miR-98-5p靶向PYGO2基因對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機制研究

首泉 王茜 譚志遠

宮頸癌是女性常見的婦科腫瘤之一，其發(fā)病機制復雜，隨著精準醫(yī)學的提出，從分子層面研究其發(fā)病機制可為其臨床精準治療奠定理論基礎[1]。miRNA是一種小分子非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的miRNA在宮頸癌細胞中表達存在異常，可能參與調控宮頸癌發(fā)生發(fā)展等過程，因此探索miRNA在宮頸癌中的作用機制，對于提高宮頸癌的診斷和治療及改善預后有重要意義[2]。miRNA-214在宮頸癌患者血漿中表達減少，過表達可以抑制宮頸癌細胞Siha進入S期，并且促進Siha細胞凋亡[3]；miR-144-3p在宮頸癌組織中低表達，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關[4]；miR-378、miR-10b也參與了宮頸癌的增殖、侵襲和轉移[5]。但miR-98-5p 對宮頸癌增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制還尚未見報道。PYGO2蛋白是Wnt信號通路下游一個重要的新功能蛋白，在多種腫瘤中異常高表達，可激活Wnt 靶基因[6]。研究發(fā)現(xiàn)沉默PYGO2通過抑制H3K4抑制U251細胞的生長并增加細胞凋亡[7]。PYGO2調節(jié)MMTV-Wnt1小鼠中的乳腺腫瘤起始和異質性[8]。但PYGO2蛋白在宮頸癌發(fā)生過程中的具體分子機制并不清楚。本實驗通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預測到PYGO2與miR-98-5p存在結合位點，推測miR-98-5p可能靶向調控PYGO2，因此，本實驗旨在研究miR-98-5p及PYGO2對宮頸癌增殖、遷移和侵襲的影響及miR-98-5p是否靶向調控PYGO2影響宮頸癌的增殖、遷移和侵襲。為宮頸癌的早期診斷、精準靶向治療和預后提供新靶點和新方向。

材料與方法

一、材料

1.組織標本來源：選取2016年1月至2019年1月郴州市第一人民醫(yī)院接收且確診為宮頸癌的患者20例，其中年齡＜44歲6例，≥44歲14例；病理分級：高分化的為8例，中、低分化的為12例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期的14例，Ⅲ+Ⅳ期的6例；有淋巴結轉移7例，無淋巴結轉移13例；腫瘤大?。骸? cm的14例，＜5 cm的6例。所有標本均為手術切除樣本，患者均未接受過放化療，所有患者均簽署知情同意書。其中癌旁組織是取自距離癌組織邊緣2 cm處。

2.細胞與試劑：宮頸癌細胞Siha、Hela、Caski和正常宮頸細胞Ect1/E6E7（中國科學院上海細胞庫）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibico公司）；LipofectamineTM2000試劑盒（美國Invitrogen公司）；MTT試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、BCA試劑盒（美國Sigma公司）；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京Solarbio公司）；抗體（上海煊翎生物科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：宮頸癌細胞Siha、Hela、Caski和正常宮頸細胞株Ect1/E6E7用含10﹪胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5﹪ CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3d換液1次，待細胞融和至70﹪時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.細胞轉染與分組：取常規(guī)培養(yǎng)的宮頸癌Siha細胞用0.25﹪胰蛋白酶消化后分別接種于96孔板及6孔板中，待細胞生長至80﹪融合，更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進行轉染。將miR-NC、miR-98-5p、anti-miR-NC、anti-miR-98-5p、si-NC和si-PYGO2分別轉染至宮頸癌Siha細胞中，記為miR-NC組、miR-98-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-98-5p組、si-NC組、si-PYGO2組；將miR-98-5p分別與pcDNA和pcDNA-PYGO2共同轉染至宮頸癌Siha細胞中，記為miR-98-5p+pcDNA組和miR-98-5p+pcDNA-PYGO2組，轉染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作，干擾序列見表1。

表1 PYGO2 及miR-98-5p 干擾序列

qRT-PCR檢測miR-98-5p和PYGO2 mRNA表達水平：收集以上各組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以U6和GAPDH為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環(huán)條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算，引物序列見表2。

表2 引物序列信息

4.Western blot檢測蛋白表達：收集以上各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12 000×g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳后轉至PVDF膜上，5﹪脫脂奶粉封閉液室溫封閉1h。分別加入一抗（1:1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1:2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平，每個蛋白樣品重復3次。

5.MTT檢測細胞活性：在以上各組細胞培養(yǎng)至24、48、72 h時加入20 μL（5 g/L）的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度（A）值。細胞增殖活力（﹪）=實驗組A值/空白對照組A值×100﹪。

6.Transwell檢測細胞遷移和侵襲：在各組細胞，胰酶消化后使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調整濃度為2×104個/mL。細胞遷移實驗：取200 μL細胞懸液接種于Transwell 小室上室中，并置于含完全培養(yǎng)基的下室中，37℃、5﹪CO2條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，去除培養(yǎng)基后用棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌，加入4﹪多聚甲醛固定30 min，0.1﹪結晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并隨機選取5個視野拍照，計算結晶紫染色細胞數(shù)即為遷移細胞數(shù)。細胞侵襲實驗：以1:5加入RPMI1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel后，鋪于Transwell 小室的上室，室溫下干燥后，按照細胞遷移實驗步驟操作。最后顯微鏡下觀察結晶紫染色細胞數(shù)即為侵襲細胞數(shù)。

7.熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-98-5p對PYGO2的靶向調控：TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示PYGO2 3'UTR區(qū)域有miR-98-5p 結合位點。構建野生型和突變型基因靶點PYGO2的3'UTR-熒光素酶表達載體（WT-PYGO2和MUT-PYGO2），取對數(shù)生長期宮頸癌Siha細胞接種于24孔板（5×104個/孔），待細胞生長至80﹪融合時，用LipofectamineTM2000將WT-PYGO2和MUT-PYGO2組細胞分別轉染miR-NC和miR-98-5p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統(tǒng)計學分析，實驗重復3次。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 20.00 進行統(tǒng)計學分析。miR-98-5p、PYGO2Cyclin D1、p21、p27、MMP-2、MMP-9和MMP-14表達水平、OD值、細胞遷移侵襲數(shù)、細胞熒光素酶活性等數(shù)據(jù)以表示。癌旁組織和宮頸癌組織中miR-98-5p、PYGO2表達水平比較采用配對t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、miR-98-5p和PYGO2在宮頸癌組織中的表達

qRT-PCR和Western blot檢測結果分別顯示，與癌旁組織相比，宮頸癌組織中miR-98-5p表達水平降低，PYGO2 mRNA和蛋白表達水平均升高（P均＜0.05）。miR-98-5p和PYGO2的表達水平與年齡無關，與病理分級、TNM分期、淋巴結轉移和腫瘤大小有關（圖1，表3～4）。

二、miR-98-5p和PYGO2在宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中的表達

qRT-PCR檢測和Western blot檢測顯示，與正常宮頸細胞Ect1/E6E7 相比，宮頸癌細胞Siha、Hela、Caski 中miR-98-5p的表達水平均降低，PYGO2 mRNA和PYGO2蛋白表達水平均升高（P＜0.05，表5，圖2）。后續(xù)干預實驗選擇miR-98-5p表達量最低的Siha細胞進行。

圖1 PYGO2蛋白在宮頸癌組織中的表達

表3 不同臨床特征宮頸癌患者的宮頸癌組織中miR-98-5p、PYGO2基因相對表達量（n = 20）

表4 miR-98-5p和PYGO2在宮頸癌組織中的表達（x±s）

表5 miR-98-5p和PYGO2在宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中的表達（±s，n = 3）

表5 miR-98-5p和PYGO2在宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中的表達（±s，n = 3）

注：與Ect/E6E7細胞比較，aP ＜0.05；n為實驗重復次數(shù)

細胞名稱 miR-98-5p PYGO2 mRNA PYGO2蛋白Ect/E6E7 1.00±0.08 0.98±0.09 0.21±0.03 Siha 0.34±0.04a 2.76±0.23a 0.62±0.06a Hela 0.56±0.05a 2.46±0.24a 0.51±0.05a Caski 0.46±0.04a 2.55±0.21a 0.57±0.06a F值 82.116 48.961 38.292 P值＜0.001＜0.001＜0.001

圖2 PYGO2蛋白在宮頸癌細胞和正常宮頸細胞中的表達

三、miR-98-5p過表達對宮頸癌Siha細胞增殖、遷移、侵襲的影響

qRT-PCR、MTT法及Transwell 法檢測顯示，與miR-NC組相比，miR-98-5p組宮頸癌Siha細胞中miR-98-5p的表達水平升高，Siha細胞活性降低，遷移和侵襲數(shù)量均降低（P均＜0.05），而Western blot檢測顯示，與miR-NC組相比，miR-98-5p組宮頸癌Siha細胞中Cyclin D1蛋白表達水平降低，p21、p27蛋白表達水平升高，MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表達水平降低（P＜0.05）。（圖3～4，表6）

四、抑制PYGO2表達對宮頸癌Siha細胞增殖和遷移侵襲的影響

MTT法檢測及Transwell 法檢測顯示，與si-NC組相比，si-PYGO2組宮頸癌Siha細胞活性、Siha遷移和侵襲數(shù)量均降低（P均＜0.05）。Western blot檢測顯示，與si-NC組相比，si-PYGO2組宮頸癌Siha細胞中PYGO2、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表達水平降低，p21蛋白的表達水平升高（P＜0.05）。（圖5，表7）

圖3 miR-98-5p過表達對宮頸癌Siha細胞中增殖、遷移侵襲相關蛋白的表達的影響

圖4 熒光倒置顯微鏡下觀察miR-98-5p過表達抑制宮頸癌Siha細胞遷移侵襲（結晶紫染色，×200）

圖5 PYGO2和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

五、miR-98-5p靶向調控PYGO2的表達

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預測到PYGO2 與miR-98-5p存在結合位點（圖6）。熒光素酶報告基因檢測實驗顯示，與miR-NC組比較，miR-98-5p組WT-PYGO2 宮頸癌Siha細胞的熒光素酶活性降低（P＜0.05），而miR-98-5p組MUT-PYGO2 宮頸癌Siha細胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（表8）。Western blot檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-98-5p組Siha細胞中PYGO2蛋白的表達水平降低（0.65±0.06比0.26±0.03，LSD-t= 10.070，P= 0.001）；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-98-5p組Siha細胞中PYGO2蛋白的表達水平升高（0.62±0.06比0.96±0.08，LSD-t= 5.889，P= 0.04）（圖7）。

圖6 PYGO2的3'UTR 中含有與miR-98-5p 互補的核苷酸序列

表6 miR-98-5p過表達抑制宮頸癌Siha細胞中增殖、遷移侵襲能力比較（±s，n = 3）

表6 miR-98-5p過表達抑制宮頸癌Siha細胞中增殖、遷移侵襲能力比較（±s，n = 3）

注：n為實驗重復次數(shù)

分組 miR-98-5p OD值（490 nm）遷移細胞數(shù)（個）侵襲細胞數(shù)（個）24 h 48 h 72 h miR-NC組 1.02±0.09 0.37±0.04 0.61±0.05 1.02±0.09 112.46±10.27 92.47±9.56 miR-98-5p組 2.75±0.28 0.34±0.03 0.42±0.04 0.59±0.06 48.35±4.96 39.46±3.52 t 值 10.188 1.039 5.140 6.886 9.736 9.013 P值 0.001 0.357 0.007 0.002 0.001 0.001分組 CyclinD1蛋白 p21蛋白 p27蛋白 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白 MMP-14蛋白miR-NC組 0.67±0.06 0.28±0.03 0.26±0.03 0.72±0.07 0.75±0.07 0.67±0.06 miR-98-5p組 0.31±0.03 0.60±0.06 0.57±0.05 0.35±0.04 0.31±0.03 0.27±0.03 t 值 9.295 8.262 9.208 7.949 10.007 10.328 P值 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001＜0.001

表7 抑制PYGO2表達抑制宮頸癌Siha細胞增殖、遷移和侵襲能力比較（±s，n = 3）

表7 抑制PYGO2表達抑制宮頸癌Siha細胞增殖、遷移和侵襲能力比較（±s，n = 3）

注：n為實驗重復次數(shù)

分組 PYGO2蛋白 OD值（490 nm）遷移細胞數(shù)（個）侵襲細胞數(shù)（個）24 h 48 h 72 h si-NC組 0.63±0.06 0.38±0.04 0.64±0.06 1.05±0.08 106.48±9.75 87.63±8.11 si-PYGO2組 0.27±0.03 0.37±0.04 0.46±0.05 0.67±0.06 42.16±4.25 35.42±6.20 t 值 9.295 0.306 3.992 6.582 10.474 8.858 P值 0.001 0.775 0.016 0.003＜0.001 0.001分組 CyclinD1蛋白 p2蛋白 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白 MMP-14蛋白si-NC組 0.75±0.07 0.41±0.04 0.74±0.07 0.68±0.07 0.62±0.06 si-PYGO2組 0.26±0.03 0.55±0.06 0.39±0.04 0.36±0.03 0.23±0.03 t 值 11.144 3.363 7.519 7.278 10.070 P值＜0.001 0.028 0.002 0.002 0.001

表8 miR-NC組和miR-98-5p組熒光素酶相對活性（±s，n = 3）

注：n為實驗重復次數(shù)

分組 WT-PYGO2 MUT-PYGO2 miR-NC組 0.99images/BZ_22_665_496_665_497.png±0.08 1.01±0.09 miR-98-5p組 0.38±0.04 1.03±0.08 t 值 20.460 0.498 P值＜0.001 0.625

七、PYGO2過表達逆轉了miR-98-5p過表達對宮頸癌Siha細胞增殖和遷移侵襲的影響

MTT法檢測和Transwell法檢測顯示，與miR-NC組相比，miR-98-5p組宮頸癌Siha細胞活性、遷移和侵襲數(shù)量降低；與miR-98-5p+pcDNA組相比，miR-98-5p+pcDNA-PYGO2組宮頸癌Siha細胞活性、遷移和侵襲數(shù)量升高（P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，與miR-NC組相比，miR-98-5p組宮頸癌Siha細胞中PYGO2、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平降低，p21蛋白的表達水平升高；與miR-98-5p+pcDNA組相比，miR-98-5p+pcDNA-PYGO2組宮頸癌細胞Siha 中PYGO2、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平升高，p21蛋白的表達水平降低（P＜0.05）。（表9、圖8）。

圖8 PYGO2過表達逆轉了miR-98-5p過表達對宮頸癌Siha細胞中PYGO2和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響

討 論

miRNA在宮頸癌的發(fā)生、侵襲、轉移和復發(fā)等過程中扮演重要角色，可通過調控靶基因從而促進宮頸癌細胞凋亡，并能改變腫瘤細胞對藥物的敏感性，有望作為宮頸癌診斷的標記物和治療的靶點[9]。miR-98-5p在肺癌細胞中低表達，過表達miR-98-5p通過降低STAT3水平促進A549細胞凋亡，并抑制其增殖、侵襲和遷移[10]。miR-98-5p在富含順鉑耐藥的上皮性卵巢癌細胞中高表達會促進上皮性卵巢癌細胞中的順鉑耐藥性[11]。miR-98-5p在胰腺導管腺癌組織中的下調表達，miR-98-5p的下調通過下調MAP4K4和抑制下游MAPK/ERK信號傳導促進腫瘤發(fā)展[12]。miR-98-5p通過靶向IGF2BP1抑制肝細胞癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[13]。本實驗結果表明，miR-98-5p在宮頸癌組織和細胞中同樣呈低表達，過表達miR-98-5p可抑制Siha細胞增殖、遷移和侵襲；抑制PYGO2、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表達，促進p21、p27蛋白的表達。

表9 宮頸癌Siha細胞增殖和遷移侵襲的比較（±s，n = 3）

表9 宮頸癌Siha細胞增殖和遷移侵襲的比較（±s，n = 3）

注：與miR-NC組比較，aP ＜0.05；與miR-98-5p+pcDNA組比較，bP ＜0.05；n為實驗重復次數(shù)

分組 PYGO2蛋白OD值（490 nm）遷移細胞數(shù)（個）24 h 48 h 72 h mi-NC組 0.66±0.06 0.39±0.04 0.66±0.06 1.07±0.09 109.46±9.86 miR-98-5p組 0.24±0.03a 0.36±0.03 0.44±0.04a 0.59±0.05a 46.25±4.89a miR-98-5p+pcDNA組 0.21±0.02 0.35±0.03 0.40±0.04 0.52±0.05 43.16±4.22 miR-98-5p+pcDNA-PYGO2組 0.54±0.05b 0.38±0.03 0.56±0.05b 0.84±0.07b 87.65±8.12b F值 80.149 0.930 18.022 41.978 61.087 P值＜0.001 0.469 0.001＜0.001＜0.001分組 侵襲細胞數(shù)（個）CyclinD1蛋白 p21蛋白 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白mi-NC組 91.43±9.25 0.69±0.06 0.27±0.03 0.74±0.07 0.71±0.07 miR-98-5p組 36.44±5.07 a 0.32±0.03a 0.62±0.06a 0.34±0.03a 0.32±0.03a miR-98-5p+pcDNA組 31.59±5.11 0.28±0.03 0.65±0.06 0.28±0.02 0.28±0.02 miR-98-5p+pcDNA-PYGO2組 71.25±6.98 b 0.57±0.05b 0.38±0.04b 0.57±0.05b 0.57±0.05b F值 52.768 59.190 42.309 62.195 58.023 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

Wnt信號轉導通路參與胚胎發(fā)育、細胞生長、干細胞增殖和腫瘤的發(fā)生，與女性多種生殖系統(tǒng)疾病有關且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[14]。而PYGO2是Wnt信號通路中新的功能蛋白，PYGO2調節(jié)β-連環(huán)蛋白誘導的毛囊干細胞活化和皮膚增生[15]。PYGO2在人腦膠質瘤中高表達，抑制PYGO2表達Wnt通路相關蛋白Cyclin D1表達下降，抑制人腦膠質瘤細胞生長、增殖[16]。PYGO2在腎癌組織中高表達[17]，下調其表達，細胞增殖能力和侵襲性明顯降低[18]。miR-873-5p通過干擾膀胱癌細胞中PYGO2基因的表達，阻滯細胞周期進展，抑制細胞的增殖[19]。PYGO2通過Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑激活MDR1表達并介導乳腺癌中的化學抗性，抑制其表達恢復了抗性細胞的化學治療藥物敏感性[20]。本實驗結果表明，PYGO2在宮頸癌組織和細胞中同樣是高表達，抑制PYGO2表達可抑制Siha細胞增殖、遷移和侵襲；抑制PYGO2、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表達，促進p21、p27蛋白的表達。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-98-5p靶向調控PYGO2的表達，PYGO2過表達能逆轉miR-98-5p過表達對宮頸癌Siha細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-98-5p可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與PYGO2表達有關，將為宮頸癌的預防和治療提供新靶點。