貝達(dá)喹啉、氯法齊明和德拉馬尼對(duì)常見(jiàn)致病性非結(jié)核分枝桿菌體外抑菌活性及耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

孫晴 黃海榮 王桂榮

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)系指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。NTM常存在于自然環(huán)境中，為機(jī)會(huì)性致病菌。近年來(lái)， NTM 引起的感染呈逐漸上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。NTM感染肺、淋巴結(jié)、皮膚等器官和組織的疾病稱為NTM病，以肺部受感染多見(jiàn)。NTM病往往作為繼發(fā)性或伴隨性疾病，患者通常伴隨慢性基礎(chǔ)疾病或免疫系統(tǒng)的損害，如患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)、惡性腫瘤、艾滋病(AIDS)等疾病。NTM病在臨床表現(xiàn)及影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等方面與結(jié)核病相比無(wú)明顯差異，但二者的治療方案卻大相徑庭。此外，NTM致病的菌種繁多，不同菌種NTM對(duì)藥品的敏感性不同，針對(duì)不同菌種引起的NTM病的治療方案也存在較大差異。因此尋找對(duì)NTM治療效果較佳的藥品非常有必要。近年來(lái)，貝達(dá)喹啉(bedaquiline,Bdq)、氯法齊明(clofazimine，Cfz)及德拉馬尼(delamanid，Dlm)因?qū)χ委烴TM病體現(xiàn)出了良好的治療潛力而受到廣泛關(guān)注。

雖然NTM種屬分布常具有地域特點(diǎn)，不同國(guó)家、地區(qū)報(bào)道的NTM菌種組成、菌種構(gòu)成比例多存在明顯差異，但在多數(shù)地區(qū)鳥(niǎo)-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(M.aviumcomplex,MAC)、膿腫分枝桿菌(M.abscessus)和堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)為較常見(jiàn)的致病菌種。筆者將圍繞Bdq、Cfz和Dlm對(duì)常見(jiàn)致病性NTM的體外抑菌活性及耐藥相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述。

Bdq對(duì)常見(jiàn)致病性NTM的體外抑菌活性及耐藥機(jī)制

Bdq是近40 多年來(lái)第一個(gè)上市的抗結(jié)核新藥，屬于二芳基喹啉類化合物。Bdq是一種三磷酸腺苷(ATP)合成酶抑制劑，通過(guò)與分枝桿菌的ATP合成酶C亞基結(jié)合，影響ATP合成酶質(zhì)子泵生物學(xué)功能，導(dǎo)致ATP耗竭和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，從而達(dá)到抑菌或殺菌效果[3]。2012年經(jīng)美國(guó)食品與藥品管理局批準(zhǔn)，Bdq可用于治療耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)[4]。因Bdq對(duì)治療NTM病體現(xiàn)出了良好的治療潛力而受到廣泛關(guān)注。

一、Bdq對(duì)NTM的體外抑菌活性

《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》根據(jù)NTM的生長(zhǎng)速度將其分為快速生長(zhǎng)分枝桿菌(rapid growing mycobacterium,RGM)和緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌(slow growing mycobacterium,SGM)。Bdq為剛上市不久的新藥，美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute)或世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)還未界定Bdq對(duì)NTM的耐藥臨界值。Yu等[5]的研究建議Bdq對(duì)NTM(包括RGM和SGM)的流行病學(xué)臨界(epidemiological cut-off，ECOFF)平均值應(yīng)為2 μg/ml；Pang等[6]建議Bdq對(duì)RGM的ECOFF為2 μg/ml，對(duì)SGM的ECOFF為1 μg/ml。

Yu等[5]的研究顯示，Bdq對(duì)SGM和RGM的絕大部分標(biāo)準(zhǔn)株具有很強(qiáng)的體外抑菌活性，但對(duì)SGM的抑菌活性要強(qiáng)于RGM；對(duì)于常見(jiàn)的致病性NTM臨床分離株，Bdq也體現(xiàn)出了良好的體外抑菌活性。Bdq對(duì)MAC和M.kansasii臨床分離株均具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑制50%細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度(MIC50)和抑制90%細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度(MIC90)值均在較低水平。Kim等[7]的研究結(jié)果顯示，MAC和M.kansasii臨床分離株對(duì)Bdq的MIC50和MIC90均為0.016 μg/ml。Pang等[6]的研究結(jié)果表明，MAC臨床分離株對(duì)Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.03 mg/L和≥16 mg/L；M.kansasii臨床分離株對(duì)Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.06 mg/L和>16 mg/L。DeStefano等[8]的研究結(jié)果顯示，M.kansasii臨床分離株對(duì)Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.06 μg/ml和>16 μg/ml。Brown-Elliott等[9]的結(jié)果顯示，MAC臨床分離株對(duì)Bdq的 MIC50和MIC90分別為≤0.008 μg/ml和0.015 μg/ml。

另外，Bdq對(duì)M.abscessus臨床分離株也有良好的體外抑菌效果，但要弱于對(duì)M.kansasii和MAC臨床分離株的體外抑菌效果。Kim等[7]的研究結(jié)果顯示，M.abscessus臨床分離株對(duì)Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.062 μg/ml和0.125 μg/ml。Pang等[6]的研究結(jié)果表明，M.abscessus臨床分離株對(duì)Bdq的 MIC50和MIC90分別為0.13 mg/L和>16 mg/L。Li等[10]的研究結(jié)果顯示，M.abscessus臨床分離株對(duì)Bdq的MIC50和MIC90分別為0.062 mg/L和0.125 mg/L。Yu等[5]的研究結(jié)果顯示，M.abscessus臨床分離株對(duì)Bdq的MIC90為2 μg/ml。Dupont等[11]的研究結(jié)果表明，在斑馬魚(yú)體內(nèi)Bdq對(duì)M.abscessus依然有著良好的抑菌效果。

可見(jiàn)，Bdq在體外對(duì)緩慢生長(zhǎng)的MAC和M.kansasii臨床分離株，以及快速生長(zhǎng)的M.abscessus臨床分離株均表現(xiàn)出了良好的抑菌效果。

二、 NTM對(duì)Bdq耐藥的相關(guān)機(jī)制

盡管Bdq對(duì)MDR-TB和XDR-TB具有良好的治療效果，但仍存在耐藥問(wèn)題。結(jié)核分枝桿菌對(duì)Bdq的耐藥主要存在以下幾種機(jī)制：atpE基因突變、Rv0678基因突變和pepQ(Rv2535c)基因突變[12]。研究顯示，NTM對(duì)Bdq的耐藥機(jī)制與結(jié)核分枝桿菌大體相似，卻又不盡相同，大致總結(jié)為以下幾種。

1.atpE基因突變：atpE基因編碼ATP合成酶的C亞基，是Bdq的主要靶點(diǎn)。耐藥菌株可以阻止Bdq與C亞基結(jié)合，從而阻斷Bdq的抗菌作用。Andries等[13]研究發(fā)現(xiàn)，恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)atpE基因發(fā)生了D32V突變。Aguilar-Ayala等[14]在對(duì)atpE基因序列測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)其63位丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍彼?，這很可能是微黃分枝桿菌(M.flavescens)對(duì)Bdq 產(chǎn)生天然抗性的原因。Dupont等[11]在M.abscessus中對(duì)atpE基因進(jìn)行單點(diǎn)突變時(shí)發(fā)現(xiàn)D29V和A64P會(huì)導(dǎo)致Bdq高抗性。

2.Rv0678同源基因突變：在結(jié)核分枝桿菌中，Rv0678是mmpL轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子，Rv0678突變可導(dǎo)致編碼mmpS5-mmpL5外排泵基因表達(dá)上調(diào)，從而使結(jié)核分枝桿菌對(duì)Bdq產(chǎn)生耐藥[15]。Li等[10]在對(duì)Bdq耐藥的M.abscessus中發(fā)現(xiàn)Rv0678的同源基因Mab_4383/Mab_4382和Mab_4384存在突變，導(dǎo)致mmpS5-mmpL5過(guò)表達(dá)；另外Mab_4384的缺失也會(huì)導(dǎo)致Bdq耐藥。

3.mmpT5突變：在M.intracellulare中mmpT5與mmpR5(Rv0678)作用相似，都編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)控mmpS5-mmpL5外排泵基因的表達(dá)。Alexander等[16]的研究認(rèn)為，移碼突變導(dǎo)致了mmpT5功能喪失，與M.intracellulare對(duì)Bdq的低水平耐藥相關(guān)。

4.Mab_2299c突變：Mab_2299c屬于TetR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子家族，通過(guò)調(diào)控Mab_2300/Mab_2301，進(jìn)而調(diào)控mmpS/mmpL外排泵系統(tǒng)。Richard等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在M.abscessus中Mab_2299c突變與對(duì)Bdq耐藥相關(guān)，也與對(duì)Bdq和Cfz產(chǎn)生交叉耐藥相關(guān)。

Cfz對(duì)常見(jiàn)致病性NTM的體外抑菌活性及耐藥機(jī)制

Cfz是 20 世紀(jì) 40 年代研制的抗分枝桿菌藥品，主要用于麻風(fēng)病的治療，近年來(lái)開(kāi)始用于治療MDR-TB。目前Cfz抑菌的作用機(jī)制尚不清楚，分枝桿菌的外膜似乎是Cfz作用的主要靶點(diǎn)[18]。

一、Cfz對(duì)NTM的體外抑菌活性

Luo等[19]和Li等[20]對(duì)NTM標(biāo)準(zhǔn)株的研究結(jié)果顯示，Cfz對(duì)SGM的體外抑菌活性要強(qiáng)于RGM。Cfz對(duì)不同NTM臨床分離株的體外抑菌活性差異較大，Cfz對(duì)M.kansasii臨床分離株的體外抑菌活性最強(qiáng)，而對(duì)M.abscessus和M.fortuitum臨床分離株的體外抑菌活性較差。Luo等[19]的研究結(jié)果表明，91%(41/45)的M.kansasii臨床分離株對(duì)Cfz的MIC為0.031 μg/ml；Cfz對(duì)M.avium和M.intracellulare臨床分離株的抑菌活性也較好，ECOFF分別為1 μg/ml和2 μg/ml；而M.abscessus和M.fortuitum臨床分離株對(duì)Cfz的MIC90值均約為8 μg/ml。van Ingen等[21]的研究表明，M.kansasii和MAC臨床分離株對(duì)Cfz的MIC中位值均較低(分別為MIC≤0.5 mg/L、MIC=1 mg/L)；M.abscessus和M.fortuitum臨床分離株對(duì)Cfz的平均MIC值較高，分別為5 mg/L和2 mg/L。Shen等[22]的研究表明，M.abscessus臨床分離株對(duì)Cfz的耐藥率高達(dá)95%(19/20)，MIC90為32 μg/ml，而M.fortuitum耐藥率為59%(10/17)，MIC90為0.25 μg/ml。Huang等[23]的研究顯示，97.3%(73/75)的M.intracellulare臨床分離株對(duì)Cfz敏感；62.5%(5/8)的M.abscessus臨床分離株對(duì)Cfz耐藥。但Shen 等[24]的研究結(jié)果顯示，Cfz對(duì)M.abscessus和M.fortuitum臨床分離株具有較強(qiáng)的抑菌活性，99.1%(116/117) 的M.abscessus和91.7%(44/48)的M.fortuitum臨床分離株對(duì)Cfz的 MIC≤1 mg/L。

這些研究的結(jié)論并不完全一致，可能與選擇的菌株數(shù)量、菌株來(lái)源不同有一定關(guān)系。此外，還有學(xué)者認(rèn)為可能是由于存在交叉耐藥，在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)，Rv0678基因突變可導(dǎo)致對(duì)Bdq耐藥的菌株發(fā)生對(duì)Cfz的交叉耐藥[25]。而Luo等[19]也在NTM中發(fā)現(xiàn)了相似的交叉耐藥現(xiàn)象。

二、NTM對(duì)Cfz耐藥的相關(guān)機(jī)制

結(jié)核分枝桿菌對(duì)Cfz耐藥的機(jī)制主要有以下幾種：Rv0678基因突變、Rv1979c突變和pepQ(Rv2535c)突變[12]。但在NTM中目前僅報(bào)道有Rv0678同源基因突變和Mab_2299c突變。

1.Rv0678同源基因突變：Luo等[19]研究發(fā)現(xiàn)，M.intracellulare對(duì)Cfz 耐藥與Rv0678同源基因Asp92Glu和Ala153Pro突變有關(guān)，研究者通過(guò)Rv0678同源蛋白序列的對(duì)比，認(rèn)為在M.intracellulare中92和153位點(diǎn)是兩處高度保守的位點(diǎn)，并認(rèn)為對(duì)Bdq與Cfz 的交叉耐藥也與這兩處位點(diǎn)突變有關(guān)。

2.Mab_2299c、Mab_1483、Mab_0540突變：Chen等[26]發(fā)現(xiàn)，在M.abscessus中Mab_2299c、Mab_1483、Mab_0540突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)Cfz耐藥。Mab_2299c是結(jié)核分枝桿菌Rv0452的同源基因，該基因調(diào)控外排泵mmpL4-mmpS4，是AcrR家族負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Rv0452和mmpL4-mmpS4在結(jié)核分枝桿菌中的組織結(jié)構(gòu)與Rv0678和mmpL5-mmpS5相同，因此Mab_2299c的突變極有可能引起對(duì)Cfz耐藥。此外，該學(xué)者還在29株對(duì)Cfz耐藥的M.abscessus中發(fā)現(xiàn)，21株發(fā)生Mab_1483突變、16株發(fā)生Mab_0540突變，Mab_1483、Mab_0540被認(rèn)為與對(duì)Cfz低水平耐藥有關(guān)。以上結(jié)論與Richard等[17]在M.abscessus中對(duì)Mab_2299c的研究成果高度相近。

Dlm對(duì)常見(jiàn)致病性NTM的體外抑菌活性及耐藥機(jī)制

2014年4月Dlm被歐洲藥品管理局人用藥品委員會(huì)批準(zhǔn)為抗結(jié)核新藥。Dlm是經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改造后的硝基咪唑類衍生物，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制分枝菌酸的合成而抑制細(xì)胞壁的生物合成[27]。

一、Dlm對(duì)NTM的體外抑菌活性

研究發(fā)現(xiàn)Dlm對(duì)M.kansasii臨床分離株表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑菌活性，而對(duì)其他NTM菌種，Dlm的抑菌活性似乎較差。Yu等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，45株M.kansasii臨床分離株中有39株對(duì)Dlm的MIC為0.125 μg/ml；Kim等[7]的研究中，M.kansasii臨床分離株對(duì)Dlm的MIC50和MIC90分別為0.25 μg/ml和1 μg/ml，而MAC、M.abscessus臨床分離株對(duì)Dlm的MIC值很高，對(duì)MAC的MIC50和MIC90分別為8 μg/ml和>16 μg/ml，對(duì)M.abscessus臨床分離株的MIC50和MIC90均>16 μg/ml。Yu等[5]的研究也同樣表明，Dlm對(duì)M.intracellulare和M.abscessus臨床分離株幾乎沒(méi)有抑菌活性，對(duì)M.avium臨床分離株的抑制活性也較差：91.7%(33/36)的M.intracellulare臨床分離株、92.5%(37/40)的M.abscessus臨床分離株MIC值>32 μg/ml，54.5%(12/22)的M.avium臨床分離株MIC值>32 μg/ml。此外，Yu等[5]還發(fā)現(xiàn)，M.fortuitum臨床分離株對(duì)Dlm 100%耐藥(33/33)，MIC>32 μg/ml。

二、NTM對(duì)Dlm耐藥的相關(guān)機(jī)制

在結(jié)核分枝桿菌中ddn、fgd1、fbiA、fbiB和fbiC基因被報(bào)道與Dlm耐藥相關(guān)，Dlm經(jīng)F420依賴性分枝桿菌硝基還原酶還原成其活性形式，F(xiàn)420隨后通過(guò)6-磷酸葡萄糖脫氫酶循環(huán)還原為還原形式，其中F420由fbiA、fbiB和fbiC基因編碼合成，而該還原酶由ddn(Rv3547)編碼，脫氫酶由fgd1(Rv0407)編碼[28-29]。

Yu等[5]在一株M.avium中發(fā)現(xiàn)ddn基因Thr79Arg和Ser86Cys 位點(diǎn)突變，被認(rèn)為與產(chǎn)生對(duì)Dlm耐藥相關(guān)。其他基因突變目前在NTM中還未見(jiàn)報(bào)道。

小 結(jié)

大環(huán)內(nèi)酯類藥品(以克拉霉素和阿奇霉素為主)被認(rèn)為是治療MAC、M.kansasii的重要藥品[30-33]。治療上通常推薦克拉霉素或阿奇霉素為主的2種以上藥品治療，如乙胺丁醇、利福平、利福布汀等[34]。但是仍有部分患者出現(xiàn)對(duì)一線藥品不耐受，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥品產(chǎn)生耐藥、治療失敗等情況。Cfz則可作為一種有潛力的補(bǔ)充性藥品，與一線藥品聯(lián)用可達(dá)到較好的抑菌效果。目前，有學(xué)者推薦在治療MAC時(shí)將利福平+大環(huán)內(nèi)酯類藥品+乙胺丁醇這一組合換成Cfz+大環(huán)內(nèi)酯類藥品+乙胺丁醇[35]。Jarand等[36]在對(duì)MAC感染患者進(jìn)行隨訪后，也發(fā)現(xiàn)Cfz+大環(huán)內(nèi)酯類藥品+乙胺丁醇這一組合治療效果更優(yōu)；即使用Cfz+大環(huán)內(nèi)酯類藥品+乙胺丁醇治療的患者較使用利福平+大環(huán)內(nèi)酯類藥品+乙胺丁醇的患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性的陰轉(zhuǎn)率更高[100%(90/90)和 71%(10/14)；P=0.0002]。

大環(huán)內(nèi)酯類藥品對(duì)MAC、M.kansasii等的抑菌效果良好，但對(duì)M.abscessus的體外抑菌活性較差[37-38]。有學(xué)者推薦在治療M.abscessus時(shí)應(yīng)在阿米卡星、頭孢西丁、亞胺培南、替加環(huán)素、利奈唑胺中選擇3或4種藥品進(jìn)行聯(lián)合治療[35]。盡管阿米卡星、頭孢西丁等藥品對(duì)M.abscessus有良好的抑菌效果[33,39-42]，但Cfz仍是一種有潛力的治療藥品。一些體外研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聯(lián)用Cfz+阿米卡星或Cfz+克拉霉素時(shí)，對(duì)M.abscessus臨床分離株有很強(qiáng)的抑菌效果：Shen等[24]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cfz與阿米卡星聯(lián)用時(shí)，100%(40/40)的M.abscessus臨床分離株對(duì)Cfz 的MIC值由原來(lái)的0.25～0.5 mg/L下降到<0.03125 mg/L。Ferro等[43]的研究結(jié)果表明，在治療時(shí)使用Cfz+克拉霉素或Cfz+阿米卡星聯(lián)用，比單一使用克拉霉素或阿卡米星的目標(biāo)達(dá)成率高60%以上；在對(duì)M.abscessus感染進(jìn)行治療時(shí)，Cfz的使用可以抑制單獨(dú)使用克拉霉素或阿卡米星治療時(shí)的復(fù)發(fā)。以上2位學(xué)者均認(rèn)為Cfz和阿米卡星、克拉霉素之間存在著協(xié)同作用。Yang等[44]的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cfz和大環(huán)內(nèi)酯類藥品聯(lián)合使用時(shí)，81%(34/42)的M.abscessus患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)，31%(13/42)的M.abscessus患者影像學(xué)復(fù)查結(jié)果有所好轉(zhuǎn)，24%(10/42)的M.abscessus患者實(shí)現(xiàn)了痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)。

展 望

近年來(lái)，Bdq、Cfz及Dlm因?qū)TM病體現(xiàn)出了良好的治療潛力而受到廣泛關(guān)注。繼續(xù)研究NTM對(duì)Bdq、Cfz和Dlm的藥物敏感性試驗(yàn)是十分重要的，可為未來(lái)設(shè)立不同菌株對(duì)Bdq、Cfz和Dlm體外藥物敏感性試驗(yàn)折點(diǎn)奠定相關(guān)基礎(chǔ)。此外，關(guān)于Bdq、Dlm對(duì)NTM病治療效果的臨床試驗(yàn)較少，還需進(jìn)行更多的研究和探索。在臨床上繼續(xù)探索Cfz與不同藥品的聯(lián)用方式及研究各藥品之間的相互作用，以便篩選最優(yōu)聯(lián)用組合是非常重要的。在耐藥相關(guān)機(jī)制方面，一方面還需對(duì)已報(bào)道的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證，另一方面則需要繼續(xù)探索新的與耐藥產(chǎn)生的相關(guān)機(jī)制。