超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定甜菜中甜菜安和甜菜寧的殘留量

董見南，賈金蓉，陳國峰，劉峰，張曉波

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究所，哈爾濱 150086）

0 引言

甜菜安（Desmedipham）和甜菜寧（Phenmedipham）為二氨基甲酸酯類除草劑，先后由Arndt 等人于1967年、1969 年報道除草活性，德國先靈公司開發(fā)的選擇性內吸除草劑[1]。能有效防治多種闊葉雜草，在我國主要在甜菜和草莓等作物上登記使用。已有報道中對甜菜安及甜菜寧的研究主要集中在合成[1-2]、藥效[3-5]、制劑分析[6]及環(huán)境基質中的殘留分析[7-8]，作物基質中甜菜安及甜菜寧殘留量分析方法鮮有報道。黃雅俊等[9]、逯忠斌等[10]建立的甜菜安及甜菜寧在甜菜及甜菜葉中的殘留分析方法，分別使用丙酮和硫酸銅溶液-甲醇混合液提取，經(jīng)液液分配轉入二氯甲烷中，再使用中性氧化鋁柱凈化，高效液相色譜檢測分析。此方法檢測器靈敏度較低，因此采用加大樣本量（50 g）的方法增加濃縮倍數(shù)來提高靈敏度，這使得凈化過程較為復雜，且前處理過程使用大量的有機溶劑，不能滿足經(jīng)濟、環(huán)保、綠色的發(fā)展要求。GB/T 20769-2008[11]建立的水果蔬菜中的多殘留分析方法中包含甜菜寧，該方法使用高效液相色譜-串聯(lián)質譜做檢測器，靈敏度較高，使用乙腈做提取溶劑，固相萃取柱凈化較層析柱簡便。已有的文獻未能同時檢測甜菜安和甜菜寧且將兩種除草劑分別定量檢測，本研究結合了分散固相萃取凈化法，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時分析甜菜中甜菜安及甜菜寧殘留量的方法，并對田間試驗樣品進行了檢測分析，為指導農(nóng)藥的合理安全使用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甜菜安標準品（99.0%）、甜菜寧標準品（99.7%）由Dr.Ehrenstorfer 公司提供；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，由迪馬公司提供；NaCl 為分析純，由北京化學試劑公司提供；丙基乙二胺（PSA）40～60μm，由上海安譜有限公司提供。供試農(nóng)藥為27%安?寧?乙呋黃乳油（甜菜安7%、甜菜寧9%、乙氧呋草黃11%）。

Waters TQ Detector 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（HPLC-MS/MS）；色譜柱Acquity UPLC? BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；電子天平Sartorius BSA6202S；振蕩器IKA HS501；過濾器（濾膜孔徑0.22μm）；常用玻璃器皿。

1.2 試驗方法

1.2.1田間試驗

參照《農(nóng)藥殘留試驗準則》（NY/T 788-2018）[12]，2018 年在黑龍江省哈爾濱市、北京市及寧夏回族自治區(qū)銀川市3 地進行了田間試驗。27%安?寧?乙呋黃乳油，推薦施藥劑量1 215～1 620 g a.i./hm2（制劑300～400 mL/畝），選擇最高劑量1 620 g a.i./hm2進行最大風險試驗。于甜菜苗后闊葉雜草2～4 葉期，噴霧施藥一次。另設空白對照小區(qū)。于甜菜收獲期采集甜菜根塊樣品與對照樣品。樣品采集后用自封袋密封，貼好標簽后在-20 ℃以下保存。

1.2.2前處理

稱取粉碎的甜菜樣品10 g 于50 mL 具塞離心管中，移取10 mL 水和20 mL 乙腈，加蓋后振蕩提取30 min，加入4 g NaCl，渦旋1 min 鹽析，以3 500 r/min 離心5 min。移取10 mL 上層有機相，40 ℃水浴旋轉蒸發(fā)至干，1 mL 乙腈-水（5∶5）定容。用50 mg PSA 分散固相萃取凈化，上清液經(jīng)0.22μm 有機系濾膜過濾，待進樣分析。外標法進行定量和定性分析。

1.2.3儀器條件

色譜柱Acquity UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；柱溫35 ℃；流速0.30 mL/min；流動相及梯度洗脫見表1；進樣量10μL；電噴霧離子源ESI；正離子源掃描方式；毛細管電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣流量650 L/h；錐孔氣流量50 L/h；多重反應監(jiān)測（MRM）方式，甜菜安和甜菜寧的定量、定性離子對及其他質譜分析條件見表2。

表1 梯度洗脫比例Table 1 Ratio table of gradient elution

表2 甜菜安和甜菜寧的質譜分析條件Table 2 Mass spectrometry analysis conditions of desmedipham and phenmedipham

1.2.4標準工作曲線的繪制

分別稱取甜菜安和甜菜寧標準品0.010 9 g（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，配制成質量濃度為1 000 mg/L 的標準貯備液，再配制成質量濃度為100 mg/L 的混合工作溶液。試驗時再用乙腈-水（5∶5）逐級稀釋成質量濃度為1.0、0.5、0.1、0.05、0.01 mg/L 的系列標準溶液。在上述儀器條件下測定，以標準溶液濃度為橫坐標（x）、定量離子峰峰面積為縱坐標（y）繪制標準工作曲線。

1.2.5方法的回收率和精密度

向空白甜菜中添加甜菜安和甜菜寧的混合工作溶液，樣品中添加濃度如表1 所示，每個濃度進行5 次重復試驗，然后按照上述方法測定，計算回收率和相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 儀器參數(shù)優(yōu)化

甜菜安及甜菜寧的結構式見圖1，二者從結構上比較相似，為了在液譜上實現(xiàn)兩者的分析，需要較大比例的水基流動相，因此在流動相的梯度洗脫方面進行了優(yōu)化。在經(jīng)過前1 min 的預濃縮（水基-甲醇90∶10）后，選擇1.0～5.0 min逐漸過渡至水基-甲醇50∶50，5.0～15.0 min逐漸過渡至水基-甲醇30∶70，使得甜菜安與甜菜寧達到完全分離。使用純乙腈作定容溶劑時，兩種除草劑的溶劑效應嚴重，色譜峰會出現(xiàn)較明顯的溶劑前延，因此選擇乙腈-水（5∶5）作定容溶劑，色譜峰峰形明顯改善（見圖2）。

圖1 甜菜安（A）及甜菜寧（B）可能的碎片離子斷裂方式Fig.1 Possible broken ways of desmedipham(A)and phenmedipham(B)to fragment ions

圖2 甜菜安及甜菜寧在甜菜空白樣品（A）、基質匹配標樣（B）和添加回收樣品（C）中的典型色譜圖Fig.2 Typical UPLC-MS/MS chromatograms of desmedipham and phenmedipham in sugar beet blank(A),sugar beet matrix standard(B)and sugar beet recovery sample(C)

甜菜安及甜菜寧的結構式僅一個甲基位置不同，因此易得到相同或相似的碎片離子。對甜菜安及甜菜寧進行碎片離子掃描（圖3），二者均易得到核質比（m/z）為136的碎片離子，為了使甜菜安和甜菜寧在離子對方面得到區(qū)分，兼顧其他碎片離子的靈敏度，最終確定甜菜安以離子對（m/z）301→154.1 進行定量分析，301→136 進行定性分析，甜菜寧以離子對（m/z）301→136 進行定量分析，301→168.1 進行定性分析。可能的碎片離子斷裂方式如圖1所示。

圖3 甜菜安（A）及甜菜寧（B）碎片離子掃描圖Fig.3 The fragment ions scan chromatograms of desmedipham(A)and phenmedipham(B)

2.2 前處理方法摸索

國標GB/T 20769-2008[11]收錄了蔬菜水果中甜菜寧的殘留分析方法，參照國標選用乙腈做提取溶劑。乙腈提取之后的溶液，會有色素、酚類、醌類等雜質[13]?？紤]甜菜中可能含有較高的糖類等雜質，本文比較了無凈化、弗羅里硅土、C18、PSA（25 mg 及50 mg）對濃縮后提取液的凈化效果。試驗結果表明，對于兩種除草劑，凈化與否及不同凈化劑對回收率均無明顯影響，但凈化后甜菜安的靈敏度有大幅度提高，且50 mg PSA凈化效果最顯著。因此選擇使用50 mg PSA 做為凈化劑對提取濃縮液進行分散固相萃取凈化。

2.3 檢測方法評價

用乙腈-水（5∶5）配制不同質量濃度的甜菜安及甜菜寧系列標準溶液，濃度與儀器條件見1.2.4，在0.01～1.0 mg/L濃度線性良好。

甜菜寧的標準工作曲線為：y=31 658 x-45.9（R2=0.999 9）

甜菜安的標準工作曲線為：y=71 690 x+90.7（R2=0.999 6）

甜菜安及甜菜寧在甜菜中的添加回收試驗，典型色譜圖如圖2 所示。甜菜安的平均回收率為91.1%～95.6%，相對標準偏差（RSD）為2.4%～7.6%；甜菜寧的平均回收率為93.4%～95.8%，RSD 為5.0%～9.8%（表3）。將最小添加濃度確定為方法的定量限（LOQ，以質量分數(shù)計，mg/kg），甜菜安及甜菜寧在甜菜中的LOQ均為0.02 mg/kg。以定量離子色譜峰3 倍信噪比對應濃度確定為方法的檢出限（LOD，以質量分數(shù)計，mg/kg），甜菜安的LOD 為1.5×10-3mg/kg，甜菜寧的LOD 為2.6×10-4mg/kg。中國制定的最大殘留限量（GB 2763-2016）均為0.1 mg/kg。結果表明所建方法的準確度、精密度及靈敏度較好，均符合農(nóng)藥殘留分析試驗的要求。

表3 甜菜安及甜菜寧在甜菜中的添加回收率Table 3 Recoveries of desmedipham and phenmedipham in sugarbeet

2.4 甜菜安及甜菜寧在田間樣品中的檢測

2018年按照施藥劑量1 620 g a.i./hm2（制劑400 mL/畝）在甜菜上施用1次，施藥時期為苗后闊葉雜草2～4 葉期，甜菜收獲時采集甜菜塊根樣品進行殘留量測定。哈爾濱市、北京市及銀川市3 地樣品中甜菜安及甜菜寧的殘留量均＜0.02 mg/kg。我國制定的甜菜安及甜菜寧在甜菜中的最大殘留限量為0.1 mg/kg。試驗結果表明，按照推薦方法施用該農(nóng)藥，收獲期甜菜中的甜菜安及甜菜寧殘留量低于我國限量標準。

3 討論與結論

本文研究建立了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定甜菜中甜菜安及甜菜寧殘留量的方法。已有關于甜菜安及甜菜寧殘留檢測方法的報道較少。黃雅俊等[9]使用丙酮作提取溶劑，逯忠斌等[10]選用硫酸銅溶液-甲醇混合液提取，Perret等人[7]選用甲醇進行土壤中兩種除草劑的提取，近年來隨著QuEChERS 方法的發(fā)展應用，乙腈作為提取溶劑的優(yōu)點越來越得到廣大科學工作者的認可，國標GB/T 20769-2008[11]亦選用乙腈作為水果蔬菜中甜菜寧的提取溶劑。綜合考慮后續(xù)濃縮凈化步驟，本研究直接選擇乙腈與水的混合溶液做提取溶劑，NaCl鹽析后通過簡單的離心步驟即可實現(xiàn)有機相與水相的分離。國標使用固相萃取柱法進行凈化，每個樣品需要消耗有機溶劑35～40 mL，凈化過程約耗時20 min，本研究選用分散固相萃取法凈化，幾乎不額外消耗有機溶劑，每個樣品3～5 min 即可完成凈化步驟。與固相萃取柱法相比，分散固相萃取法操作簡便且節(jié)省溶劑，省時省力、綠色環(huán)保?？紤]甜菜樣品中可能含有的雜質，通過比較無凈化、PSA及弗羅里硅土等幾種凈化方式，最終選擇50 mg PSA 作為凈化劑。利用串聯(lián)四級桿質譜檢測器選擇性強的優(yōu)點，分散固相萃取可以取代國標方法中固相萃取柱的凈化方法，使凈化步驟更加簡便高效。

經(jīng)本文建立的殘留量測定方法，甜菜安及甜菜寧在甜菜中的平均回收率分別為91.1%～95.6%、93.4%～95.8%，RSD 分別為2.4%～7.6%、5.0%～9.8%，方法的定量限（LOQ）均為0.02 mg/kg。該方法步驟簡單，省時快速，精準度和靈敏度均能滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。田間試驗表明，以施藥劑量1 620 g a.i./hm2（制劑400 mL/畝）于苗后闊葉雜草2～4 葉期在甜菜上施用27%安?寧?乙呋黃乳油1 次，收獲期甜菜中甜菜安及甜菜寧的殘留量均＜0.02 mg/kg。我國已制定二者在甜菜中的最大殘留限量為0.1 mg/kg。結果表明，按照推薦劑量施用27%安?寧?乙呋黃乳油后，收獲甜菜中甜菜安及甜菜寧的殘留量低于我國限量標準，該數(shù)據(jù)為指導農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。