復(fù)方芎參軟膠囊的提取工藝

鄭望升 蔣宇佳 呂慧群 商鐵存

復(fù)方芎參軟膠囊是由川芎、丹參等中藥組成的復(fù)方制劑，具有行氣、活血、化瘀、通脈功效，主要用于腦動(dòng)脈硬化、缺血性腦中風(fēng)及腦出血后遺癥等治療。該制劑遵循氣行血行的中醫(yī)理論，具有服用方便、生物利用度高、密封性好等特點(diǎn)。方中丹參的主要成分丹參酮ⅡA 具有誘導(dǎo)血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞分化成熟和凋亡，抗急性缺氧、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等藥理學(xué)作用[1-2]。川芎主要含有揮發(fā)油、生物堿、酚酸等成分，其酚酸類(lèi)成分阿魏酸是其主要藥效成分，具有抑制血小板聚集，抑制血小板釋放5-羥色胺（5-HT），阻止顱內(nèi)外血管異常舒縮，改善血液循環(huán)等功效[3-4]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了川芎超臨界萃取工藝和丹參醇提工藝相結(jié)合的提取工藝，采用正交試驗(yàn)法，分別以阿魏酸和丹參酮ⅡA 為考察指標(biāo)，優(yōu)化 復(fù)方芎參軟膠囊的提取工藝，為制劑生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

川芎（浙江康寧醫(yī)藥有限公司，批號(hào)151211）；丹參（浙江康寧醫(yī)藥有限公司，批號(hào)150814）；阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào)110773- 201313）；丹參酮ⅡA 對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào)110766-200619）；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

HA123-50-02G 型超臨界萃取裝置（南通儀創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；MS105DU 分析天平（METTLER TOLEDO）；Agilent1200 高效液相色譜儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎的CO2 萃取

2.1.1 因素水平設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)[3,5-7]及預(yù)實(shí)驗(yàn)，以阿魏酸提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化萃取工藝，選取萃取溫度（A）、萃取壓力（B）、萃取時(shí)間（C）作為考察因素，各取3 水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，篩選最佳工藝條件。見(jiàn)表1。

表1 萃取川芎因素水平

2.1.2 試驗(yàn)方法根據(jù)以上因素水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱(chēng)取川芎藥材9 份，每份400 g，按照正交試驗(yàn)表所示條件萃取，收集萃取液，作為樣 品備用。

2.1.3 阿魏酸含量的測(cè)定

阿魏酸含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[8-9]。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇：1%醋酸溶液（30：70）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm；進(jìn)樣量為10 μl。阿魏酸對(duì)照品與川芎提取物樣品的高效液相色譜法（HPLC）色譜圖如圖1所示。

對(duì)照品溶液制備：取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于棕色容量瓶中，加70%甲醇制成1 ml 含98 μg 溶液，即得。

供試品溶液制備：取本品0.1 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，搖勻，靜置，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

線性關(guān)系考察：分別準(zhǔn)確量取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 于100 ml 容量瓶中，然后用70%甲醇定容至刻度，混勻，分別精密吸取上述溶液各10 μl，進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以質(zhì) 量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=11 819X+601.4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。線性范圍在0.98～4.90 μg/ml，線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液10 μl，按上述色譜條件測(cè)定重復(fù)測(cè)定5 次，以峰面積計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為0.99%（n=5），結(jié)果表明精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液，分別放置0、4、8、12 h 后，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算出RSD 值為1.7%（n=4）。表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性相對(duì)良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱(chēng)取川芎提取物樣品5 份，按上述供試品溶液制備方法平行制備5 份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算阿魏酸含量，RSD 值為2.00%（n=5），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：準(zhǔn)確量取已知含量的同一批川芎提取物供試品溶液9 份，分別加入樣品量80%、100%、120%的對(duì)照品，按上述供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下檢測(cè)阿魏酸的平均回收率為100.48%，RSD 值為1.86%，結(jié)果表明該方法具有較好的回收率。見(jiàn)表2。

2.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析按L9（34）正交試驗(yàn)條件進(jìn)行萃取，共得到9 份萃取液，測(cè)定阿魏酸提取率。結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。由表3可知，影響萃取效果的因素順序?yàn)檩腿囟龋ˋ）＞萃取壓力（B）＞萃取時(shí)間（C），直觀分析可知A3B3C3為提取阿魏酸最佳方案。由表4可見(jiàn)，因素A 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著。從經(jīng)濟(jì)易控考慮，選擇方案A3B2C1為最佳方案，即萃取溫度70 ℃、萃取壓力29 MPa、萃取時(shí)間1.5 h。

表2 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 萃取工藝方差分析

2.2 丹參提取工藝優(yōu)選

2.2.1 因素水平設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)[10-13]及預(yù)實(shí)驗(yàn)，以丹參酮ⅡA 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用乙醇提取工藝，選取溶媒濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、溶劑用量作為考查因素，各取3 水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)，篩選最佳萃取工藝條件，因素水平見(jiàn)表5。

2.2.2 試驗(yàn)方法根據(jù)以上因素水平，按照L9（34）正交試驗(yàn)表，準(zhǔn)確稱(chēng)取處方量丹參等藥材9 份，每份200 克，按照L9（34）正交試驗(yàn)表所示條件提取，收集提取液，干燥作為樣品備用。

表5 丹參提取工藝因素水平

2.2.3 丹參酮ⅡA 含量測(cè)定

丹參酮ⅡA 含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[14]。

色譜條件：色譜柱為DiamonsilTM—C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇：水（85：15）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量為10 μl。丹參酮ⅡA 對(duì)照品與丹參提取物樣品的HPLC 色譜圖如圖2所示。

對(duì)照品溶液制備：取丹參酮ⅡA 對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成1 ml 含0.5 mg 的溶液，即得。

圖2 丹參酮ⅡA 對(duì)照品和丹參提取物HPLC 色譜圖

供試品溶液制備：取本品約0.02 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）30 min，冷卻，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

線性關(guān)系考察：分別準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml 于50 ml 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，分別精密吸取上述溶液各10 μl，進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=12 233X+3 411，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，線性范圍在4.3～21.8 μg/ml，線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液10 μl，按上述色譜條件重復(fù)測(cè)定5 次，以峰面積計(jì)算，RSD 值為0.50%（n=5），表明精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液，分別放置0、4、8、12 h 后，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算出RSD 值為0.55%（n=4）。表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性相對(duì)良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱(chēng)取同批次丹參提取物樣品5 份，按上述供試品溶液制備方法平行制備5 份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積測(cè)定并計(jì)算丹參酮ⅡA 含量，RSD 值為1.47%（n=5），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：準(zhǔn)確量取已知含量的同一批丹參提取物供試品溶液9 份，分別加入樣品量80%、100%、120%的對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件下檢測(cè)丹參酮ⅡA 的平均回收率為99.40%，RSD 值為1.02%，結(jié)果表明該方法具有良好的回收率。見(jiàn)表6。

2.2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析按L9（34）正交 試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，共得到9 份提取液，干燥后，測(cè)定丹參酮ⅡA 提取率。結(jié)果見(jiàn)表7，方差分析見(jiàn)表8。由表7可知，影響提取效果的因素順序?yàn)樘崛〈螖?shù)（C）＞溶媒濃度（A）＞提取時(shí)間（B）＞溶劑用量（D），直觀分析可知A3B2C3D2為提取丹參酮ⅡA的最佳方案；由表8可知，因素A、B、C 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，溶劑用量（D）影響不大。從節(jié)約濃縮時(shí)間、能耗等方面考慮，選擇方案A3B2C3D1為最佳方案，即溶媒濃度90%、提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)3 次、6 倍量提取溶媒。

2.3 最佳提取工藝驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取工藝，分別對(duì)川芎萃取和丹參提取進(jìn)行了3 批樣品的驗(yàn)證研究，RSD 分別為2.61%、2.19%，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定、合理可行，可以作為復(fù)方芎參軟膠囊的提取工藝。見(jiàn)表9。

3 討論

中藥成分復(fù)雜，如何將有效成分提取完全，是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考慮的關(guān)鍵因素。川芎為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效[15]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，揮發(fā)油和阿魏酸是川芎的重要藥效成分[16]。常規(guī)提取揮發(fā)油以水蒸氣蒸餾法為主，存在溫度高、時(shí)間長(zhǎng)、提取率低等問(wèn)題，容易導(dǎo)致熱敏性?xún)?nèi)酯成分破壞。阿魏酸多采用回流、超聲等方法重新提取。本制劑采用超臨界CO2萃取的方法提取川芎揮發(fā)油和阿魏酸，實(shí)現(xiàn)了兩者的有效結(jié)合，同時(shí)具有時(shí)間短、效率高等特點(diǎn)[3-6]。

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)川芎的超臨界萃取工藝和丹參藥材醇提工藝進(jìn)行了優(yōu)化篩選，并進(jìn)行了重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，最終確定了本制劑的藥材提取工藝，即川芎萃取優(yōu)化工藝為萃取溫度70 ℃、萃取壓力29 MPa、萃取時(shí)間1.5 h；丹參藥材提取優(yōu)化工藝為90%乙醇、提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)3 次、6 倍量提取溶媒。該工藝合理、可行，為復(fù)方芎參軟膠囊的開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。

表6 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)

表7 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 提取工藝方差分析

表9 工藝驗(yàn)證結(jié)果