌，而是呈現(xiàn)以乳桿菌為主的多樣化定植[23]。正常妊娠子宮內(nèi)膜容受期間，子宮內(nèi)膜的定植菌群處于高度穩(wěn)定狀態(tài)，而炎癥狀態(tài)下子宮內(nèi)膜容受性明顯降低，腹腔積液中存在活性氧和各種炎癥因子，致使早期胚胎的生存環(huán)境相對(duì)惡劣[24]。有研究對(duì)102例不孕癥患者的宮腔積液進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，不孕癥患者子宮內(nèi)膜菌群大多以非乳桿菌為主，將這部分患者子宮內(nèi)膜乳桿菌濃度提升到>90%的水平，可改善IVF后的胚胎著床率[25]。對(duì)子宮內(nèi)膜優(yōu)勢(shì)菌為非乳桿菌的患者使用抗生素聯(lián)合益生菌制劑治療，可明顯改善患者妊娠結(jié)局[26]，提示恢復(fù)以乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌的子宮內(nèi)膜微環(huán)境既可以改善女性生育力和助孕結(jié)局。長(zhǎng)期以來，上生殖道的感染被認(rèn)為是由陰道病原菌上行感染所致。將放射性標(biāo)記的蛋白微球滴注到陰道，最快2 min就能上行進(jìn)入子宮內(nèi)[27]，表明液體和微顆?？梢栽陉幍?子宮間相對(duì)自由地移動(dòng)。Mitchell等[28]對(duì)要進(jìn)行子宮切除的婦女的陰道分泌物和子宮內(nèi)膜菌群進(jìn)行qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜雖存在一些特有的細(xì)菌，但其主要菌群與陰道分泌物中主要菌群相同，只是菌量更低。Swidsinski等[29]的研究發(fā)現(xiàn)BV患者中有一半人群的子宮內(nèi)膜中存在陰道加德納菌生物膜。這些研究均表明陰道菌群可上行到上生殖道影響子宮內(nèi)膜菌群。另外，在對(duì)EMs引起的不孕癥患者研究中發(fā)現(xiàn)，EMs在陰道炎、宮頸炎患者中發(fā)病率更高[30]，EMs不孕女性與未合并EMs的女性比較，陰道、子宮內(nèi)菌群組成均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[23]?？梢婈幍谰菏д{(diào)可能增加EMs發(fā)生率，甚至造成廣泛的盆腹腔粘連，影響胚胎著床。子宮內(nèi)膜是胚胎種植和發(fā)育的直接場(chǎng)所，因此隨之分子技術(shù)的發(fā)展未來應(yīng)該更多關(guān)注子宮內(nèi)膜菌群對(duì)女性生育力的影響。

二、陰道微生態(tài)與IVF-ET術(shù)后妊娠結(jié)局的相關(guān)性

隨著微生物測(cè)序等技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究表明陰道微生態(tài)失調(diào)對(duì)助孕結(jié)局存在影響[31-32]。有學(xué)者對(duì)31例接受IVF助孕的患者陰道分泌物進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)陰道分泌物群落類型可分為兩類，第一類包含：乳桿菌屬、加德納菌屬、梭菌屬、葡萄球菌屬和小桿菌屬，第二類則包含除第一類外的其他菌屬，而成功妊娠的女性陰道分泌物乳桿菌含量更高，且主要為第一種群落類型中的菌屬[31]。宮頸是連接陰道及宮腔的重要橋梁，一項(xiàng)針對(duì)265例IVF-ET助孕女性開展的宮頸菌群培養(yǎng)的研究顯示，大腸桿菌培養(yǎng)陽性率為64%，葡萄球菌屬培養(yǎng)陽性率為8%，培養(yǎng)陽性組IVF移植成功率、臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率均低于培養(yǎng)陰性組(分別為24% vs. 37%，P=0.02；17% vs. 28%，P=0.04；9% vs. 16%，P=0.01)[32]。對(duì)接受IVF治療和未接受IVF治療的不孕癥患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)接受IVF治療的患者子宮內(nèi)膜菌群乳桿菌含量低于未接受IVF治療的患者，其原因可能與IVF操作過程和接受IVF患者的背景有關(guān)，如：頻繁的經(jīng)陰道檢查、既往人工授精史、頻繁使用抗生素、控制性促排卵(COH)中激素水平波動(dòng)、取卵和胚胎移植操作以及卵巢刺激的副作用(如卵巢過度刺激綜合征)等[25]。陰道微生態(tài)失調(diào)可能影響助孕結(jié)局，而在IVF-ET治療實(shí)施過程中各種因素也會(huì)引起陰道微生態(tài)的改變從而對(duì)助孕結(jié)局產(chǎn)生影響。

(一)子宮內(nèi)膜菌群與胚胎反復(fù)著床失敗(RIF)的相關(guān)性

隨著促排卵方案的改進(jìn)和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件的改善，單個(gè)周期移植妊娠率增加，但RIF的發(fā)生率仍較高。胚胎著床是一個(gè)復(fù)雜的過程，母體、胚胎及母胎界面免疫反應(yīng)均可影響該過程導(dǎo)致著床失敗，其中非整倍體胚胎是移植失敗的主要因素，尤其是在大齡女性中。但整倍體胚胎移植失敗率仍達(dá)40%左右[33]，提示可能存在其他導(dǎo)致移植失敗的因素。正常子宮內(nèi)膜菌群處于免疫平衡狀態(tài)，參與形成子宮內(nèi)膜免疫共同體，維持宿主抑制細(xì)菌增殖和侵襲的能力[24]。Moreno等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜菌群以非乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌的婦女其胚胎著床率顯著低于子宮內(nèi)膜菌群以乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌的婦女(60.7% vs. 23.1%，P=0.02)。而在RIF合并慢性子宮內(nèi)膜炎患者的子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞含量下降，內(nèi)膜基質(zhì)中B淋巴細(xì)胞募集，子宮內(nèi)膜局部Th1/Th2免疫失調(diào)，可阻礙胚胎著床[35]。有研究對(duì)16例子宮內(nèi)膜炎患者的子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP1)表達(dá)上調(diào)，同時(shí)白細(xì)胞介素(IL-11)、趨化因子配體(CCL4)、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-1)下調(diào)，可以推斷由子宮內(nèi)膜炎引起的RIF是炎癥表達(dá)異常、局部免疫失調(diào)、趨化因子介導(dǎo)的綜合過程[36]。子宮內(nèi)膜局部炎性微環(huán)境通過改變黏附因子正常表達(dá)，進(jìn)而引起子宮內(nèi)膜B淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，滲透至子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及腺體區(qū)，分泌各種免疫蛋白抗體影響子宮內(nèi)膜容受性，從而影響胚胎著床[37]。

(二)COH對(duì)陰道菌群的影響

COH是IVF-ET治療過程中的一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)，在COH過程中體內(nèi)雌激素水平短時(shí)間內(nèi)快速升高使得陰道菌群分布產(chǎn)生變化。在妊娠期，隨著雌激素水平升高，陰道菌群分布可能發(fā)生改變，其中外陰陰道假絲酵母菌病的發(fā)病率會(huì)偏高[38]。Hyman等[39]研究了30例接受IVF-ET治療的女性在不同階段體內(nèi)雌激素水平和陰道菌群組成情況，發(fā)現(xiàn)所有患者的雌激素水平從初始卵泡至成熟卵泡階段均顯著上升，其中54%伴有陰道菌群改變；從注射人絨毛膜促性腺激素至胚胎移植階段，有5例患者的雌激素水平急劇下降且均伴有陰道菌群改變，提示陰道菌群改變與雌激素水平具有相關(guān)性。另一項(xiàng)研究顯示，IVF-ET周期中接受長(zhǎng)方案COH的患者，在進(jìn)行COH后陰道微生態(tài)失調(diào)者較COH前顯著增加(15.3% vs. 32.0%，P=0.05)；COH前已有陰道微生態(tài)異常者更容易發(fā)生微生態(tài)失調(diào)(26.8% vs. 60.9%，P=0.01)，提示接受COH的患者更容易發(fā)生陰道微生態(tài)失調(diào)，且COH前已有陰道微生態(tài)失調(diào)的患者在接受COH后更易發(fā)生失調(diào)，影響IVF-ET治療的成功率[40]。因此可在HCG日對(duì)COH者行二次陰道微生態(tài)檢查，并注意加強(qiáng)宣教及外陰清潔。不同的促排方案對(duì)陰道微生態(tài)會(huì)有不同影響，實(shí)施COH后陰道微生態(tài)的變化對(duì)IVF-ET術(shù)后妊娠結(jié)局的影響值得進(jìn)一步研究。

(三)IVF-ET操作對(duì)陰道菌群的影響

目前認(rèn)為宮腔內(nèi)菌群是由陰道菌群上行定植，而陰道病原菌上行感染可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。胚胎移植過程中移植管也會(huì)將陰道及宮頸處微生物帶入宮腔，進(jìn)而對(duì)助孕結(jié)局產(chǎn)生影響。一項(xiàng)對(duì)80例接受IVF-ET助孕婦女的研究顯示，若胚胎移植管上培養(yǎng)出細(xì)菌會(huì)降低臨床妊娠率[41]。宮頸黏液或?qū)m腔內(nèi)出血導(dǎo)致的移植管污染可降低臨床妊娠率，黏液量越多臨床妊娠率越低[42-43]。越來越多的研究也開始支持在進(jìn)行胚胎移植時(shí)若移植管上定植了卷曲乳桿菌將會(huì)提高胚胎種植率和活產(chǎn)率，同時(shí)還可降低感染幾率的假設(shè)[44]。上述研究均提示，維持以乳桿菌為主的陰道、子宮內(nèi)膜微生態(tài)對(duì)輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局有益，因此在進(jìn)行胚胎移植前應(yīng)盡量全面評(píng)估。

三、結(jié)語

女性陰道微生態(tài)處在一種動(dòng)態(tài)平衡之中，能影響宿主的生理功能，反之宿主的生理變化也可以影響陰道微生態(tài)的組成和功能。陰道微生態(tài)失調(diào)不僅能引起陰道的慢性炎癥，更與多種因素導(dǎo)致的不孕癥存在關(guān)聯(lián)。除常見的沙眼衣原體等致病菌外，BV引起的陰道微生態(tài)失調(diào)也可能導(dǎo)致一些亞臨床改變，成為女性不孕癥的危險(xiǎn)因素。以非乳桿菌為主的陰道微生態(tài)可能激發(fā)宿主免疫反應(yīng)從而降解宿主粘膜屏障，使機(jī)體更易發(fā)生感染從而導(dǎo)致不孕或早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[10]，恢復(fù)以乳桿菌為主的陰道、宮腔內(nèi)環(huán)境有助于改善助孕結(jié)局；同時(shí)要注意在IVF-ET治療過程中COH、取卵及移植等操作的影響。陰道微生態(tài)與宿主間的相互作用與IVF-ET治療后結(jié)局的關(guān)系仍存在諸多疑問，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，宮腔、輸卵管等上生殖道微生態(tài)對(duì)助孕結(jié)局影響的研究也已開展。未來還需關(guān)注對(duì)陰道微生態(tài)的作用機(jī)制和功能方面的探討，明確其與不良助孕結(jié)局之間的相互關(guān)系。