溶瘤腺病毒治療腎癌的研究進(jìn)展

王宗平 王華

在腎惡性腫瘤中，約90%為腎細(xì)胞癌（RCC）；RCC約占成人惡性腫瘤的3%。多數(shù)RCC是檢查中偶然發(fā)現(xiàn)且為早期診斷，但仍有30%的患者就診時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[1]。根治性腎切除術(shù)或腎部分切除術(shù)是治療局限性RCC的金標(biāo)準(zhǔn)，但約30%的患者治療后會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對于轉(zhuǎn)移性RCC（mRCC），目前尚缺乏有效的治療方法，預(yù)后較差。近年來研究發(fā)現(xiàn)，溶瘤腺病毒對腎癌具有良好的抗腫瘤效果及安全性，以溶瘤腺病毒為載體的腎癌基因治療也有廣闊的應(yīng)用前景。本文就瘤腺病毒治療腎癌的研究進(jìn)展作一綜述。

1 腎癌治療現(xiàn)狀

RCC對放化療多不敏感，細(xì)胞因子療法如干擾素或白細(xì)胞介素作為mRCC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法沿用多年，但其有效率不足20%。近年來，分子靶向藥物如血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）抑制劑（舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿西替尼等）以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制劑（替西羅莫司、依維莫司）廣泛應(yīng)用于mRCC的治療。但靶向藥物對mRCC的客觀反應(yīng)率為10%～30%，完全緩解率不足1%，最終患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展甚至死亡[2]。2014年美國臨床腫瘤學(xué)會會議報道了mRCC的最新免疫療法——程序性死亡分子-1（PD-1）抑制劑，臨床Ⅱ期試驗(yàn)結(jié)果顯示其客觀反應(yīng)率達(dá)到54%[3]，但缺乏長期的隨訪數(shù)據(jù)。因此，研發(fā)治療mRCC的新療法很重要。

2 溶瘤腺病毒選擇性復(fù)制機(jī)制

溶瘤腺病毒作為一種新型抗腫瘤制劑，治療腫瘤的應(yīng)用前景被逐漸重視。經(jīng)過基因修飾的腺病毒可選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，而正常細(xì)胞不受影響。腫瘤細(xì)胞裂解釋放出更多的腺病毒，可再次感染臨近的組織細(xì)胞，直至腫瘤被完全破壞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。因此，溶瘤腺病毒的腫瘤特異性復(fù)制是其最重要的特性，同時也是該治療手段安全性的關(guān)鍵所在，而達(dá)到這一特性需要合理的基因修飾。目前已知2種基因修飾方法，具體介紹如下[4]。

一種方法是通過基因突變，改變腺病毒蛋白的表達(dá)，從而限制腺病毒在正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。腺病毒的復(fù)制需要細(xì)胞周期進(jìn)入S期，腺病毒感染細(xì)胞后，其早期蛋白E1A與宿主細(xì)胞的Rb蛋白結(jié)合，激活E2F轉(zhuǎn)錄因子，迫使細(xì)胞周期進(jìn)入S期，為腺病毒的復(fù)制提供良好的環(huán)境。但隨著E2F的激活，p53也被激活。p53蛋白使細(xì)胞周期阻止在G1期或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而限制腺病毒的復(fù)制。然而，腺病毒的E1B55KD蛋白可以結(jié)合并使p53蛋白失活，最終使細(xì)胞周期進(jìn)入S期，從而使腺病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。通過對腺病毒的基因修飾，使編碼E1A蛋白和（或）E1B55KD蛋白的基因發(fā)生突變，消除病毒蛋白與Rb蛋白和（或）p53蛋白的結(jié)合能力，從而限制腺病毒在正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。進(jìn)展期RCC常具有多個細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因突變，包括p53、Rb等，而細(xì)胞周期的失控利于溶瘤腺病毒在腎癌細(xì)胞中的復(fù)制，因此溶瘤腺病毒可作為晚期腎癌的靶向治療手段。

另一種方法是在病毒基因中插入腫瘤或組織特異性啟動子，使腺病毒僅在能表達(dá)該種特異性蛋白的腫瘤細(xì)胞或特定組織細(xì)胞中選擇性復(fù)制。腫瘤細(xì)胞常高表達(dá)某些生物分子，而正常細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)；相比于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞存在一定的特異性。腎癌組織中高表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）、核抗原Ki-67、細(xì)胞表面抗原G250、趨化因子受體（CXCR4）等。將腫瘤特異性生物分子的啟動子基因插入腺病毒的基因區(qū)，從上游調(diào)控腺病毒的基因表達(dá)，致使腺病毒在表達(dá)這些特異性生物分子的腎癌細(xì)胞中復(fù)制；由于正常組織中啟動子處于靜默狀態(tài)，無法驅(qū)動腺病毒的復(fù)制，從而達(dá)到腫瘤靶向性感染[5]。

3 溶瘤腺病毒治療腎癌的臨床前研究

3.1 E1A或E1B基因突變的溶瘤腺病毒 第一代溶瘤腺病毒是dl1520（ONYX-015），該病毒刪除了E1B55KD基因，喪失了與宿主細(xì)胞p53蛋白的結(jié)合能力，能選擇性地在p53基因突變的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并破壞腫瘤細(xì)胞，而在正常細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制[6]。隨后，E1A突變的腺病毒dl922-947和△24顯示了對Rb傳導(dǎo)途徑異常的腫瘤具有腫瘤選擇性復(fù)制和殺傷效果。但后期研究表明，E1A或E1B單一突變的腺病毒在正常細(xì)胞內(nèi)仍有一定程度的復(fù)制。為了進(jìn)一步限制腺病毒在正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，E1A、E1B雙突變?nèi)芰鱿俨《続xdAdB-3和CB1相繼被報道，這兩種病毒都具有E1B55KD缺失、E1A的Rb結(jié)合位點(diǎn)突變，消除了腺病毒與p53和Rb蛋白結(jié)合的能力，理論上在p53功能異常和（或）Rb傳導(dǎo)途徑異常的腫瘤內(nèi)均可復(fù)制，對正常細(xì)胞更安全，對腫瘤細(xì)胞更具殺傷效果[7]。

前期研究報道了E1A、E1B雙突變?nèi)芰鱿俨《続xdAdB-3治療腎癌的研究，結(jié)果顯示AxdAdB-3能有效感染并殺傷表達(dá)腺病毒受體（CAR）的腎癌細(xì)胞株，但在CAR不表達(dá)的腎癌細(xì)胞株（T0S-1、ACHN）中的細(xì)胞殺傷效果較弱，且該病毒不會在正常腎細(xì)胞株（RPTEC）中復(fù)制[8]。腺病毒感染細(xì)胞首先是由病毒纖維蛋白與細(xì)胞表面CAR結(jié)合，然后腺病毒蛋白的Arg-Gly-Asp（RGD）肽鏈結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的 αvβ3、αvβ5 整合素結(jié)合，從而使腺病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。研究表明，腺病毒對宿主細(xì)胞的感染效率與CAR表達(dá)水平密切相關(guān)。而許多惡性腫瘤（包括進(jìn)展期腎癌）缺乏CAR表達(dá)，從而限制了溶瘤腺病毒的應(yīng)用。Haviv等[9]發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞缺乏CAR表達(dá)而高表達(dá)整合素αvβ3和αvβ5，故采用RGD修飾的E1A突變?nèi)芰鱿俨《局委熌I癌，結(jié)果顯示RGD修飾的溶瘤腺病毒對CAR陽性和陰性的腎癌細(xì)胞株均具有較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷效果。

3.2 組織特異性啟動子調(diào)控的溶瘤腺病毒 將腫瘤組織特異性表達(dá)的生物分子的啟動子基因插入腺病毒基因區(qū)，可作為溶瘤腺病毒靶向治療腎癌的另一種策略。與前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤不同，RCC缺乏以區(qū)分其他腫瘤的高度特異性生物分子，目前研究常采用多數(shù)腫瘤共同表達(dá)的腫瘤特異性生物分子作為溶瘤腺病毒的啟動子，如hTERT、Ki-67、G250、CXCR4等。多項(xiàng)研究表明，插入啟動子的溶瘤腺病毒可選擇性感染腎癌細(xì)胞。以CXCR4為例，趨化因子及其受體SDF-1a/CXCR4與乳腺癌[10]、前列腺癌[11]、卵巢癌[12]等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及局部進(jìn)展相關(guān)。已有研究表明，CXCR4在部分類型的腎癌細(xì)胞中高表達(dá)[13-14]。Haviv 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，A498、CAKI-1、SN12C腎癌細(xì)胞株高表達(dá)CXCR4，KU-19-20腎癌細(xì)胞株低表達(dá)，而786-0腎癌細(xì)胞株及正常組織細(xì)胞不表達(dá)CXCR4。將插入CXCR4啟動子的溶瘤腺病毒AdGL3BC－XCR4感染這些細(xì)胞株，結(jié)果顯示在CXCR4高表達(dá)的細(xì)胞株中CXCR4啟動子的活性明顯高于低表達(dá)或不表達(dá)CXCR4的細(xì)胞株；這說明插入CXCR4啟動子的溶瘤腺病毒可特異性感染CXCR4高表達(dá)的腎癌細(xì)胞[15]。

3.3 以溶瘤腺病毒為載體的腎癌基因治療 RNA干擾技術(shù)可以特異性敲除特定基因的表達(dá)，在惡性腫瘤的治療上具有較好的前景；但是siRNA半衰期較短及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率較低，從而限制了其應(yīng)用。研究者將干擾RNA與溶瘤腺病毒連接，利用溶瘤腺病毒腫瘤選擇性復(fù)制的特點(diǎn)，將干擾RNA轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞，可達(dá)到溶瘤及基因治療的雙重效果。

Ki-67是一種細(xì)胞核抗原，與細(xì)胞增殖有關(guān)。增殖活躍的細(xì)胞，尤其是惡性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)Ki-67，而靜止期的細(xì)胞不表達(dá)Ki-67。研究表明，抑制Ki-67的表達(dá)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[16]。Zheng等[17]將Ki-67-shRNA連接至腺病毒的基因區(qū)，構(gòu)建了能調(diào)控表達(dá)Ki-67干擾RNA的溶瘤腺病毒ZD55-Ki-67。采用ZD55-Ki-67分別感染腎細(xì)胞株786-0、ACHN及正常腎小管細(xì)胞株HK-2，并與表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的腺病毒ZD55-EGFP、復(fù)制缺陷型（E1區(qū)缺失）腺病毒Ad-EGFP、Ad-Ki-67進(jìn)行比較；結(jié)果顯示ZD55-Ki-67、Ad-Ki-67感染的腎癌細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)明顯下調(diào)，ZD55-Ki-67的細(xì)胞殺傷效果是ZD55-EGFP的10倍，是Ad-Ki-67的1 000倍；在裸鼠實(shí)驗(yàn)中，ZD55-Ki-67的縮瘤效果更明顯，顯示了ZD55-Ki-67對腎癌組織的高度特異性及更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷效果。另外，4種腺病毒均未對正常腎小管細(xì)胞株產(chǎn)生明顯的細(xì)胞殺傷作用。Cui等[18]一項(xiàng)研究將hTERT干擾RNA與腺病毒重組，同樣顯示了較好的應(yīng)用前景。腫瘤細(xì)胞的繁殖與端粒酶活性增強(qiáng)密切相關(guān)，而hTERT是人端粒酶活性的決定性調(diào)控因子。研究證實(shí)，hTERT在惡性腫瘤組織中高表達(dá)，在正常組織中不表達(dá)。Zheng等[19]采用類似的方法，將hTERT-shRNA插入至腺病毒ZD55的E1B基因區(qū)，形成具有表達(dá)hTERT干擾RNA的溶瘤腺病毒ZD55-hTERT。經(jīng)體外細(xì)胞及裸鼠實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)ZD55-hTERT不僅明顯下調(diào)hTERT的表達(dá)，抑制端粒酶的活性，而且在腎癌細(xì)胞的殺傷及縮瘤效果上也更具優(yōu)勢。Fang等[20]重組了攜帶Ki-67啟動子并調(diào)控表達(dá)Ki-67與hTERT雙干擾RNA的融瘤腺病毒Ki-67-ZXC2-double siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞株HK-2不表達(dá)Ki-67，而3種腎癌細(xì)胞株KETR-3、786-O、ACHN不同程度表達(dá)Ki-67；蛋白免疫印跡法檢測提示感染腺病毒后，3種腎癌細(xì)胞均表達(dá)E1A蛋白，而正常細(xì)胞不表達(dá)，顯示了攜帶Ki-67啟動子的溶瘤腺病毒的高度腫瘤特異性復(fù)制。Ki-67-ZXC2-double siRNA的細(xì)胞殺傷效果明顯強(qiáng)于 Ki-67-ZXC2-Ki-67 siRNA、Ki-67-ZXC2-hTERT siRNA、Ki-67-ZXC2。

3.4 溶瘤腺病毒聯(lián)合其他方法治療腎癌 近年來，溶瘤腺病毒聯(lián)合放療為腫瘤治療新方法提供了可能性。研究報道，溶瘤腺病毒可增強(qiáng)放射治療的效果[21]。Chen等[22]采用攜帶Ki-67啟動子并調(diào)控表達(dá)白細(xì)胞介素24（IL-24）的溶瘤腺病毒Ki-67-ZD55-IL-24，分別感染腎癌細(xì)胞株786-O、Ketr-3。結(jié)果顯示，Ki-67-ZD55-IL-24聯(lián)合放療與Ki-67-ZD55-IL-24單獨(dú)治療相比，兩者在E1A蛋白及IL-24表達(dá)水平上無明顯差異，說明放療不會影響溶瘤腺病毒的復(fù)制能力。而聯(lián)合治療的細(xì)胞殺傷效果優(yōu)于Ki-67-ZD55-IL-24單獨(dú)治療或單獨(dú)放療。

溶瘤腺病毒聯(lián)合化療治療腎癌的研究也顯示了較好的治療效果。在E1A、E1B雙突變?nèi)芰鱿俨《局委熌I癌的研究中，采用腎癌細(xì)胞株TOS-3LN構(gòu)建了重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠腎癌模型，經(jīng)腫瘤內(nèi)注射AxdAdB-3及腹腔內(nèi)注射吉西他濱（120mg/kg），比較治療后腫瘤大小改變，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用AxdAdB-3或吉西他濱均可對腎癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞殺傷效果，而AxdAdB-3聯(lián)合吉西他濱殺滅腫瘤細(xì)胞的效果更顯著，能抑制腫瘤細(xì)胞生長[8]。

4 溶瘤腺病毒治療腎癌的臨床研究

目前已有較多文獻(xiàn)報道了溶瘤腺病毒治療其他腫瘤的臨床試驗(yàn)，而溶瘤腺病毒治療腎癌的臨床研究極少，僅在一項(xiàng)溶瘤腺病毒治療多種類型腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中涉及RCC。Garcia-Carbonero等[23]將17例計劃手術(shù)治療的腫瘤患者（可切除的結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、尿路上皮癌、腎癌）納入研究，在第1、3、5天腫瘤內(nèi)或靜脈注射溶瘤腺病毒ColoAd1，并于第10～25天接受手術(shù)治療。其中3例RCC患者術(shù)前均為靜脈內(nèi)注射溶瘤腺病毒，結(jié)果顯示注射溶瘤腺病毒后均未出現(xiàn)3～4級并發(fā)癥，且在手術(shù)標(biāo)本中均可發(fā)現(xiàn)病毒DNA。雖然該研究樣本量少，不足以證實(shí)臨床應(yīng)用溶瘤腺病毒的安全性，但可為溶瘤腺病毒治療腫瘤的進(jìn)一步研究提供參考，具有重要的臨床意義。

5 小結(jié)

靶向藥物及免疫制劑是目前治療mRCC的主要方法，但仍有部分患者無法從中獲益，仍需研發(fā)新的方法。溶瘤腺病毒作為一種新型抗腫瘤制劑，在臨床前研究中顯示了強(qiáng)大的腫瘤殺傷效果，在腎癌治療方面具有良好的應(yīng)用前景。