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    miR-363-3p靶向TWIST1調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲

    2020-07-30 11:07:58
    關(guān)鍵詞:肺癌實(shí)驗(yàn)

    越來越多的研究表明,抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進(jìn)程是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制,而微小RNA(microRNA,miRNA)在此過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1-3]。miR-363-3p是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的miRNA,在結(jié)直腸癌、胃癌和甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4-6]。有學(xué)者指出,miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌中異常低表達(dá),且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),但其在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用并不明確[7]。采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-363-3p 與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TWIST13'UTR存在互補(bǔ)的核苷酸序列,可能通過靶向TWIST1調(diào)控EMT進(jìn)程影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究以非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為研究對象,通過觀察miR-363-3p和TWIST1的關(guān)系,旨在闡明miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌EMT進(jìn)程和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用,為改善和治療非小細(xì)胞肺癌提供新的線索。

    材料與方法

    一、材料

    人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院);胎牛血清(貨號2104,杭州四季青公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號C22400500BT,美國Gibco公司);胰蛋白酶(貨號T0458,上海生工生物公司);β-actin抗體(貨號ET1702-52,華安生物公司);TWIST1抗體(貨號T6454MSDS,美國Sigma公司),Vimentin抗體(貨號5741)、E-cadherin抗體(貨號3195,美國Cell Signaling Technology公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗(貨號926-32221,美國Li-Cor公司);LipofectamineTM2000(貨號11668-027,美國Introvgen公司);Matrigel基質(zhì)(貨號356237,美國BD公司);Transwell板(美國Corning公司);PVDF膜(美國Bio-Rad公司);miR-363-3p模擬物、miR-363-3p抑制劑及相應(yīng)的陰性對照(上海GenePharma公司);pcDNA3.1-TWIST1 過表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1 空載體質(zhì)粒(長沙贏潤生物技術(shù)公司);Dual-luciferase檢測試劑盒說明書(美國Promega公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(中國Beyotime公司)。

    二、方法

    1.細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染:人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。采用含100 ml/L胎牛血的RPMI-1640培養(yǎng)基于5﹪CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為:空白對照組(細(xì)胞未做任何處理);模擬物對照組(轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物陰性對照);模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物);每組設(shè)置3個(gè)平行孔。轉(zhuǎn)染前24 h,將長勢良好的對數(shù)生長期A549細(xì)胞按照每孔6×105個(gè)細(xì)胞平鋪于6孔細(xì)胞板上,于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟按照實(shí)驗(yàn)分組將50 μmol/L的miRNA試劑轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。待轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組A549細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。后期實(shí)驗(yàn)另設(shè):模擬物+pcDNA組(轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物和pcDNA3.1 空載體質(zhì)粒)、模擬物+TWIST1組(轉(zhuǎn)染miR-363-3p模擬物和pcDNA3.1-TWIST1過表達(dá)質(zhì)粒),每組設(shè)置3個(gè)平行孔。以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染后,收集各組細(xì)胞,采用進(jìn)行 Western blot和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)分別檢測TWIST1過表達(dá)對miR-363-3p 高表達(dá)的A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的影響。

    2.RT-PCR檢測miR-363-3p和TWIST1mRNA的表達(dá):以Trizol 法提取待測A549細(xì)胞的總RNA后,采用Nanodrop 2000分析總RNA純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,并將所得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板,U6或β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增,miR-363-3p和TWIST1mRNA的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。其中,由北京Tiangen Biotech公司合成的miR-363-3p、U6、TWIST1、β-actin 引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    3.Western blot檢測TWIST1和EMT相關(guān)蛋白Vimentin、E-cadherin的表達(dá):向待測的A549細(xì)胞中加入裂解液裂解細(xì)胞獲取總蛋白,并采用Bradford法對總蛋白定量。將其與上樣緩沖液混合均勻后,置于沸水浴中煮沸3~5 min。按照每孔60 μg蛋白樣品上樣行SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)至PVDF膜后,以含有50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉1.5 h。加入1:500 稀釋的一抗工作液4℃下結(jié)合反應(yīng)24 h。次日經(jīng)TBST溶液洗膜后,置于1:2 000稀釋的二抗工作液中常溫反應(yīng)1 h。顯影后,采用Image 軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)水平。目的蛋白的相對表達(dá)水平=目的條帶灰度值/內(nèi)參β-actin條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    4.Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力:侵襲實(shí)驗(yàn):(1)將以培養(yǎng)液稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠按照每孔80 μL 平鋪于Transwell 小室的上室,37℃下充分融合備用;(2)取24孔細(xì)胞板加入600 μL 含10﹪胎牛血清的培養(yǎng)基,放上Transwell小室,并于上室內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μL(細(xì)胞數(shù)為4×103個(gè));(3)放入培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h;(4)將Transwell小室取出,采用4﹪多聚甲醛對轉(zhuǎn)移并附著在上室下表面的細(xì)胞固定10~15 min,并以1 g/L結(jié)晶紫染色10~20 min;(5)洗去染色液后,風(fēng)干并以顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果以隨機(jī)選取的6個(gè)高視野視野中細(xì)胞數(shù)的均值表示。遷移實(shí)驗(yàn):同侵襲實(shí)驗(yàn)步驟相似,無需進(jìn)行第1步。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    5.miR-363-3p和TWIST1靶向關(guān)系的驗(yàn)證:轉(zhuǎn)染前24 h,將長勢良好的對數(shù)生長期A549細(xì)胞以105個(gè)/孔的密度接種至12孔細(xì)胞板上,待細(xì)胞生長至70﹪融合度時(shí),參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟將百奧邁科生物技術(shù)有限公司構(gòu)建的野生型(TWIST1-WT)和突變型(TWIST1-MUT)的TWIST13'-UTR 雙熒光報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-363-3p模擬物/抑制劑和相應(yīng)陰性對照共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。每組設(shè)置3個(gè)平行孔。轉(zhuǎn)染48 h后,參照Dual-luciferase檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

    采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,A549細(xì)胞中miR-363-3p、TWIST1、Vimentin和E-cadherin表達(dá)水平、熒光素酶活性、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)以表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中miR-363-3p表達(dá)升高而TWIST1表達(dá)降低

    與空白對照組和模擬物對照組比較,模擬物組A549細(xì)胞中miR-363-3p表達(dá)水平升高,TWIST1mRNA和蛋白的表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);而空白對照組和模擬物對照組之間的miR-363-3p表達(dá)水平、TWIST1mRNA和蛋白的表達(dá)水平之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。(圖1、表2)

    圖1 Western blot檢測TWIST1蛋白的表達(dá)

    表2 模擬物干預(yù)后A549細(xì)胞中miR-363-3p 及TWIST1 mRNA和蛋白表達(dá)水平(±s,n = 3)

    表2 模擬物干預(yù)后A549細(xì)胞中miR-363-3p 及TWIST1 mRNA和蛋白表達(dá)水平(±s,n = 3)

    注:與空白對照組比較,aP <0.001;與模擬物對照組比較,bP <0.001;n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

    分組 miR-363-3p表達(dá)量TWIST1 mRNA表達(dá)量TWIST1蛋白表達(dá)量空白對照組 1.00±0.08 1.00±0.06 0.81±0.05模擬物對照組 0.97±0.05 0.98±0.06 0.78±0.06模擬物組 3.82±0.45ab 0.39±0.02ab 0.42±0.02ab F值 114.067 142.223 65.215 P值<0.001<0.001<0.001

    二、TWIST1是miR-363-3p潛在的靶基因

    采用TargetScan 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn),TWIST13' UTR區(qū)域有能夠與miR-363-3p 互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列(圖2)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測發(fā)現(xiàn),與模擬物對照組比較,模擬物組TWIST1-WT活性(1.00±0.10 比0.42±0.04)降低(t= 9.327,P= 0.001),與抑制劑對照組比較,抑制劑組TWIST1-WT活性(1.08±0.07比2.96±0.30)增高(t= 10.570,P<0.001)。(圖3)

    圖2 TWIST1 3' UTR 與miR-363-3p的結(jié)合位點(diǎn)

    圖3 模擬物及抑制劑干預(yù)細(xì)胞后雙熒光素酶相對活性

    三、miR-363-3p過表達(dá)抑制A549細(xì)胞EMT進(jìn)程

    Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與空白對照組和模擬物對照組比較,模擬物組A549細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)水平降低,E-cadherin蛋白的表達(dá)水平增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);與空白對照組比較,模擬物對照組Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05);與模擬物對照組比較,模擬物組A549細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)水平降低,E-cadherin蛋白的表達(dá)水平增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。(圖4、表3)

    圖4 Western blot檢測Vimentin和E-cadherin蛋白的表達(dá)

    表3 miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞中Vimentin和E-cadherin蛋白的相對表達(dá)水平(±s,n = 3)

    表3 miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞中Vimentin和E-cadherin蛋白的相對表達(dá)水平(±s,n = 3)

    注:與空白對照組比較,aP <0.001;與模擬物對照組比較,bP <0.001;n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

    分組 Vimentin蛋白表達(dá)量 E-cadherin蛋白表達(dá)量空白對照組 0.58±0.04 0.22±0.02模擬物對照組 0.55±0.05 0.25±0.03模擬物組 0.36±0.03ab 0.47±0.03ab F值 25.620 76.227 P值 0.001<0.001

    四、miR-363-3p過表達(dá)抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲

    Transwell 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與空白對照組和模擬物對照組比較,模擬物組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);與空白對照組比較,模擬物對照組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均> 0.05);與模擬物對照組比較,模擬物組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。(表4、圖5)

    表4 miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞侵襲和遷移的影響(±s,n = 3)

    表4 miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞侵襲和遷移的影響(±s,n = 3)

    注:與空白對照組比較,aP <0.001;與模擬物對照組比較,bP <0.001;n為實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

    分組遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)(個(gè))空白對照組 85.75±5.45 128.26±6.15模擬物對照組 83.52±6.85 125.95±8.05模擬物組 53.05±4.50ab 71.64±5.75ab F值 30.990 68.106 P值<0.001<0.001

    五、TWIST1逆轉(zhuǎn)miR-363-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的抑制作用

    與模擬物+pcDNA3.1組比較,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TWIST1過表達(dá)質(zhì)粒后,miR-363-3p過表達(dá)的A549細(xì)胞中Vimentin蛋白的表達(dá)水平升高,而E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低,A549細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)增加(P均<0.05)。(圖6~圖7和表5)

    討 論

    表5 TWIST1 對miR-363-3p過表達(dá)的A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的影響(±s,n = 3)

    表5 TWIST1 對miR-363-3p過表達(dá)的A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的影響(±s,n = 3)

    分組 Vimentin蛋白表達(dá)量 E-cadherin蛋白表達(dá)量遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)(個(gè))模擬物+pcDNA3.1組 0.32±0.02 0.56±0.04 49.45±4.22 72.45±5.73模擬物+TWIST1組 0.42±0.03 0.38±0.03 67.52±5.05 108.35±6.56 t 值 4.804 6.235 4.756 7.139 P值 0.009 0.003 0.009 0.002

    圖7 Western blot檢測Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)

    EMT是賦予腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的生物學(xué)過程,被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主因。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)越來越多的miRNA 如miR-330、miR-4472和miR-194-5p 等在調(diào)控EMT過程中發(fā)揮著重要作用[8-10]。miR-363-3p是一個(gè)值得關(guān)注的miRNA,被認(rèn)為具有潛在的抑瘤作用。miR-363-3p 高表達(dá)被認(rèn)為是宮頸腺癌預(yù)后良好的重要預(yù)測指標(biāo)[11];腎癌中miR-363-3p表達(dá)缺失時(shí)可使致癌基因CREB1過表達(dá),而引入miR-363-3p可通過下調(diào)CREB1表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移[12]。另外,有學(xué)者指出,miR-363-3p 在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中經(jīng)常下調(diào),而下調(diào)miR-363-3p表達(dá)可通過靶向Sox4誘導(dǎo)EMT進(jìn)程,促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4]。

    本研究采用TargetScan 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn),TWIST13' UTR區(qū)域有能夠與miR-363-3p 互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列,并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測證實(shí)TWIST1是miR-363-3p的潛在靶基因。TWIST1是一種可誘導(dǎo)腫瘤EMT 過程的核轉(zhuǎn)錄因子,與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[13]。TWIST1在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá),在癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用;另外減少TWIST1表達(dá)可通過抑制EMT 間質(zhì)蛋白N-cadherin表達(dá)抑制癌細(xì)胞侵襲[14-16]。有研究指出,miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌組織中異常低表達(dá),且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),可通過靶向PCNA抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但其是否通過靶向TWIST1調(diào)控EMT進(jìn)程進(jìn)而影響非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移[7,17]。

    E-cadherin表達(dá)減少和Vimentin表達(dá)增多常被認(rèn)為是發(fā)生EMT的重要標(biāo)志[18-20]。有研究指出,E-cadherin 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)降低,而Vimentin 則相反,EMT 可能在非小細(xì)胞肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[21]。通過構(gòu)建miR-363-3p過表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株,本研究發(fā)現(xiàn)miR-363-3p過表達(dá)可引起TWIST1和Vimentin表達(dá)降低,而E-cadherin表達(dá)升高,抑制EMT進(jìn)程;同時(shí),miR-363-3p過表達(dá)可明顯減弱A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外,TWIST1過表達(dá)后,miR-363-3p 對A549細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的抑制作用得以逆轉(zhuǎn)。提示,miR-363-3p 可通過靶向TWIST1調(diào)控EMT抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,TWIST1 基因可能通過抑制Ecadherin蛋白表達(dá),上調(diào)Vimentin蛋白表達(dá)促進(jìn)了EMT,進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[22-23]。然而其可能的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

    綜上所述,miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中具有抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用,而靶向TWIST1抑制EMT進(jìn)程是其重要的機(jī)制之一。然而,非小細(xì)胞肺癌惡性轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制十分復(fù)雜,如何更全面的闡明miR-363-3p 在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用還有待深入研究。

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