慢性阻塞性肺疾病動(dòng)物模型及評價(jià)方法研究進(jìn)展

林敏聰綜述 張勝軍審校

1.海南醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，海南 ?？?570102；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院I期臨床研究中心，海南 ?？?570102

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續(xù)存在的不完全可逆氣流受限為特點(diǎn)的疾病，呈進(jìn)行性加重，當(dāng)肺氣腫和慢性支氣管炎患者出現(xiàn)氣流受限時(shí)，就可診斷為COPD。由于擁有較高的發(fā)病率及致死率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，預(yù)計(jì)到2030年將成為全球第三大死因[1]，造成全球巨大的疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。慢阻肺病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，通常是與有害顆粒或氣體對呼吸系統(tǒng)的反應(yīng)有關(guān)，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及免疫機(jī)制等[3]，目前仍未完全闡明，因而對這一疾病的治療難以出現(xiàn)突破性進(jìn)展，目前以對癥治療為主。建立理想的動(dòng)物模型是研究慢阻肺的基本過程，對于深入了解發(fā)病機(jī)制有著不可替代的作用，對實(shí)現(xiàn)新療法和新藥從臨床前到臨床的轉(zhuǎn)化更是必不可少[4]。由于動(dòng)物與人體之間巨大的種屬差異，因此各種模型并不能完全反映人體真實(shí)的病變特點(diǎn)，需要根據(jù)研究目的選擇合適的動(dòng)物造模。

1 常用造模動(dòng)物

動(dòng)物模型是慢阻肺科研工作的基本條件，但如何構(gòu)建合理模型亦是難點(diǎn)，理想模型應(yīng)盡可能模擬出與人類相近的發(fā)病機(jī)制、病理變化、肺功能改變和癥狀等方面，同時(shí)也要具有操作簡易、經(jīng)濟(jì)、方便獲取及可重復(fù)性好的條件[5]。目前用于選擇的動(dòng)物種類繁多，有鼠類、豬、犬、猴子、羊、兔子等[6]，對致病因素的易感性也存在很大差別，根據(jù)不同研究方向合理選擇動(dòng)物造模是研究成敗的關(guān)鍵。

1.1 鼠類 小鼠最常用于慢阻肺的建模，具備如下優(yōu)勢：飼養(yǎng)成本低，易存活，性情溫順，繁殖快一次產(chǎn)代數(shù)量多，對基因組的研究已經(jīng)十分透徹，研發(fā)出多種專用的試劑及分子探針，易于進(jìn)行遺傳操作，有多種有近交品系和遺傳突變體可選擇。局限性：支氣管腺體不發(fā)達(dá)、無杯狀細(xì)胞；缺乏呼吸性細(xì)支氣管，難以模擬小氣道阻力升高；氣道管徑小，行氣管滴注藥物和肺功能檢查困難；建模時(shí)間較長，停止造模后難以維持穩(wěn)定的病變，不同品系對各種刺激的反應(yīng)存在差異[7]。大鼠的優(yōu)點(diǎn)與小鼠相似，體型較大易于取樣及行肺功能檢查，大鼠呼吸道對有害氣體的抵抗力較強(qiáng)，接受香煙煙霧刺激不容易出現(xiàn)肺氣腫病變，使用頻率不及小鼠。豚鼠也是常用動(dòng)物，肺部解剖生理與人類相似，易于出現(xiàn)肺氣腫改變，氣道對過敏原的反應(yīng)也較符合在人類的變化。有研究在香煙暴露10周后就可建立豚鼠模型，通過氣壓全身體積描記法(WBP)評估肺功能時(shí)有很多指標(biāo)與人類相似[8]，但成本較其他鼠類高，缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)試劑和基因方法的研究，限制了其廣泛應(yīng)用。

1.2 小型豬 小型豬肺解剖結(jié)構(gòu)與人類相近，也是左二葉右三葉，肺組織發(fā)達(dá)，便于分區(qū)研究，具有呼吸性細(xì)支氣管，氣道黏膜下腺體發(fā)達(dá)，肺部更易出現(xiàn)感染與氣道阻力升高，氣道管徑較大易于氣管滴注藥物和肺功能評價(jià)的操作，是較理想的模型。但體型較大，實(shí)驗(yàn)操作較小型動(dòng)物費(fèi)時(shí)費(fèi)力，購買和飼養(yǎng)等成本高，不利于開展數(shù)量多的研究，生命周期長、繁殖較慢增加研究周期。國內(nèi)研究者在小型豬氣管內(nèi)滴注蛋白酶5次，共20周后經(jīng)肺功能測量能建立早期慢阻肺模型[9]。

1.3 猴子 猴子與人類同屬于靈長類，肺組織部解剖結(jié)構(gòu)、生理功能最接近人類，所具備獨(dú)特的優(yōu)勢用于建立慢阻肺模型最為適合。但涉及高昂的成本和嚴(yán)格的倫理保護(hù)要求，周期長，操作技術(shù)要求高，在實(shí)際研究中不作常規(guī)推廣，一般在小型動(dòng)物的臨床前研究中有很大機(jī)會轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用才考慮選擇。POLVERINO等[10]在對食蟹猴進(jìn)行12周的香煙暴露后，出現(xiàn)了氣道炎癥、氣道重塑和高反應(yīng)性的表現(xiàn)，更符合在人類中的病變特點(diǎn)，但并未發(fā)展成肺氣腫，考慮與研究周期有關(guān)。

1.4 犬類 犬類也是常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，廣泛用于建立哮喘和慢阻肺等呼吸疾病模型，香煙暴露后可在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的肺氣肺，病理改變也與人類較相似，但亦缺少特異性試劑，其余缺點(diǎn)與猴子等大型動(dòng)物一致。

2 常用造模法

許多因素均可誘發(fā)肺部出現(xiàn)慢阻肺的改變，基于發(fā)病機(jī)制的理論基礎(chǔ)有有多種方法造模，各有優(yōu)缺點(diǎn)，可單獨(dú)或聯(lián)合進(jìn)行，對于選取何種方法主要根據(jù)實(shí)際研究需要、實(shí)驗(yàn)條件以及不同動(dòng)物或同種動(dòng)物不同品系對致病因素的易感性而決定。

2.1 香煙煙霧誘導(dǎo) 吸煙被認(rèn)為是導(dǎo)致慢阻肺的最主要病因，約90%的慢阻肺患者有長期吸煙史，流行病學(xué)調(diào)查也證實(shí)吸煙者的發(fā)病率顯著高于不吸煙者[11]。香煙煙霧(cigarette smoke，CS)中有害的化合物貫穿COPD發(fā)生發(fā)展的過程，能對呼吸道產(chǎn)生各種損害，因此CS誘導(dǎo)最接近人類的患病過程，是最經(jīng)典的方法，已成功在多種動(dòng)物身上試驗(yàn)得到滿意的結(jié)果。CS致慢阻肺機(jī)制大致如下：直接損害氣道上皮細(xì)胞，使纖毛結(jié)構(gòu)和功能受損，氣道凈化功能下降；刺激黏膜下感受器使支氣管平滑肌痙攣收縮，氣道阻力增加；損傷肺泡上皮細(xì)胞及肺血管，活化巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，釋放各種炎癥介質(zhì)和彈性蛋白酶，引起氣道重塑和管腔狹窄，彈性纖維破壞，形成肺氣腫[12]。誘導(dǎo)方式有兩種：鼻暴露將管道直接與動(dòng)物鼻腔相連，即主動(dòng)吸煙，更加接近人類吸煙的實(shí)際情況。全身暴露將整只動(dòng)物置于煙熏箱中，即被動(dòng)吸煙，操作更為方便應(yīng)用較多。方法無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各種方法的暴露時(shí)間、頻率、香煙用量及品牌都不盡相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往有差異，該法誘導(dǎo)時(shí)間較長，隨著時(shí)間的延長，肺部病變就越嚴(yán)重。BECKETT等[13]將小鼠在CS暴露僅在8周就出現(xiàn)出現(xiàn)了慢阻肺的多種改變。張?zhí)m英等[14]發(fā)現(xiàn)在小鼠中煙熏4周后支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量、肺泡直徑、肺病理切片與煙熏2周相比有顯著差異，符合COPD的改變，停止造模后各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定，表明4周小鼠能建立穩(wěn)定的模型。

2.2 脂多糖誘導(dǎo) 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分，在CS和污染空氣中亦存在，屬內(nèi)毒素，能刺激內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等釋放炎性介質(zhì)介導(dǎo)一系列反應(yīng)，引起蛋白酶-抗蛋白酶失衡，破壞肺組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肺氣腫發(fā)生。通常采用氣管內(nèi)滴注的方法，操作簡便，造模時(shí)間短[15]，可模擬急性加重反應(yīng)，但不能模擬慢性病變的過程，只能復(fù)制出慢阻肺的部分病理特征，一般與其他方法互補(bǔ)結(jié)合。

2.3 蛋白酶誘導(dǎo) 基于蛋白酶-抗蛋白酶失衡理論，蛋白酶分泌增加或活性增強(qiáng)、抗蛋白酶生成減少或受抑制不足以對抗蛋白酶的破壞作用，導(dǎo)致肺內(nèi)纖維蛋白、彈性蛋白和膠原纖維分解，肺彈性回縮力減弱，形成肺氣腫。有害氣體刺激、氧化應(yīng)激、先天性抗蛋白酶缺乏等均會破壞這種平衡。常用的有豬胰蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶等，給藥途徑有氣管內(nèi)滴注、霧化吸入、靜脈注射。氣管內(nèi)滴注最常用，不僅能免受血液中滅活因素的影響，而且易于控制劑量和復(fù)制出嚴(yán)重的病變。此方法具有造模時(shí)間短、成本低、易于操作的優(yōu)點(diǎn)，誘導(dǎo)的全小葉型肺氣腫可與CS誘導(dǎo)的小葉中央型肺氣腫互補(bǔ)，一般在1個(gè)月左右就可出現(xiàn)。一項(xiàng)在C57Bl/J6雌性小鼠中鼻內(nèi)滴注彈性蛋白酶的研究中，共3次，21 d后就可出現(xiàn)肺氣腫[16]，與CS誘導(dǎo)相比大幅度縮短研究周期。

2.4 基因調(diào)控模型 并非所有吸煙人群均可發(fā)展為COPD，除環(huán)境因素外，遺傳因素也參與慢阻肺的發(fā)病[17]，攜帶易感基因的動(dòng)物也更易罹患慢阻肺?；蚰Ｐ湍芨鼫?zhǔn)確地了解易感基因的致病機(jī)制，因此在慢阻肺的研究中發(fā)揮日益重要的作用。此法穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可用于特異性靶點(diǎn)篩選的研究，但獲取過程周期較長，操作復(fù)雜技術(shù)要求高。獲取方式有自然變異、轉(zhuǎn)基因和基因敲除，機(jī)制大致是通過影響基因表達(dá)對肺組織生長發(fā)育、結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響。小鼠攜帶緊皮、蒼白、米色、斑點(diǎn)基因型的自然突變品系能夠自發(fā)產(chǎn)生肺氣腫[18]。將目的基因插入基因組中使之出現(xiàn)持續(xù)和活躍表達(dá)相關(guān)產(chǎn)物即轉(zhuǎn)基因模型，需注意影響其他基因表達(dá)的可能性，目前已制備MMP-1、胎盤生長因子(PLGF)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-13(IL-13)、干擾素γ(IFN-γ)等過表達(dá)模型。嵌入外源性DNA使特定基因功能缺失而研究對生物體的影響，所得到的就是基因敲除動(dòng)物，但可能存在基因重疊或基因失活的致命影響，最經(jīng)典的就是α1-抗胰蛋白酶(ATT缺乏可引起肺氣腫，目前已通過CRISPR技術(shù)敲除小鼠所有編碼AAT的基因制備這類模型，還有血小板源性生長因子-A(PDGF-A)、腺苷脫氨酶、表面活性蛋白D(SP-D)等敲除突變體[19]。

2.5 免疫模型 患者肺內(nèi)存在活化的Th1細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，在戒煙后肺部炎癥還可長期持續(xù)，說明自身免疫機(jī)制參與慢阻肺發(fā)病過程[20]?；颊叩腎gG和IgA抗支氣管上皮細(xì)胞循環(huán)抗體(anti-HBEC)和細(xì)胞角蛋白18(CK18)、CK19自身抗體增加，表明自身免疫與慢阻肺嚴(yán)重程度有相關(guān)性[21-22]。實(shí)驗(yàn)已建立起大鼠自身免疫肺氣腫模型，機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

2.6 其他方法誘導(dǎo)模型 污染空氣中的多種物質(zhì)均能對肺部產(chǎn)生不同程度影響，如SO2、PM2.5、臭氧均與慢阻肺的發(fā)病有關(guān)。SO2能使肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，損傷肺泡上皮細(xì)胞，很早已建立相應(yīng)模型。慢阻肺患者下呼吸道中存在多種定植菌，可引發(fā)慢性炎癥致氣道重塑、管腔狹窄等改變，有研究者通過銅綠假單胞菌感染大鼠建立COPD模型[23]。細(xì)顆粒也出現(xiàn)類似香煙煙霧的作用，刺激呼吸道黏膜，減弱氣道凈化能力，已用吸入PM2.5和氣管滴注混懸液建立起典型COPD病理改變的模型[24]。臭氧是常見的空氣污染物，與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)，SUN等[25]將小鼠暴露2.5ppm濃度臭氧中7周，每周2次就可建立起較理想的模型。

2.7 多因素誘導(dǎo)模型 由于發(fā)病機(jī)制和病因的復(fù)雜性，單一因素造模只能復(fù)制一部分病變，為盡可能重現(xiàn)多方面的病理和功能改變，采用復(fù)合因素建模更合理。常用是有CS聯(lián)合LPS誘導(dǎo)、CS與基因模型結(jié)合、LPS與細(xì)菌感染結(jié)合等。國內(nèi)一項(xiàng)在大鼠中比較煙熏法、LSP滴入法和兩種方法聯(lián)合的研究中，各造模28 d就可出現(xiàn)病理改變，但聯(lián)合造模法病理評分和MMP-9、TGF-β1變化更顯著[26]。

3 評價(jià)方法

如何評價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否造模成功、符合研究要求是一個(gè)很重要的方面，理想模型應(yīng)盡量與人類常見的病因符合、病理特點(diǎn)和功能改變相近，物種的差異性使評價(jià)指標(biāo)無法完全達(dá)標(biāo)，目前仍然無統(tǒng)一的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，常用有肺功能、病理學(xué)、血?dú)夥治龅葯z查[27]，根據(jù)動(dòng)物特性可通過多方面綜合評價(jià)。

3.1 一般情況 COPD是一種全身性疾病，造模過程中大多數(shù)動(dòng)物能逐漸出現(xiàn)不同程度的咳嗽、噴嚏、鼻分泌物增加、呼吸急促、飲食減少、體質(zhì)量減輕、毛發(fā)枯黃脫落、活動(dòng)減少、精神倦怠等癥狀。一般情況可作為初步的評價(jià)指標(biāo)，有重要的參考價(jià)值，決定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能否進(jìn)行下一項(xiàng)的評判過程。

3.2 病理改變 病理檢查能直觀的顯示氣道和肺組織的結(jié)構(gòu)變化，評價(jià)病變嚴(yán)重程度，提供動(dòng)物造模是否符合要求最有力的證據(jù)。從整體上看病肺體積增大、腫脹、顏色變淺和彈性下降等。病理切片光鏡觀察顯示氣道黏膜下腺體肥大增生、杯狀細(xì)胞增多；黏膜下炎性細(xì)胞浸潤；上皮細(xì)胞壞死脫落、出現(xiàn)鱗狀化生；終末支氣管出現(xiàn)管壁增厚、管腔變形狹窄、可見分泌物阻塞；管周和肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤；肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴(kuò)大、結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄、斷裂而部分融合成肺大皰[28]。

3.3 肺功能檢查 慢阻肺具有早期小氣道阻塞的特點(diǎn)，臨床上通常用肺功能檢查作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是檢測是否存在氣流受限的重要手段。COPD的肺總量(TLC)和殘氣量(RV)增加，肺活量(VC)、用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性均下降，F(xiàn)EV1/FVC＜70%就認(rèn)為存在氣流受限。常用的檢查方法有體描法、脈沖震蕩法(IOS)。體描法受氣體溫濕度、收縮狀態(tài)、呼吸頻率等多因素影響，逐漸被IOS法取代。IOS法是基于強(qiáng)迫震蕩技術(shù)發(fā)展的最常用的方法，應(yīng)用此原理的Flexivent技術(shù)能具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，能測定多種呼吸動(dòng)力參數(shù)。

3.4 炎性細(xì)胞 慢阻肺的支氣管和肺組織出現(xiàn)多種炎性細(xì)胞浸潤，可作為模型評價(jià)的有用指標(biāo)[29]。中性粒細(xì)胞是COPD主要的炎性細(xì)胞，其活化和聚集是炎癥過程的重要環(huán)節(jié)，炎癥存在時(shí)大量聚集，并分泌-IFN-γ，IL-8，趨化更多中性粒細(xì)胞聚集，釋放活性氧(ROS)和彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶引起氧化應(yīng)激及破壞肺組織[30]。巨噬細(xì)胞是呼吸系統(tǒng)的防御細(xì)胞，炎癥存在時(shí)也可釋放趨化因子，在患肺中能大量增加，加重炎癥反應(yīng)。肺中CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加與氣流受限程度相關(guān)，分泌集落刺激因子、IFN-γ、IL-2、IL-4、顆粒酶B等調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞功能而加重氣道慢性炎癥。

3.5 細(xì)胞因子 各種細(xì)胞因子的變化水平在慢阻肺初期即可表現(xiàn)出來，對早期評估和診斷有著重要的價(jià)值。典型的細(xì)胞因子有IL-8、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、α1-AT。IL-8由巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞所分泌，對中性粒細(xì)胞有趨化和激活作用、促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展和組織損傷，在疾病發(fā)展各階段都發(fā)揮作用，可用來判斷病情嚴(yán)重程度。IL-10是一種炎癥和免疫抑制因子，在病情進(jìn)展過程中其水平降低，也可用于病情評估。TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，能活化自身和T淋巴細(xì)胞，并刺激中性粒細(xì)胞釋放IL-8。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)可通過刺激細(xì)胞外基質(zhì)和纖維合成參與氣道重塑過程[31]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)則能分解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子活性、降解ATT，參與肺組織破壞及重塑，吸煙量與肺內(nèi)的MMP-9正相關(guān)而與FEV1呈負(fù)相關(guān)[32]。近年來發(fā)現(xiàn)IL-18是一種重要的促炎因子[33]，促進(jìn)慢阻肺的穩(wěn)定發(fā)展，有望成為新療法的靶點(diǎn)。

4 結(jié)語

動(dòng)物模型的建立是探索疾病預(yù)防、新藥研發(fā)和新療法的基礎(chǔ)，使臨床研究能夠順利、安全地開展，是實(shí)驗(yàn)室研究成果轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用的必不可少的環(huán)節(jié)。目前還沒能建立起完全符合人類COPD病變特點(diǎn)的最理想模型，且沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[34]，目前也在不斷尋找更適合動(dòng)物和造模方法，以求達(dá)到一種規(guī)范化。近年來比較流行的雪貂煙熏模型[35]，其氣道生理學(xué)與黏膜下腺體分布于人類高度相似，氣道阻塞程度較其他動(dòng)物嚴(yán)重，有較多自發(fā)性咳嗽，造模6個(gè)月后顯示出與人類很多相似特點(diǎn)，有望成為一種理想的動(dòng)物模型。CS誘導(dǎo)的小鼠模型中miRNA-21水平比對照組高，表明與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，水平降低可對COPD的發(fā)展有抑制作用，可作為一種全新的評價(jià)指標(biāo)[36]。目前多應(yīng)用復(fù)合因素造模更符合COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的條件，根據(jù)研究目的和實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的動(dòng)物和造模方法是保證造模成功和研究過程順利開展的前提。需要多方面標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)模型是否達(dá)到要求，確定存在典型病理改變、通氣受限、動(dòng)態(tài)順應(yīng)性下降等改變。隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)，將會出現(xiàn)更理想的動(dòng)物模型和更全面的評價(jià)方法，為進(jìn)一步研究COPD提供有力的支持。