甜菜主要病害抗性育種研究進展

倪洪濤，薛琳，羅世龍，周芹

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜是最重要的制糖原料之一，全世界每年食糖量約1.8億t，30%來自于甜菜[1]。在伊朗等亞干旱地區(qū)，報告了26種甜菜病害，其中，13種由真菌引起，2種由細菌引起，7種由病毒引起，1種由病原體引起，3種由線蟲引起。然而，危害最大的是根腐病、褐斑病、叢根病、胞囊線蟲病、根結(jié)線蟲病[1]，而我國主要發(fā)生的為前3種。隨著近年來全球極端氣候變化加劇以及新型化肥、農(nóng)藥等的應(yīng)用，植物的生存環(huán)境在下降，病害的抗性不斷在增強，病害的發(fā)生并未減弱。據(jù)統(tǒng)計，甜菜產(chǎn)量每年因病害損失達16%[2]。提高甜菜產(chǎn)質(zhì)量需要對病害進行有效的防御，我國耕地面積日益減少、輪作倒茬的年限已無法滿足防治病害的要求，在倡導(dǎo)減少農(nóng)藥使用，促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的今天，培育抗（耐）病甜菜新品種（系）是唯一有效的策略。本文重點綜述近10年甜菜褐斑病、根腐病、叢根病的研究進展，深入了解國內(nèi)外3種病害的發(fā)生及危害，掌握甜菜抗病育種的研究動態(tài)，對我國提高甜菜抗病能力，培育甜菜抗病品種（系），發(fā)展甜菜事業(yè)具有重要意義。

1 甜菜褐斑?。–ercospora leaf spot，CLS）研究

1.1 發(fā)生與危害

甜菜褐斑病是由甜菜尾孢菌（Cercospora beticola）引發(fā)的甜菜葉部真菌病害。褐斑病是甜菜最常見、最具破壞性的病害，各大產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，可使產(chǎn)量下降10%～15%，含糖降低1～2 度。品種的抗性表現(xiàn)受菌原數(shù)量和氣候條件影響較大，特別在老甜菜產(chǎn)區(qū)或雨水較多地方發(fā)病嚴重[3]。甜菜品種的褐斑病抗性不穩(wěn)定，不同年份間差異較大，此外，不同甜菜品種間褐斑病抗性差異顯著[4]。最近，Vaghefi[5]等以102 株甜菜尾孢菌菌株為材料，根據(jù)6個基因座的序列，研究了與甜菜褐斑病相關(guān)甜菜尾孢菌種群的分類和進化物種界限，提出今后有必要從形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)對該菌屬進行分析從而揭示其物種形成規(guī)律。Kremer 等[6]利用英國劍橋環(huán)境研究中心（CERC）開發(fā)的CERCBET 1 大氣預(yù)測模型，探討了氣候變化對德國西南地區(qū)甜菜褐斑病發(fā)生的影響及其區(qū)域差異。結(jié)果表明，由于氣候變化導(dǎo)致甜菜褐斑病發(fā)生較早，葉片生長加快，早期甜菜褐斑病發(fā)生會導(dǎo)致生長季節(jié)延長，從而增加殺菌劑施用量。

甜菜褐斑病的快速、準(zhǔn)確鑒別對于甜菜褐斑病綜合治理必不可少，通常有肉眼觀測和輻射計測量兩種方法。傳統(tǒng)的視覺診斷往往無法區(qū)分褐斑病和其它葉部病害的差別。丁廣洲等[7]首次借助熱感應(yīng)光機和X光影像學(xué)手段分析褐斑病嚴重發(fā)病地塊的甜菜抗感種質(zhì)葉片的結(jié)構(gòu)特征，并對甜菜抗感病種質(zhì)的葉片組織和超微結(jié)構(gòu)進行了研究。Hallau等[[8]提出了一種基于智能手機攝像頭采集的紅、綠、藍三原色RGB圖像數(shù)據(jù)庫識別甜菜葉部病害的方法，精度達82%，對褐斑病、甜菜銹病、白葉枯病等葉部病害的分類準(zhǔn)確率均優(yōu)于甜菜病害分類專家的判斷，該工具也適用于其它作物，有助于提高綜合病害防治決策水平。

1.2 甜菜抗褐斑病遺傳育種研究進展

近年來，甜菜褐斑病的流行呈上升趨勢，殺菌劑的使用量不斷增加，同時，真菌抗藥性也在增強，有效殺菌劑的供應(yīng)也面臨風(fēng)險。2015 年在波蘭，Piszczek 等[9]對從不同地點采集的甜菜尾孢菌進行測試表明，所有耐藥菌株均含有一個G/C定點突變，該研究首次提出是基因143位點發(fā)生突變(G143A)引發(fā)了甜菜尾孢菌抗藥性。由于真菌抗藥性增強，培育抗褐斑病品種是綜合管理的關(guān)鍵。目前，世界各國育成的商用品種只有中等抗性水平，多數(shù)品種的抗病性介于父本和母本之間，有時甚至低于雙親的平均值，既高產(chǎn)又抗褐斑病的品種很難育成10]。因此，到目前為止，在商業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用率一直很低。

加性和非加性遺傳效應(yīng)都有助于褐斑病抗性的表達，基因的加性效應(yīng)更強[11]。從遺傳入手，通過導(dǎo)入真菌病害抗性基因培育抗褐斑病甜菜品種具有重要的意義與價值。Nilsson 等[12]采用AFLP 和RFLP 對204 個單株的分離群體QTL 分析，發(fā)現(xiàn)5 個抗褐斑病QTL，調(diào)查了甜菜尾孢菌抗性遺傳方式。Kazunori 等[26]采用QTL 分析抗褐斑病甜菜品系‘NK-310 mm-O’與感病品系‘NK-184 mm-O’雜交獲得的重組自交系（RILs）的抗褐斑病遺傳力；復(fù)合區(qū)間作圖（CIM）顯示有4 個與甜菜褐斑病抗性相關(guān)的QTL，其中兩個抗性QTL（qcr1、qcr4 分別位于第三、第八染色體上）使抗病品系的等位基因增強了抗性，這兩個抗性QTL 可能在分子標(biāo)記輔助選育（MAS）中具有特殊的價值。許多甜菜主產(chǎn)國如美國、法國、波蘭、瑞典、荷蘭等，已鑒定選育出一批優(yōu)良抗褐斑病品種[14]。對17份甜菜品種進行親緣關(guān)系分析表明，有5個品種抗褐斑病性較好，結(jié)合分子標(biāo)記和田間調(diào)查結(jié)果進行聚類分析，結(jié)果在0.2遺傳距離處，供試材料可分為5個類群，第一類群包括兩個亞類[15]。最近，德國甜菜抗褐斑病育種取得突破性進展。2014—2016年，Vogel 等[16]對在德國注冊的15 個甜菜新品種的褐斑病抗性和耐性進行鑒定，結(jié)果顯示，所培育的抗褐斑病新品種的產(chǎn)量已經(jīng)趕上了感病品種，在沒有病害的情況下產(chǎn)量不減少，經(jīng)濟表現(xiàn)優(yōu)于感病品種。Upchurch等[17]以根瘤菌為載體，在甜菜中克隆表達了甜菜褐斑病的抗性基因CFP。杜昕鈺等[18]提出轉(zhuǎn)RIP 基因甜菜可增強褐斑病抗性，而對甜菜的生長和生理代謝無不良影響。劉大麗等[19]采用RT-PCR 技術(shù)分別對甜菜抗褐斑病基因—幾丁質(zhì)酶At Chitinase1 和葡聚糖酶At Glucanase2進行克隆，獲得兩個抗病基因功能片段，為培育自主產(chǎn)權(quán)的抗病甜菜品種奠定了基礎(chǔ)。

2 甜菜根腐?。⊿ugarbeet root rot）研究

2.1 發(fā)生與危害

植物病害的發(fā)現(xiàn)和鑒定對于有針對性地應(yīng)用植物保護措施至關(guān)重要。甜菜根腐病是由5種不同病原引發(fā)的一種土傳根部類病害，其中4種由真菌引發(fā)，1 種由細菌引發(fā)，因病原物種類多及環(huán)境條件差異，癥狀表現(xiàn)不同[2]。發(fā)病初期葉片褪綠黃化，生長緩慢，后期根部發(fā)霉變黑，逐步死亡。根腐病是世界性的病害，目前是歐美甜菜生產(chǎn)上最為嚴重的問題。在中國東北地區(qū)發(fā)病最重、危害嚴重，一般造成10%～40%的產(chǎn)量損失[2]。土壤水分含量大、通透性差、鹽漬化高、地下害蟲和病菌含量多，都有利于病害的發(fā)生。土壤水分是整個生長季與病害嚴重程度相關(guān)最密切的環(huán)境因子，土壤含水量越高，枯黃鐮刀菌發(fā)生越重；在干旱年份，該病害嚴重程度較小，特別是抗病品種；隨著作物年齡的增加，枯黃鐮刀菌在田間呈逐漸增加的趨勢[20]。一般甘薯軟腐病菌（Rhizopus stolonifer）不能單獨侵染甜菜，2010 年Hanson[21]報道，在美國密歇根州的甜菜產(chǎn)區(qū)，一種幾乎沒有葉、冠部癥狀的甜菜根腐病發(fā)病率增加，經(jīng)鑒定是由甘薯軟腐病菌引起的二次腐爛。

在根腐病中、低風(fēng)險的土壤中，生物檢測和PCR定量監(jiān)測結(jié)果存在差異。但是，PCR定量監(jiān)測為疾病風(fēng)險評估提供了一種有價值的新工具，使甜菜種植者能夠鑒別根腐病高風(fēng)險田塊[22]。最近發(fā)明的光學(xué)傳感器能夠測量病原體，并能客觀地測知植物生理上的變化，特別是高光譜傳感器，能在不同的水平上識別和定量監(jiān)測病害,成為植物病害檢測的有效工具[23]。

2.2 甜菜抗根腐病遺傳育種研究進展

Kakueinezhad 等[24]在溫室內(nèi)測試了10 個甜菜品系生長6 周和12 周兩個不同生長階段對根腐病的抗性，結(jié)果表明，甜菜成熟植株的抗性水平較高；生長階段與甜菜品系之間沒有交互作用，這表明了在生長前期評價甜菜根腐病抗性的可行性，從而節(jié)省了時間和費用；在這兩個不同的生長階段，對抗病品系（S2-24-P.107）和感病品系（Sb-191）中過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性進行比較，結(jié)果表明，抗病品系POD、CAT 和PPO 三種酶的活性和酚類含量均高于感病品系，而接種病菌對APX活性的影響不顯著，這表明POD、CAT、PPO 和酚類物質(zhì)在甜菜根腐病抗性中表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢。植物防御蛋白多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPs）能抑制病原體分泌的多聚半乳糖醛酸酶（PGs），在病害發(fā)生初期破壞植物細胞壁。因此，研究PGIPs在植物細胞中的定位，PGIPs與PGs 之間的作用方式及PGIPs 對植物感病的影響非常重要。Haiyan 等[25]研究首次報告甜菜BvPGIP 基因有11 個富含亮氨酸重復(fù)（LRR）結(jié)構(gòu)域，該基因?qū)α⒖萁z核菌（Rhizoctonia solani）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、葡萄孢菌（Botrytis cinerea）三種不同的真菌病原體均有抗性。

Lein等[26]各以根腐病抗病和感病材料為親本，構(gòu)建了其F2、F3代的基因圖譜，發(fā)現(xiàn)父代抗病基因第38個表達序列上有25 個限制性位點，其中，第4、5、7 位點被定位。日本也從NK-310mm-O 與NK-184-mm-O 雜交后代中分離出一個顯性抗病基因Acr1（Aphanomyces cochlioides resistance 1），通過切割擴增多態(tài)性序列（CAPS）分析，該基因位于第3 條染色體上[27]。吳旭紅[28]采用集團分離分析法（BSA）和ISSR 技術(shù)，對甜菜高抗根腐病品種ZD204 及其雜交后代的抗病基因快速標(biāo)記，獲得了一個與抗甜菜根腐病基因連鎖的ISSR 分子標(biāo)記“OPP0760”，該標(biāo)記可用作甜菜幼苗期抗根腐病鑒定。

2002 年以來，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所與德國KWS 公司合作，相繼育成了ZD202、ZD204、ZD206、ZD210、ZTD305 等抗病豐產(chǎn)型品種，對于控制根腐病的發(fā)生起到了一定的作用[29]。2013—2014 年，王茂芊等[30]通過對18 份國內(nèi)外優(yōu)良甜菜品種進行鑒定，結(jié)果，國外品種H809、ST13929、KUHN9046、H003 及國產(chǎn)品種ZTD305、TY310、ZTD304、TY312 表現(xiàn)出穩(wěn)定的根腐病抗性；2017 年，對國內(nèi)外11 份甜菜品種根腐病調(diào)查結(jié)果顯示，國外品種感病率為2.9%～4.2%，國內(nèi)品種感病率為2.0%～3.1%，參試的國內(nèi)品種的根腐病抗性略好于國外品種[31]。王希等[32]采用表型與分子標(biāo)記相結(jié)合方法研究甜菜遺傳多樣性，將130 份甜菜種質(zhì)分成了5個近緣組，相鄰組間含糖率、產(chǎn)糖量、根腐病病情指數(shù)均有顯著差異。

3 抗甜菜叢根?。≧hizomania）研究

3.1 發(fā)生與危害

叢根病是世界主要糖甜菜種植地區(qū)最具破壞性的生物脅迫之一，是甜菜壞死黃脈病毒（BNYVV）引起的土傳病害，又叫“瘋根病”。BNYVV 以甜菜多粘菌為傳播介體進行傳播，BNYVV 分成A 型、B 型和P 型3種主要致病型[33-34]。甜菜發(fā)病時葉片黃化、葉脈兩側(cè)退綠，最后擴展到整株葉片；地下次生側(cè)根和毛根異常增多，植株矮小。

3.2 甜菜抗叢根病遺傳育種研究進展

甜菜叢根病是土傳性病害，通過輪作倒茬、早種植等栽培措施對叢根病只起到防御作用；土壤熏蒸等化學(xué)防治成本高，對人、畜及環(huán)境有害；控制該病害的有效方法是使用抗病品種?？箙哺』蛞咽褂?0 多年了，一直以來“Rizor”或“Holly”（主基因是Rz1）和WB 42（主基因是Rz2）作為抗性種質(zhì)資源廣泛應(yīng)用于抗叢根病育種中。發(fā)病嚴重時，Rz1 和Rz2 同時作用也能實現(xiàn)很好的抗病性；丹麥也發(fā)現(xiàn)了對叢根病有抗性的野生甜菜種質(zhì)WB41（主基因是Rz3）[35]。Gidner[36]等應(yīng)用3 種分子標(biāo)記，對甜菜圖譜群進行QTL 分析，鑒定出1 個新的抗性基因Rz4，同Rz1、Rz2 和Rz3 一樣也位于第3號染色體上。Funk[37]利用隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）在第3 號染色體的16 Mb 中鑒定出20 個NB-LRR 位點，在親本C869 中鑒定出含有15 個基因的抗叢根病基因簇。Grimmer 等[38-39]聯(lián)合應(yīng)用3 種分子標(biāo)記，將新的沿海甜菜抗BNYVV 基因Pm3和Pm4定位于第2、4號染色體，觀賞甜菜和葉用甜菜的抗性基因Pm5、Pm6定位于第4號染色體；又在來自于意大利的甜菜種質(zhì)WB258 中，將主基因Rz5 定位；在甜菜亞種的一些品系中也鑒定出一些不同程度的抗病毒單株。Funk 等[40]對3 號染色體Rz 區(qū)叢根病抗性區(qū)的核苷酸結(jié)合域富含亮氨酸重復(fù)序列（NLR）圖譜進行了表征，識別26 個類似NLR 的序列，長度為20 Mb；這項研究首次對石竹目中一個物種NLR 家族成員進行了詳細分類，為更廣泛地進行甜菜抗病育種提供理論基礎(chǔ)，并提供了一個基于核酸序列預(yù)測非模式植物NLR家族的新方法。Pavli用轉(zhuǎn)基因方法獲得的甜菜轉(zhuǎn)化植株對甜菜叢根病有一定的抗性[34]。

最近，Broccanello 等[41]采用ELISA 分別檢測了一種命名為“AYPR”的新BNYVV 菌株和IV-BNYVV 病毒侵染的甜菜F2分離群體的菌株病毒含量；利用包含384 個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點的芯片分別對抗病型和感病型甜菜進行基因分型檢測，發(fā)現(xiàn)SNP249 與AYPR 病毒的抗病性顯著相關(guān)（R2=0.37，P=0.004），表明SNP249可作為抗AYPR病毒侵染叢根病育種的分子標(biāo)記，這一研究引起重大關(guān)注。

為豐富高抗絲核菌根、莖腐病的抗性資源，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)工程應(yīng)用技術(shù)研究所（USDA-ARS）的育種家們經(jīng)過對抗性材料GW674、GW359 數(shù)輪混合選擇后，育成了FC701、702、710 等高抗材料[42]。中國也將培育抗（耐）叢根病甜菜新品種作為重要育種目標(biāo)，相繼育成了‘張?zhí)?01’、‘中甜-雙豐317’、‘內(nèi)糖（ND）38’、‘中甜-內(nèi)糖（ND）37、‘寧甜雙優(yōu)2 號’、‘內(nèi)甜抗202’、‘ZT-6’、‘農(nóng)大甜研6 號’和‘XJT9907’等抗（耐）叢根病品種[11，33，43-44]。趙尚敏[45]將形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記相結(jié)合，對59份甜菜抗叢根病種質(zhì)資源進行聚類分析表明，各材料在表型遺傳上差異較大，遺傳相異系數(shù)在0.18～0.94之間，并將59份種質(zhì)劃分為五大類。

4 我國甜菜抗病育種研究展望

抗病品種的選育和應(yīng)用是防治病害最有效的途徑。我國甜菜抗病育種研究進展與國外還存在很大差距。為此在借鑒國外先進的抗病育種經(jīng)驗，加強以下幾方面研究，加速甜菜抗病研究進程。

4.1 以豐產(chǎn)、高糖、兼抗為目標(biāo)，拓寬遺傳基礎(chǔ)，豐富甜菜抗病種質(zhì)資源

抗病的種質(zhì)資源收集、引進、鑒定、篩選及利用是抗病育種的基礎(chǔ)。國外抗性育種起步較早，遺傳資源豐富，中國不是甜菜的起源國，遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗性基因源匱乏，許多野生材料及遠緣雜交材料等抗性資源在抗病育種中尚未有效利用[46-47]。今后我國的甜菜抗病育種要以豐產(chǎn)、高糖、兼抗為目標(biāo)，一方面要在現(xiàn)有種質(zhì)資源中繼續(xù)篩選抗性基因，另一方面拓寬遺傳基礎(chǔ)，積極引進國外的抗性資源，豐富抗病種質(zhì)資源。

4.2 建立高效的分子標(biāo)記輔助選育（MAS）體系

傳統(tǒng)甜菜抗病育種用時長，且常伴有基因連鎖現(xiàn)象，難以獲得既抗病又高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的品種，采用聚合育種能夠克服回交育種只能改良個別性狀的局限性[48]。分子標(biāo)記技術(shù)不受大田環(huán)境影響，能夠?qū)崿F(xiàn)對基因型的直接選擇，不僅可對抗性基因篩選，還可進行甜菜致病菌群的鑒定工作[49]。目前，應(yīng)用分子標(biāo)記進行糧食作物抗病聚合育種的報道較多，而甜菜上研究很少，主要限于標(biāo)記物的開發(fā)。至今，只有幾個抗病基因的數(shù)量、在染色體上的位置以及與其它抗性基因的關(guān)系被研究，10個染色體上的位置被確認[28，46，49-50]。

今后，應(yīng)加強對甜菜抗病基因的精細定位，充分發(fā)掘QTL 信息，構(gòu)建更為飽和的分子標(biāo)記連鎖圖譜，建立高效的MAS 體系。要充分借鑒水稻等作物分子標(biāo)記聚合育種的經(jīng)驗，最好選擇一個優(yōu)良品種（系）為共同雜交親本，以便在基因聚合時使優(yōu)良品種在抗性上得到改良，創(chuàng)造具廣譜抗性的甜菜種質(zhì)或品種。

4.3 加強甜菜抗病基因工程研究，加快甜菜抗病育種進程

利用基因工程技術(shù)能夠?qū)⒖剐曰蜣D(zhuǎn)到甜菜體內(nèi)，有針對性地防御病菌侵染，避免損傷有益菌群和真菌，為抗病育種提供新途徑[51]。人工miRNA 技術(shù)為抗病毒育種提供了重要的思路和豐富的抗病種質(zhì)[53-54]。已知甜菜壞死黃脈病毒（BNYVV）是由4～5個RNA 單鏈組成的一種多段正鏈RNA 病毒，可借助擬南芥、煙草等上轉(zhuǎn)導(dǎo)表達研究[54]。通過對miRNA 進行深度測序，在被BNYVV 侵染的大果甜菜中發(fā)現(xiàn)了來自38 個miRNA 家族的103 個已知miRNA 和45 個潛在的新miRNA，這些miRNA 能夠參與激素合成及信號傳導(dǎo)等生物途徑，該研究對理解BNYVV 的致病機制以及提高甜菜叢根病抗病性具有重要意義[55-56]。然而，目前從非編碼RNA 角度對甜菜進行研究的資料比較少[57]。CRISPR/Cas 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)是一種可以在對動、植物體內(nèi)DNA 序列進行定點突變的新技術(shù)，最近，利用該技術(shù)對病毒所依賴的植物基因進行定點突變或編輯，從而打破病毒與植物基因的互作關(guān)系，為創(chuàng)造抗病毒的作物提供了一條行之有效的途徑[58]。目前，已從玉米、水稻等植物中成功地克隆到抗病基因，而從甜菜中分離、克隆的報道較少。此外，通過轉(zhuǎn)外源基因獲得抗病甜菜的報道也不多，成果集中在甜菜抗叢根病基因工程的研究方面[59]。

今后，應(yīng)積極開展細胞融合、組織培養(yǎng)、外源DNA 導(dǎo)入、人工誘變技術(shù)、非編碼RNA 技術(shù)、高通量測序，抗病基因分離、克隆、編輯等生物工程手段，進行開放式育種、穿梭式育種[60]，發(fā)揮多學(xué)科聯(lián)合攻關(guān)及協(xié)作，加快甜菜抗病育種進程。