腫瘤干細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌放療效果機(jī)制的研究進(jìn)展

何環(huán)宇 姜笑 張琨明 楊育坤 王茂 李懿

近年來，由于環(huán)境和飲食等各種原因?qū)е碌陌┌Y病例逐漸增多，同時因癌癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)也逐年增加。據(jù)中國國家癌癥中心統(tǒng)計，2015年全國新增癌癥病例392.9萬例，癌癥死亡病例233.8萬例，肺癌已成為癌癥相關(guān)死亡的最主要原因[1]。根據(jù)病理特征可將肺癌分為兩大類：小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC），NSCLC約占所有肺癌患者的80﹪[2]。NSCLC 臨床治療的主要障礙之一是多數(shù)患者明確診斷時已為晚期，因此錯過手術(shù)干預(yù)的最佳時機(jī)，而放療則成為不可切除NSCLC的重要治療方法[3]。但仍有20﹪患者因療效不佳導(dǎo)致復(fù)發(fā)甚至死亡[4]。近幾年，腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）理論已被廣泛接受，由于CSC具備自我更新和無限增殖的能力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無法被完全根除，因此易造成腫瘤的殘留與復(fù)發(fā)[5]。CSC在NSCLC放療療效中也起著重要作用，由于NSCLC中CSC的存在，可能通過如DNA 損傷修復(fù)，細(xì)胞保護(hù)性自噬等途徑降低放射療法的療效導(dǎo)致預(yù)后不良。因此了解CSC 在腫瘤生物進(jìn)程中參與放療抵抗的機(jī)制有望為提高NSCLC放射治療療效提供新的依據(jù)。

一、CSC的起源和NSCLC中CSC的分離與鑒定

目前對CSC的起源尚有不同的觀點，大致分為以下3種理論：（1）CSC起源于正常干細(xì)胞，該理論是基于如下假設(shè)：成熟細(xì)胞的有限壽命不足以積累發(fā)生致癌轉(zhuǎn)化所必須的多重突變，而由于干細(xì)胞存活的時間足夠長，可以獲得形成惡性表型所必須的突變序列，利用已有的干細(xì)胞調(diào)控途徑轉(zhuǎn)化為CSC，以促進(jìn)其自我更新[6]。正常干細(xì)胞中增殖過程受到嚴(yán)格調(diào)控，這些信號維持組織的穩(wěn)態(tài)和再生，然而這樣的調(diào)控平衡在CSC中轉(zhuǎn)變成了由其自主調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖和分化信號；（2）CSC是由前體細(xì)胞發(fā)展而來。在組織中，祖細(xì)胞的數(shù)量比干細(xì)胞更豐富，這使得癌基因轉(zhuǎn)化的可能性更大。祖細(xì)胞還具有少部分的自我更新能力[7]；（3）CSC是由分化細(xì)胞去分化而來。在這個理論中，致癌突變驅(qū)動去分化過程以及隨后細(xì)胞的自我更新，意味著CSC可以從腫瘤細(xì)胞池內(nèi)發(fā)展，并逐漸到達(dá)腫瘤細(xì)胞層次的頂端[8]。這一過程與分化的細(xì)胞產(chǎn)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相關(guān)，EMT可導(dǎo)致干細(xì)胞樣表型的獲得和CSC的形成。

針對NSCLC，不同的研究報道了通過一些表面標(biāo)記和分選技術(shù)從細(xì)胞系或新鮮腫瘤材料中分離出CSC。有研究者使用從臨床患者手術(shù)后獲得的NSCLC組織標(biāo)本中分離得到的單個腫瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實驗，觀察到部分醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）高表達(dá)的肺癌細(xì)胞具有克隆形成能力，因此間接證明了NSCLC組織中可能存在CSC 并且可以借助特定表面標(biāo)記進(jìn)行分離及鑒定[9]。Wang等[10]也報道了多個研究中利用CD133 等CSC 標(biāo)記物分離鑒定得到肺癌細(xì)胞系中的CSC，并觀察到肺癌患者不同細(xì)胞間的CD133 及ALDH活性與肺癌相關(guān)。另有多項研究也分別從SCLC和NSCLC細(xì)胞中分離得到人肺CD133+的CSC，并證明可以在特定條件下體外擴(kuò)增為腫瘤球[11-12]。Xie等[13]也通過流式細(xì)胞分選等方法在人肺癌A549細(xì)胞株中分離鑒定出約1.09﹪為側(cè)群細(xì)胞（side population，SP），與非SP細(xì)胞相比，其在體內(nèi)具有更高的侵襲性和致瘤性及治療抗性。Bagheri 等[14]研究還表明通過添加化療藥物篩選的方式也可以分離得到NSCLC 中的CSC，這些細(xì)胞表現(xiàn)出一些CSC 特征，如高克隆活性、SP細(xì)胞富集、干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)、自我更新能力、高致瘤性和分化后代的產(chǎn)生。因此更好地了解NSCLC 中所含的CSC 在肺癌中發(fā)揮的作用并確定可靠的標(biāo)記物來分離肺癌中的CSC 對提高肺癌療效有重要的意義。

二、NSCLC中CSC的免疫表型

由于CSC 只占整個腫瘤細(xì)胞群的一小部分，因此需要特異性的標(biāo)志物來將其與普通腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞區(qū)別開來。

（一）NSCLC中CSC相關(guān)的免疫表型

1.CD133：CD133是最常見的CSC 免疫表型，是一種細(xì)胞表面5個跨膜結(jié)構(gòu)域和2個大的糖基化細(xì)胞外環(huán)構(gòu)成的細(xì)胞表面糖蛋白，此前的研究已證明CD133 與NSCLC的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性[15]。有研究者測試了大量肺癌患者的干細(xì)胞標(biāo)記物，試圖驗證CD133+細(xì)胞具有CSC的特性，發(fā)現(xiàn)與SCLC 相比，CD133 在NSCLC 中的表達(dá)水平更高，且具有更高的自我更新能力、成瘤性和耐藥性等特征，同時CD133表達(dá)水平與NSCLC的臨床病理分期及不良預(yù)后密切相關(guān)[16]。CD133+肺癌細(xì)胞株H1650 中具有CSC 特性，這表明CD133可能是肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物[17]。就這一標(biāo)記物的潛在意義而言，高CD133表達(dá)與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)[18-19]。

2.ALDH：ALDH 由一組酶組成，可控制正常干細(xì)胞的分化，并在不同類型腫瘤對放化療耐受的細(xì)胞亞群中高度表達(dá)[20]。ALDH1是一種胞質(zhì)同工酶，是ALDH家族的一員，有研究表明高表達(dá)ALDH1的NSCLC細(xì)胞較對照組具有更強(qiáng)的致瘤性和克隆性[21]。ALDH1A1+的CSC 對化療藥物和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）等肺癌治療的常用藥表現(xiàn)出耐藥性[22]。另外有研究表明CD133 高表達(dá)與ALDH的聯(lián)合作用，可能與NSCLC的治療抗性及不良預(yù)后有關(guān)[23]。此外，在對大量NSCLC患者CSC 標(biāo)記物的評估中，CD133和ALDH1的共同高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[16]。因此，檢測患者CD133和ALDH的表達(dá)水平有可能成為評價NSCLC的預(yù)后指標(biāo)。

（二）常見的CSC相關(guān)免疫表型

1.Nanog：已有研究證明Nanog 基因在胚胎干細(xì)胞自我更新過程中起著關(guān)鍵作用[24-25]。它在CSC中亦發(fā)揮類似的作用，由于其作用與CSC的這一關(guān)鍵表型特征直接相關(guān)，因此被用作肺癌CSC的標(biāo)志物[26-27]。Nanog的過度表達(dá)與肺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，有研究已表明Nr5a2通過上調(diào)Nanog 轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)肺CSC 特性并促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展，提示其可作為肺癌的預(yù)后指標(biāo)[28]。另一項對72例不同治療敏感性的肺腺癌組織標(biāo)本的相關(guān)表面標(biāo)記物檢測中，也驗證了耐藥組的Nanog表達(dá)水平高于治療敏感組，因此推測肺癌治療中部分患者的后期耐藥性增加與CSC 標(biāo)記物Nanog等的表達(dá)增加呈正相關(guān)[29]。盡管已有部分研究對Nanog 與肺癌的相互關(guān)系做了探討，但Nanog 與肺CSC 之間的關(guān)系仍有待更深入研究，以探討Nanog是否有助于開發(fā)新的肺癌治療策略。

2.SP細(xì)胞：SP細(xì)胞指能夠排除Hoetsch 33242 染料的細(xì)胞群，其特征是具有自我更新、分化增殖、致瘤性和侵襲性以及表達(dá)CSC 標(biāo)記和干細(xì)胞基因能力的細(xì)胞亞群[30]。肺癌SP細(xì)胞ABCG2表達(dá)增加，ABCG2 與SP細(xì)胞中Hoetsch 33242染料熒光信號的低存留率有密切的關(guān)系，同時表明肺癌SP細(xì)胞的百分比增加可能與肺癌的治療敏感性有關(guān)[31]。這也被認(rèn)為是分離CSC的有效標(biāo)志物之一。

Nanog、SP細(xì)胞盡管未發(fā)現(xiàn)與NSCLC相關(guān)，但仍有充分證據(jù)表明其與肺癌相關(guān)治療效果有明顯相關(guān)性。

三、NSCLC中CSC影響放療效果的機(jī)制

放療是腫瘤治療的重要手段之一，主要通過直接或間接造成DNA 損傷來發(fā)揮作用[32]，然后與大分子相互作用，導(dǎo)致DNA 損傷修復(fù)機(jī)制活化以及檢查點的誘導(dǎo)以促進(jìn)DNA 損傷修復(fù)[33]，若DNA 損傷無法修復(fù)，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[34]。而CSC 相較于普通腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗放療抵抗能力，導(dǎo)致許多腫瘤患者對放療耐受以及腫瘤復(fù)發(fā)，因此正確認(rèn)識CSC 對放療敏感性是何種關(guān)系對改進(jìn)現(xiàn)有放療方案及改良腫瘤患者預(yù)后有重要意義。

1.DNA 損傷修復(fù)和細(xì)胞增殖與凋亡：腫瘤的放療抵抗主要是通過增強(qiáng)DNA 損傷修復(fù)能力來實現(xiàn)，有研究發(fā)現(xiàn)，ERK5可能會觸發(fā)放療誘導(dǎo)的細(xì)胞周期檢查點激酶1（checkpoint kinase 1，Chk1）介導(dǎo)的DNA 雙鏈斷裂及細(xì)胞周期G2/M 阻滯有關(guān)，在敲減ERK5 基因后，肺癌A549細(xì)胞對放療敏感性受到明顯抑制，產(chǎn)生更強(qiáng)的凋亡反應(yīng)，存活率明顯下降[35]。Chen等[36]研究也證明NSCLC中Rad51c高表達(dá)的細(xì)胞表達(dá)CSC 特性，Rad51c可通過破壞放療誘導(dǎo)的DNA 損傷來提高對放療的殺傷抗性。類似的研究也證實Rad51和Exo1 介導(dǎo)的CD133 上調(diào)增加了DNA 雙鏈斷裂的修復(fù)能力，提高了CSC 樣NSCLC細(xì)胞的放療抗性[37]。針對NSCLC的研究也證實，CD133+CSC細(xì)胞在放射后富集，放射后存活率高于CD133-細(xì)胞，CD133+細(xì)胞內(nèi)IL-6水平與CSC 免受細(xì)胞經(jīng)放射誘導(dǎo)的DNA 損傷及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[38]。由于電離輻射對快速分裂和增殖的癌細(xì)胞有更好的殺傷效果，既往研究表明CSC的增殖速度比腫瘤細(xì)胞更慢，細(xì)胞周期中處于靜止或休眠的細(xì)胞可能因未受損傷而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，在使用Chk1作為放療增敏劑后可消除有放射引起的G2期阻滯，有效增加CSC 對放療的敏感性[39]。另有研究證實了休眠細(xì)胞的主要特征：它們既不死亡也不增殖，而在靜止一定時間后，開始增殖并顯示出更強(qiáng)的克隆能力[40]。在接受放射治療的患者中，CSC 休眠可能持續(xù)數(shù)年乃至數(shù)十年，這些靜止細(xì)胞的增殖可以通過微環(huán)境的改變等來啟動[41]。有研究發(fā)現(xiàn)休眠的肺癌細(xì)胞對EGFR 酪氨酸激酶抑制劑具有治療抗性，敲減MIG6表達(dá)可以中止細(xì)胞休眠并增加肺癌細(xì)胞對治療敏感性增高[42]。而在NSCLC中Chk1的激活抑制可以消除CSC細(xì)胞周期的增殖停滯，有效提高NSCLC的治療敏感性，大大降低NSCLC細(xì)胞存活率[43]。此外細(xì)胞內(nèi)較低的ROS 濃度可能在CSC中充當(dāng)信使，并可能參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[44]。還有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-198可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移并誘導(dǎo)凋亡[45]。因此，進(jìn)一步了解DNA損傷修復(fù)的機(jī)制及其與放療后CSC增殖與凋亡的關(guān)系，有助于更有效地消除CSC提高放療療效。

2.自噬改變：自噬是一種受到精確調(diào)控的進(jìn)化上保守的過程，通過溶酶體可以在很短時間內(nèi)實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)容物的大批量降解，使得細(xì)胞可以在應(yīng)激情況下存活，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。許多在NSCLC的治療中常用的藥物已被證明是通過誘導(dǎo)自噬以達(dá)到治療效果[46]。細(xì)胞自噬水平升高，自噬相關(guān)蛋白如微管相關(guān)蛋白輕鏈3、自噬相關(guān)基因12 等表達(dá)增高，而人為抑制自噬水平可以降低細(xì)胞經(jīng)歷放療后的存活率[47]。放療是治療肺癌的重要手段之一，雖然多數(shù)肺癌細(xì)胞對放療敏感，但肺CSC的存在仍可通過腫瘤細(xì)胞自噬水平升高來介導(dǎo)NSCLC 對放療敏感性降低。在既往的研究中已有提示經(jīng)放療誘導(dǎo)的A549 及H460細(xì)胞中自噬水平增加導(dǎo)致對放射線不敏感[48]。有研究表明由miR-191 水平下調(diào)介導(dǎo)的自噬活性上升促進(jìn)了兩種NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549 及H1299的放療抗性[49]。另有研究發(fā)現(xiàn)，對肺癌細(xì)胞H1299 使用自噬抑制劑降低細(xì)胞自噬水平后，明顯增強(qiáng)了放射線對H1299細(xì)胞的殺傷效果[50]。Wen 等[51]研究也表明ATG16L2 可能是NSCLC患者放療后評價預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。Chen 等[52]研究發(fā)現(xiàn)肺癌A549細(xì)胞中自噬水平的抑制導(dǎo)致Nrf2和Ho-1的表達(dá)下調(diào)，增加了放療的敏感性。因此自噬水平與腫瘤的放療敏感性呈負(fù)相關(guān)。

3.缺氧微環(huán)境：CSC 放療抵抗的另一種機(jī)制是缺氧，氧氣是一種有效的放療增敏劑，是輻射誘導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡所必需的因素。眾所周知缺氧會增加腫瘤對放療的抵抗力，并且與放療抵抗及放療后早期復(fù)發(fā)有關(guān)[53]。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是缺氧介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子，可以激活如Notch，Hedgehog 等途徑[54]。缺氧會導(dǎo)致HIF信號傳導(dǎo)途徑的激活[55]。近年來已有研究表明HIF-1α參與肺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，且與NSCLC細(xì)胞的順鉑耐藥性有關(guān)[56]。既往的文獻(xiàn)也證明HIF-1α通路在缺氧應(yīng)激時可通過上調(diào)谷氨酸脫氫酶的表達(dá)來增加ATP的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的耐藥性[57]。He 等[58]對比NSCLC患者血漿中HIF-1α水平發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)HIF-1α水平與NSCLC患者的生存率呈負(fù)相關(guān)。該現(xiàn)象的原因可能是高HIF-1α蛋白表達(dá)的腫瘤組織發(fā)生組織壞死，導(dǎo)致大量肺癌組織中的HIF-1α進(jìn)入患者血液，抑或是由于NSCLC中CSC相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致[59-60]。阻斷HIF-1α可緩解低氧誘導(dǎo)的NSCLC浸潤及治療抵抗[61]。同時也有研究證實HIF-1介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞的耐藥性可以通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激形成對抗，以增加NSCLC中CSC樣細(xì)胞的治療敏感性[56]。Yu 等[62]發(fā)現(xiàn)利用在異種小鼠模型上利用CoCl2誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞缺氧微環(huán)境可以介導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)增加肺癌細(xì)胞干性及治療抗性。因此可推測肺癌進(jìn)程中CSC是通過這些途徑維持對放療的抵抗性。

綜上所述，CSC作為NSCLC 放射治療過程中影響療效的關(guān)鍵因素，通過增加DNA 損傷修復(fù)、改變細(xì)胞增殖速度、增強(qiáng)抗凋亡能力、自噬水平等途徑增加放療抵抗性，減少細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)以及預(yù)后不良，而新技術(shù)的出現(xiàn)也使得鑒別和分離CSC的可能性不斷增加，為腫瘤的放射治療提供了新的思路，但目前仍有許多尚未解決的問題，深入加強(qiáng)對CSC的了解和認(rèn)識，提高CSC的放療敏感性，是需要進(jìn)一步研究的方向，以便為NSCLC 放射治療提供更好的方案。