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    miR-363-3p靶向TWIST1調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制非小細胞肺癌A549細胞遷移和侵襲

    2020-07-30 11:07:58
    關(guān)鍵詞:肺癌實驗

    越來越多的研究表明,抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進程是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制,而微小RNA(microRNA,miRNA)在此過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1-3]。miR-363-3p是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的miRNA,在結(jié)直腸癌、胃癌和甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤組織中表達下調(diào),上調(diào)其表達可抑制癌細胞的遷移和侵襲[4-6]。有學者指出,miR-363-3p 在非小細胞肺癌中異常低表達,且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),但其在癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用并不明確[7]。采用生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn),miR-363-3p 與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TWIST13'UTR存在互補的核苷酸序列,可能通過靶向TWIST1調(diào)控EMT進程影響非小細胞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移。本研究以非小細胞肺癌A549細胞為研究對象,通過觀察miR-363-3p和TWIST1的關(guān)系,旨在闡明miR-363-3p 在非小細胞肺癌EMT進程和癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用,為改善和治療非小細胞肺癌提供新的線索。

    材料與方法

    一、材料

    人非小細胞肺癌A549細胞(中國科學院上海生命科學研究院);胎牛血清(貨號2104,杭州四季青公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號C22400500BT,美國Gibco公司);胰蛋白酶(貨號T0458,上海生工生物公司);β-actin抗體(貨號ET1702-52,華安生物公司);TWIST1抗體(貨號T6454MSDS,美國Sigma公司),Vimentin抗體(貨號5741)、E-cadherin抗體(貨號3195,美國Cell Signaling Technology公司);辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠/兔二抗(貨號926-32221,美國Li-Cor公司);LipofectamineTM2000(貨號11668-027,美國Introvgen公司);Matrigel基質(zhì)(貨號356237,美國BD公司);Transwell板(美國Corning公司);PVDF膜(美國Bio-Rad公司);miR-363-3p模擬物、miR-363-3p抑制劑及相應(yīng)的陰性對照(上海GenePharma公司);pcDNA3.1-TWIST1 過表達質(zhì)粒和pcDNA3.1 空載體質(zhì)粒(長沙贏潤生物技術(shù)公司);Dual-luciferase檢測試劑盒說明書(美國Promega公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(中國Beyotime公司)。

    二、方法

    1.細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染:人非小細胞肺癌A549細胞購于中國科學院上海生命科學研究院。采用含100 ml/L胎牛血的RPMI-1640培養(yǎng)基于5﹪CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為:空白對照組(細胞未做任何處理);模擬物對照組(轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物陰性對照);模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物);每組設(shè)置3個平行孔。轉(zhuǎn)染前24 h,將長勢良好的對數(shù)生長期A549細胞按照每孔6×105個細胞平鋪于6孔細胞板上,于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。嚴格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟按照實驗分組將50 μmol/L的miRNA試劑轉(zhuǎn)染至A549細胞中。待轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組A549細胞進行實驗。后期實驗另設(shè):模擬物+pcDNA組(轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物和pcDNA3.1 空載體質(zhì)粒)、模擬物+TWIST1組(轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物和pcDNA3.1-TWIST1過表達質(zhì)粒),每組設(shè)置3個平行孔。以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染后,收集各組細胞,采用進行 Western blot和Transwell 小室實驗分別檢測TWIST1過表達對miR-363-3p 高表達的A549細胞EMT、遷移和侵襲的影響。

    2.RT-PCR檢測miR-363-3p和TWIST1mRNA的表達:以Trizol 法提取待測A549細胞的總RNA后,采用Nanodrop 2000分析總RNA純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄,并將所得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板,U6或β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增,miR-363-3p和TWIST1mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT法進行計算。其中,由北京Tiangen Biotech公司合成的miR-363-3p、U6、TWIST1、β-actin 引物序列見表1。實驗重復3次。

    3.Western blot檢測TWIST1和EMT相關(guān)蛋白Vimentin、E-cadherin的表達:向待測的A549細胞中加入裂解液裂解細胞獲取總蛋白,并采用Bradford法對總蛋白定量。將其與上樣緩沖液混合均勻后,置于沸水浴中煮沸3~5 min。按照每孔60 μg蛋白樣品上樣行SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)至PVDF膜后,以含有50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉1.5 h。加入1:500 稀釋的一抗工作液4℃下結(jié)合反應(yīng)24 h。次日經(jīng)TBST溶液洗膜后,置于1:2 000稀釋的二抗工作液中常溫反應(yīng)1 h。顯影后,采用Image 軟件分析目的蛋白的相對表達水平。目的蛋白的相對表達水平=目的條帶灰度值/內(nèi)參β-actin條帶灰度值。實驗重復3次。

    4.Transwell 小室實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力:侵襲實驗:(1)將以培養(yǎng)液稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠按照每孔80 μL 平鋪于Transwell 小室的上室,37℃下充分融合備用;(2)取24孔細胞板加入600 μL 含10﹪胎牛血清的培養(yǎng)基,放上Transwell小室,并于上室內(nèi)加入細胞懸液200 μL(細胞數(shù)為4×103個);(3)放入培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h;(4)將Transwell小室取出,采用4﹪多聚甲醛對轉(zhuǎn)移并附著在上室下表面的細胞固定10~15 min,并以1 g/L結(jié)晶紫染色10~20 min;(5)洗去染色液后,風干并以顯微鏡進行觀察。結(jié)果以隨機選取的6個高視野視野中細胞數(shù)的均值表示。遷移實驗:同侵襲實驗步驟相似,無需進行第1步。實驗重復3次。

    5.miR-363-3p和TWIST1靶向關(guān)系的驗證:轉(zhuǎn)染前24 h,將長勢良好的對數(shù)生長期A549細胞以105個/孔的密度接種至12孔細胞板上,待細胞生長至70﹪融合度時,參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟將百奧邁科生物技術(shù)有限公司構(gòu)建的野生型(TWIST1-WT)和突變型(TWIST1-MUT)的TWIST13'-UTR 雙熒光報告質(zhì)粒分別與miR-363-3p模擬物/抑制劑和相應(yīng)陰性對照共轉(zhuǎn)染至A549細胞中。每組設(shè)置3個平行孔。轉(zhuǎn)染48 h后,參照Dual-luciferase檢測試劑盒說明書檢測各組細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

    三、統(tǒng)計學分析方法

    采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,A549細胞中miR-363-3p、TWIST1、Vimentin和E-cadherin表達水平、熒光素酶活性、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)以表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    一、轉(zhuǎn)染后A549細胞中miR-363-3p表達升高而TWIST1表達降低

    與空白對照組和模擬物對照組比較,模擬物組A549細胞中miR-363-3p表達水平升高,TWIST1mRNA和蛋白的表達水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05);而空白對照組和模擬物對照組之間的miR-363-3p表達水平、TWIST1mRNA和蛋白的表達水平之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。(圖1、表2)

    圖1 Western blot檢測TWIST1蛋白的表達

    表2 模擬物干預后A549細胞中miR-363-3p 及TWIST1 mRNA和蛋白表達水平(±s,n = 3)

    表2 模擬物干預后A549細胞中miR-363-3p 及TWIST1 mRNA和蛋白表達水平(±s,n = 3)

    注:與空白對照組比較,aP <0.001;與模擬物對照組比較,bP <0.001;n為實驗重復次數(shù)

    分組 miR-363-3p表達量TWIST1 mRNA表達量TWIST1蛋白表達量空白對照組 1.00±0.08 1.00±0.06 0.81±0.05模擬物對照組 0.97±0.05 0.98±0.06 0.78±0.06模擬物組 3.82±0.45ab 0.39±0.02ab 0.42±0.02ab F值 114.067 142.223 65.215 P值<0.001<0.001<0.001

    二、TWIST1是miR-363-3p潛在的靶基因

    采用TargetScan 軟件預測發(fā)現(xiàn),TWIST13' UTR區(qū)域有能夠與miR-363-3p 互補結(jié)合的核苷酸序列(圖2)。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn),與模擬物對照組比較,模擬物組TWIST1-WT活性(1.00±0.10 比0.42±0.04)降低(t= 9.327,P= 0.001),與抑制劑對照組比較,抑制劑組TWIST1-WT活性(1.08±0.07比2.96±0.30)增高(t= 10.570,P<0.001)。(圖3)

    圖2 TWIST1 3' UTR 與miR-363-3p的結(jié)合位點

    圖3 模擬物及抑制劑干預細胞后雙熒光素酶相對活性

    三、miR-363-3p過表達抑制A549細胞EMT進程

    Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與空白對照組和模擬物對照組比較,模擬物組A549細胞Vimentin蛋白表達水平降低,E-cadherin蛋白的表達水平增高,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05);與空白對照組比較,模擬物對照組Vimentin和E-cadherin蛋白表達水平之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05);與模擬物對照組比較,模擬物組A549細胞Vimentin蛋白表達水平降低,E-cadherin蛋白的表達水平增高,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。(圖4、表3)

    圖4 Western blot檢測Vimentin和E-cadherin蛋白的表達

    表3 miR-363-3p過表達對A549細胞中Vimentin和E-cadherin蛋白的相對表達水平(±s,n = 3)

    表3 miR-363-3p過表達對A549細胞中Vimentin和E-cadherin蛋白的相對表達水平(±s,n = 3)

    注:與空白對照組比較,aP <0.001;與模擬物對照組比較,bP <0.001;n為實驗重復次數(shù)

    分組 Vimentin蛋白表達量 E-cadherin蛋白表達量空白對照組 0.58±0.04 0.22±0.02模擬物對照組 0.55±0.05 0.25±0.03模擬物組 0.36±0.03ab 0.47±0.03ab F值 25.620 76.227 P值 0.001<0.001

    四、miR-363-3p過表達抑制A549細胞遷移和侵襲

    Transwell 實驗發(fā)現(xiàn),與空白對照組和模擬物對照組比較,模擬物組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05);與空白對照組比較,模擬物對照組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P均> 0.05);與模擬物對照組比較,模擬物組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。(表4、圖5)

    表4 miR-363-3p過表達對A549細胞侵襲和遷移的影響(±s,n = 3)

    表4 miR-363-3p過表達對A549細胞侵襲和遷移的影響(±s,n = 3)

    注:與空白對照組比較,aP <0.001;與模擬物對照組比較,bP <0.001;n為實驗重復次數(shù)

    分組遷移細胞數(shù)(個)侵襲細胞數(shù)(個)空白對照組 85.75±5.45 128.26±6.15模擬物對照組 83.52±6.85 125.95±8.05模擬物組 53.05±4.50ab 71.64±5.75ab F值 30.990 68.106 P值<0.001<0.001

    五、TWIST1逆轉(zhuǎn)miR-363-3p過表達對A549細胞EMT、遷移和侵襲的抑制作用

    與模擬物+pcDNA3.1組比較,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TWIST1過表達質(zhì)粒后,miR-363-3p過表達的A549細胞中Vimentin蛋白的表達水平升高,而E-cadherin蛋白表達水平降低,A549細胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)增加(P均<0.05)。(圖6~圖7和表5)

    討 論

    表5 TWIST1 對miR-363-3p過表達的A549細胞EMT、遷移和侵襲的影響(±s,n = 3)

    表5 TWIST1 對miR-363-3p過表達的A549細胞EMT、遷移和侵襲的影響(±s,n = 3)

    分組 Vimentin蛋白表達量 E-cadherin蛋白表達量遷移細胞數(shù)(個)侵襲細胞數(shù)(個)模擬物+pcDNA3.1組 0.32±0.02 0.56±0.04 49.45±4.22 72.45±5.73模擬物+TWIST1組 0.42±0.03 0.38±0.03 67.52±5.05 108.35±6.56 t 值 4.804 6.235 4.756 7.139 P值 0.009 0.003 0.009 0.002

    圖7 Western blot檢測Vimentin和E-cadherin蛋白表達

    EMT是賦予腫瘤細胞遷移和侵襲能力的生物學過程,被認為是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的主因。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)越來越多的miRNA 如miR-330、miR-4472和miR-194-5p 等在調(diào)控EMT過程中發(fā)揮著重要作用[8-10]。miR-363-3p是一個值得關(guān)注的miRNA,被認為具有潛在的抑瘤作用。miR-363-3p 高表達被認為是宮頸腺癌預后良好的重要預測指標[11];腎癌中miR-363-3p表達缺失時可使致癌基因CREB1過表達,而引入miR-363-3p可通過下調(diào)CREB1表達抑制腫瘤細胞的增殖、遷移[12]。另外,有學者指出,miR-363-3p 在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中經(jīng)常下調(diào),而下調(diào)miR-363-3p表達可通過靶向Sox4誘導EMT進程,促進癌細胞的遷移和侵襲[4]。

    本研究采用TargetScan 軟件預測發(fā)現(xiàn),TWIST13' UTR區(qū)域有能夠與miR-363-3p 互補結(jié)合的核苷酸序列,并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測證實TWIST1是miR-363-3p的潛在靶基因。TWIST1是一種可誘導腫瘤EMT 過程的核轉(zhuǎn)錄因子,與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[13]。TWIST1在非小細胞肺癌組織中高表達,在癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進作用;另外減少TWIST1表達可通過抑制EMT 間質(zhì)蛋白N-cadherin表達抑制癌細胞侵襲[14-16]。有研究指出,miR-363-3p 在非小細胞肺癌組織中異常低表達,且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),可通過靶向PCNA抑制癌細胞增殖并誘導細胞凋亡,但其是否通過靶向TWIST1調(diào)控EMT進程進而影響非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移[7,17]。

    E-cadherin表達減少和Vimentin表達增多常被認為是發(fā)生EMT的重要標志[18-20]。有研究指出,E-cadherin 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌組織中表達降低,而Vimentin 則相反,EMT 可能在非小細胞肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[21]。通過構(gòu)建miR-363-3p過表達的非小細胞肺癌A549細胞株,本研究發(fā)現(xiàn)miR-363-3p過表達可引起TWIST1和Vimentin表達降低,而E-cadherin表達升高,抑制EMT進程;同時,miR-363-3p過表達可明顯減弱A549細胞的遷移和侵襲能力。此外,TWIST1過表達后,miR-363-3p 對A549細胞EMT、遷移和侵襲的抑制作用得以逆轉(zhuǎn)。提示,miR-363-3p 可通過靶向TWIST1調(diào)控EMT抑制A549細胞的遷移和侵襲。根據(jù)相關(guān)文獻報道,TWIST1 基因可能通過抑制Ecadherin蛋白表達,上調(diào)Vimentin蛋白表達促進了EMT,進而增強腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力[22-23]。然而其可能的機制有待于進一步研究。

    綜上所述,miR-363-3p 在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中具有抑制癌細胞遷移和侵襲的作用,而靶向TWIST1抑制EMT進程是其重要的機制之一。然而,非小細胞肺癌惡性轉(zhuǎn)移的分子機制十分復雜,如何更全面的闡明miR-363-3p 在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用還有待深入研究。

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