結(jié)核分枝桿菌糖代謝的研究進展

屈孟錦 梁正敏 王元智 周向梅

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)，特別是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性消耗性人畜共患病，是世界上最重要的致死性傳染病之一[1]。盡管卡介苗(BCG)及抗結(jié)核藥品如鏈霉素、異煙肼、利福平等相繼問世，但是MTB與HIV雙重感染，以及MTB耐藥菌株的出現(xiàn)使得結(jié)核病的發(fā)病率和病死率仍然處于較高水平。據(jù)WHO[2]估算，2018年全世界約有145萬例患者死于結(jié)核病，結(jié)核病已經(jīng)成為世界范圍的公共衛(wèi)生問題。

MTB是一種胞內(nèi)寄生菌，主要寄生在宿主的巨噬細胞中，早先人們普遍認為MTB依靠巨噬細胞的脂質(zhì)和膽固醇建立和維持慢性感染[3-4]；但是隨著研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)MTB的代謝網(wǎng)絡可以對多種碳底物同時進行分解代謝，并且這種代謝方式作為致病機制促進MTB應對不斷變化的微環(huán)境[5-6]，越來越多的證據(jù)表明糖代謝在MTB的發(fā)病機制中占據(jù)重要地位，筆者以MTB糖代謝為線索將現(xiàn)有的研究進展進行綜述。

一、MTB糖代謝

MTB通過傳染性氣溶膠進入宿主，巨噬細胞吞噬吸入MTB后穿過肺泡上皮細胞到達肺中，被感染的巨噬細胞募集其他的巨噬細胞和免疫細胞形成肉芽腫結(jié)構(gòu)，肉芽腫中的巨噬細胞在低氧狀態(tài)下生長速度和遷移大大降低，呈現(xiàn)相對靜止的狀態(tài)[7]。為了適應巨噬細胞內(nèi)部的低氧環(huán)境，MTB的代謝方式從有氧轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬跄Ｊ剑墙徒馔緩较嚓P(guān)基因的表達被上調(diào)，MTB所需能量的70%來自于糖酵解[8]。由此看來，糖酵解對于MTB在宿主體內(nèi)的存活至關(guān)重要。早在1998年Cole等[9]將MTB代表菌株H37Rv進行全基因組測序，結(jié)果表明MTB除了具有脂質(zhì)代謝的酶外，還具有糖酵解、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)、三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)和乙醛酸循環(huán)所需要的酶；而后Titgemeyer等[10]分析H37Rv基因組發(fā)現(xiàn)，MTB具有5種碳水化合物轉(zhuǎn)運蛋白。Sassetti和Rubin[11]發(fā)現(xiàn)碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝相關(guān)基因是MTB在小鼠建立感染的過程中必不可少的基因。這些研究表明，碳水化合物是MTB不可或缺的能量來源，糖代謝在MTB生長與感染中發(fā)揮著重要的作用。

二、MTB中糖的轉(zhuǎn)運與合成

(一)糖轉(zhuǎn)運蛋白

在恥垢分枝桿菌基因組中共評估出28種糖轉(zhuǎn)運蛋白，而在MTB基因組中僅預測出5種，這表明宿主很難為MTB提供富含多種糖類的環(huán)境，也解釋了MTB在僅含有糖類的培養(yǎng)基中生長緩慢的原因。這5種糖轉(zhuǎn)運蛋白分別是UgpABCE、LpqY-SugABC、UspABC、Rv2038c-Rv2041c和SugI，前4種屬于三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)結(jié)合盒式(ATP-binding cassette，ABC)蛋白家族，最后1種屬于主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)蛋白。這些轉(zhuǎn)運蛋白與其他細菌物種的同源性較低，因此并不能清楚地對它們的底物進行預測[10,12]，MTB如何利用轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運碳水化合物仍有待研究。

MTB的ABC糖轉(zhuǎn)運蛋白對于MTB的生理與致病性具有重要作用，可以用于研發(fā)新型抗結(jié)核藥品與疫苗(表1)。MTB UgpABCE轉(zhuǎn)運蛋白與大腸埃希菌的麥芽糖轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)相似，同屬于碳水化合物攝取轉(zhuǎn)運蛋白1亞家族，但是卻不能和大腸埃希菌的UgpB亞基一樣與3-磷酸甘油酯(sn-glycerol-3-phosphate，G3P)特異性結(jié)合，而是與甘油磷酸膽堿結(jié)合，這是因為大腸埃希菌UgpB亞基的169位的色氨酸被證明與G3P結(jié)合必不可少，而MTB UgpB中的169位的色氨酸被205位的亮氨酸取代。此外，MTB UgpB也是雙精氨酸易位途徑的底物，對于病原體的致病性至關(guān)重要[13]。LpqY-SugABC轉(zhuǎn)運蛋白可以高度特異性地識別海藻糖，并且對于MTB在巨噬細胞和小鼠中建立感染至關(guān)重要，當阻斷這種功能時MTB的致病性降低[14]。需要指出的是，海藻糖在哺乳動物中并不存在，并且攝入的海藻糖也會被海藻糖酶分解為葡萄糖，這說明宿主內(nèi)部環(huán)境中的糖類很難進入MTB。UspABC在不同的分枝桿菌物種中是相對保守的，其UspC亞基偏向結(jié)合C2或者C3處帶有氨基的糖，并且該轉(zhuǎn)運系統(tǒng)被證明對于MTB體外生長也是必不可少的[15]。Rv2038c-Rv2041c尚未確定其確切的底物，但是研究發(fā)現(xiàn)Rv2041c可以增強宿主的免疫應答反應，它可以促使巨噬細胞中促炎細胞因子分泌增多，對感染MTB的小鼠及活躍的結(jié)核病患者產(chǎn)生積極的抗體反應，可用于MTB感染的血清學診斷[16]。至于MTB SugI轉(zhuǎn)運蛋白并沒有相關(guān)文獻介紹，科研人員需要繼續(xù)開展相關(guān)研究。

表1 結(jié)核分枝桿菌ABC糖轉(zhuǎn)運蛋白主要發(fā)現(xiàn)

(二)糖異生

糖異生不僅可以將脂質(zhì)或氨基酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖滿足MTB自身的需要，而且還會影響MTB的致病性。糖異生對于MTB致病性的作用最早源于異檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase，ICL)(圖1)的研究，ICL是乙醛酸循環(huán)中重要的限速酶，乙醛酸循環(huán)的產(chǎn)物可以作為糖異生的底物，因此ICL可以促進碳源向糖異生途徑的流動。編碼ICL基因的缺失減弱了MTB在小鼠中的致病性和持久性，這說明糖異生途徑對MTB的致病性和持久性產(chǎn)生了影響[17]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)、1,6-二磷酸果糖醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase，F(xiàn)BA)和磷酸三糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TPI)(圖1)是糖異生和糖酵解中重要的功能酶。其中，編碼PEPCK的基因pckA在MTB感染巨噬細胞和小鼠的過程中均被誘導表達，pckA敲除的MTB突變體不能在小鼠肺中建立和維持感染[18-19]。另外，編碼FBA和TPI基因的缺失會導致MTB在小鼠感染模型中被迅速清除[20-21]。盡管這些研究表明上述3種功能酶對于MTB的致病性具有重要影響，但是由于這些酶具有回補活性，因此并不能完全說明糖異生對于MTB致病性的作用。二磷酸果糖磷酸酯酶(fructose bisphosphatase，F(xiàn)BP)是糖異生中重要的限速酶；MTB中有2種FBP，當這兩個FBP功能缺失時，糖異生途徑被阻斷，MTB在小鼠肺臟中被清除[22]。FBP催化的反應僅單向進行，因此FBP活性的消除只會破壞糖異生，而不會使糖酵解受到干擾，從而直接肯定了糖異生在MTB致病性中的特定作用。

三、MTB糖分解代謝中的功能酶

MTB可以通過多種方式進行糖代謝(圖1)，包括糖酵解途徑、PPP及TCA循環(huán)，在這個過程中有許多重要的限速酶發(fā)揮著不可或缺的作用，這些功能酶可能成為新型抗結(jié)核藥物的理想靶標。

NADPH：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADP+是NADPH的氧化形式；PPGK：多磷酸葡萄糖激酶；GLKA：葡萄糖激酶；PFKA：磷酸果糖激酶A；FBP：二磷酸果糖磷酸酯酶；FBA：1,6-二磷酸果糖醛縮酶；TPI：磷酸三糖異構(gòu)酶；PYK：丙酮酸激酶；PEPCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；ICL：異檸檬酸裂合酶；“+”代表該物質(zhì)對于PYK為正反饋，“-”代表該物質(zhì)對于PYK為負反饋圖1 MTB糖代謝示意圖

(一)葡萄糖激酶

葡萄糖磷酸化是糖酵解的第一個反應，也是極其重要的一個限速步驟。MTB表達兩種功能性葡萄糖激酶，即多磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase， PPGK)與葡萄糖激酶(glucokinase，GLKA)；它們可以將葡萄糖催化生成6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate，G6P)，其中PPGK包含5個葡萄糖結(jié)合位點和2個ATP結(jié)合域，GLKA僅包含3個葡萄糖結(jié)合位點和1個ATP結(jié)合域，這意味著PPGK與GLKA相比可以結(jié)合更多的底物，催化效率也更高，因此PPGK發(fā)揮主要作用。當從MTB基因組中同時敲除編碼PPGK和GLKA的基因后，MTB則無法使用外部葡萄糖作為生長或代謝的底物，令人驚訝的是，該突變體在小鼠肺中喪失了生存能力，不能在慢性感染階段持續(xù)存在，這樣的結(jié)果表明MTB在小鼠中建立MTB慢性感染依賴于葡萄糖磷酸化，MTB的代謝靈活性對其致病機制至關(guān)重要，病原體并不完全依賴宿主脂質(zhì)的代謝[23]。

(二)磷酸果糖激酶

6-磷酸果糖的磷酸化是糖酵解的關(guān)鍵步驟，該步驟可由磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)催化。已知pfkA和pfkB兩個基因編碼PFK，這兩種基因不僅核苷酸序列上具有差異，并且編碼蛋白的功能也有很大不同，PFKA屬于PFK蛋白家族，而PFKB屬于核酸激酶超蛋白家族。僅PFKA 在MTB中發(fā)揮PFK活性[24]，而PFKB屬于休眠生存調(diào)節(jié)子，在缺氧和活化的巨噬細胞中會被上調(diào)表達[25]。研究表明，PFKA和PFKB都不是MTB體外和體內(nèi)生存的必要條件，但是當葡萄糖作為MTB唯一的碳來源時，PFKA對于MTB糖酵解是必不可少的，另外，在缺氧條件下MTB的生存需要PFKA[11,24]。

(三)FBA

FBA催化1,6-二磷酸果糖裂解為磷酸二羥基丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)和G3P。FBA分為Ⅰ類與Ⅱ類，MTB FBA屬于Ⅱ類，需要借助二價金屬陽離子(例如Zn2+)來穩(wěn)定烯醇鹽中間體。在體外標準培養(yǎng)條件下不能分離出編碼FBA基因的轉(zhuǎn)座子突變體，也不能通過同源重組從MTB染色體上刪除編碼FBA的基因[26]，這些研究表明編碼FBA的基因是MTB的必需基因。MTB在含有葡萄糖或糖異生底物的單一碳源培養(yǎng)基中的正常生長需要FBA，這表明FBA是糖酵解和糖異生過程中必不可少的酶。在小鼠感染MTB期間，肺臟中MTB FBA被誘導表達，并且在缺氧期間FBA表達增強，MTB需要FBA活性才能在急性感染以及慢性感染階段維持正常生長。另外，MTB分泌的FBA可以與宿主纖維蛋白溶酶結(jié)合，這表明FBA可能參與宿主與病原體的相互作用[20,26]。

(四)TPI

TPI催化DHAP和G3P的相互轉(zhuǎn)化，該反應對于糖酵解和糖異生是十分重要的。TPI是一種高度保守的酶，MTB TPI與其他細菌具有極高的結(jié)構(gòu)相似性。TPI的活性會受到磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)的調(diào)控，PEP可以競爭性地抑制DHAP和G3P的相互轉(zhuǎn)化，從而導致PPP通量增加，使得MTB在氧化應激的情況下滿足對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的需求，維持正常的生理狀態(tài)[27]。TPI缺失突變體不能在單一的碳底物下存活，但是當糖酵解和糖異生的底物同時存在時會像野生型MTB一樣正常生長。并且通過同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)TPI缺失時TPI底物會不斷積累，這說明不存在其他TPI和代謝旁路反應，這也反映出TPI對MTB糖酵解和糖異生的重要地位。此外，當使用TPI缺失突變體感染小鼠后，TPI缺失菌株迅速在小鼠體內(nèi)消除，小鼠的脾臟和肺臟均無任何病理變化，這說明在小鼠中建立MTB感染需要TPI[21]。

(五)丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PYK)

PYK催化糖酵解最后一步，將PEP轉(zhuǎn)化為丙酮酸進而進入TCA循環(huán)，是碳通量分布的中心轉(zhuǎn)換點。PYK是調(diào)節(jié)糖酵解與糖異生轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵點，可防止二者之間的無效循環(huán)。PYK對于MTB在含有葡萄糖以及短鏈脂肪酸培養(yǎng)基中的生長都是必不可少的，但是在MTB小鼠感染模型中PYK并不是必不可少的[28]。當編碼PYK的基因缺失時，牛分枝桿菌中心代謝發(fā)生顯著變化，蛋白質(zhì)組學的結(jié)果顯示糖異生相關(guān)蛋白下調(diào)，并且脂肪酸分解代謝相關(guān)蛋白上調(diào)，牛分枝桿菌將利用脂肪酸作為能源[29]。在MTB中PYK的活性受到多種代謝產(chǎn)物的影響，糖酵解代謝產(chǎn)物G6P和1,6-二磷酸果糖均可以作為變構(gòu)活化劑激活PYK，而糖酵解代謝產(chǎn)物G3P和PPP產(chǎn)物單磷酸戊糖抑制PYK的活性狀態(tài)，通過PYK精細又復雜的變構(gòu)調(diào)節(jié)機制，促進MTB迅速適應變化的宿主環(huán)境[29-31]。

四、糖代謝是MTB維持穩(wěn)態(tài)的重要機制

MTB在宿主中從最初的肺泡巨噬細胞感染到肉芽腫的發(fā)展，以及肺外擴散的過程中會遇到一系列不同的微環(huán)境，宿主細胞會采取各種措施抵制MTB的生存與繁殖[32-34]。MTB則會不斷地調(diào)整自身基因轉(zhuǎn)錄與表達來應對不斷變化和不利的生存環(huán)境，其中代謝方式的調(diào)整與適應是一種重要的應對方式[35-36]，糖代謝就是一種重要的維穩(wěn)機制。

(一)糖代謝可短期緩解貝達喹啉(bedaquiline，Bdq)的殺菌作用

Bdq：貝達喹啉；ATP：三磷酸腺苷；“+”代表上調(diào)，“-”代表下調(diào)圖2 MTB受到Bdq刺激的相關(guān)反應模式圖

Bdq是ATP合成酶抑制劑，是數(shù)年來首個被批準用于治療耐藥結(jié)核病的藥物，但是在臨床應用中Bdq用藥3～4 d卻沒有明顯的溶菌作用，MTB的這種防御機制與MTB代謝重塑相關(guān)聯(lián)(圖2)。在Bdq的刺激下氧化磷酸化受到限制，MTB迅速做出反應，上調(diào)休眠調(diào)節(jié)因子并且下調(diào)生物合成途徑，最大程度地降低ATP消耗。同時，MTB會增強ATP的生成途徑，蛋白質(zhì)組學的結(jié)果顯示，乙醛酸循環(huán)以及TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶顯著上調(diào)，MTB將碳源通過乙醛酸循環(huán)引至TCA循環(huán)產(chǎn)生能量。此外，當MTB使用不可發(fā)酵的能源(例如脂肪酸)培養(yǎng)時，Bdq誘導的殺菌作用會顯著增強，但是當使用可發(fā)酵能源(例如葡萄糖、甘油)培養(yǎng)時，Bdq誘導的殺菌作用則會減弱，這表明糖酵解途徑對于MTB的存活顯然必不可少。糖酵解產(chǎn)生的ATP足以維持細菌活力數(shù)天，并同時防止殺傷，只是在持續(xù)抑制ATP合成酶后，這種替代途徑顯然是不夠的[37-38]。類似的延遲效應也出現(xiàn)在PA-824、Q203等抗結(jié)核候選藥品中[39-40]，這些藥品直接或間接的靶向了MTB的呼吸鏈，影響了ATP的合成，代謝重塑是否也在其中發(fā)揮作用，這需要科研人員繼續(xù)深入研究。

(二)糖酵解可限制低氧狀態(tài)下有毒代謝產(chǎn)物的積累

在體外低氧的條件下，MTB進入非復制狀態(tài)，此時葡萄糖對于MTB具有毒性作用，當培養(yǎng)基中缺少葡萄糖時，MTB可以在非復制狀態(tài)下維持更久的時間。當糖酵解途徑被阻斷時，葡萄糖對于MTB的毒性作用則會加劇[24]。這可能與糖酵解途徑中積累的有毒代謝中間產(chǎn)物有關(guān)，糖磷酸鹽對菌體有毒并不斷積聚損害細胞的生存能力，有報道稱糖磷酸鹽會降低MTB的細胞活力最終導致細菌死亡[41]。除此以外，糖酵解途徑的阻斷可能影響其他代謝途徑從而降低了細菌的生存能力。總之，維持MTB完整的糖酵解會在一定程度上緩解這些有毒代謝產(chǎn)物的積累，從而適應不利的微環(huán)境。

(三)PPP可緩解低氧環(huán)境對MTB的損傷

為了應對低氧帶來的不利影響，MTB調(diào)整代謝程序，降低糖酵解速率并且增強乙醛酸循環(huán)和糖異生活性，從而克服糖酵解使碳源重新流向PPP[42]。PPP是將葡萄糖直接氧化脫羧產(chǎn)生磷酸戊糖和NADPH的代謝方式，在這個過程中，磷酸戊糖和G6P利用構(gòu)象動力學中的差異精細地調(diào)節(jié)PYK的活性，降低通過PYK的碳通量，減少碳逆流至TCA循環(huán)以二氧化碳的形式散失[30,43]。PPP中間產(chǎn)物可以為核苷酸、芳香族氨基酸等多種物質(zhì)提供原料，這些產(chǎn)物的積累是預期代謝調(diào)節(jié)反應的結(jié)果，是MTB重新進入細胞周期所必需的[42,44]。另一方面，低氧會導致MTB內(nèi)部自由基(reactive oxygen species，ROS)代謝紊亂，對機體造成損傷；而PPP產(chǎn)生大量的NADPH，它以其強大的還原能力迅速清除ROS，實現(xiàn)氧化還原平衡，并且修復ROS造成的損傷[45]。總之，PPP可有效緩解低氧環(huán)境給MTB造成的損傷，并且為重新進行復制狀態(tài)做好準備。

五、展望

MTB的代謝網(wǎng)絡可以有效地對多種碳底物同時進行分解代謝[5]，通過不斷地自我調(diào)節(jié)以適應不斷變化的微環(huán)境，實現(xiàn)MTB最佳生長狀態(tài)。代謝的多功能性已經(jīng)日益被認為是一種重要的致病機制，如何在多變的環(huán)境下建立和維持慢性感染決定了MTB的致病性[46]。 MTB完整的糖代謝途徑對于維持MTB穩(wěn)態(tài)起著重要作用，對于這其中某一環(huán)節(jié)進行干預，可能會成為預防或治療結(jié)核病的有效途徑，為抗結(jié)核藥物的研發(fā)帶來了新的靶點。目前國內(nèi)外對MTB進行糖代謝的研究仍然較少，這需要我們不斷的關(guān)注與探索。