稻曲菌素及其生物合成途徑研究進展

胡元森，楊浩杰，謝澳文，韓一鳴，樊 磊，呂揚勇

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

稻曲菌素(Ustiloxins)是由稻綠核菌產(chǎn)生的一種具有較強細胞毒性的環(huán)肽類真菌毒素，該毒素能夠通過抑制微管蛋白的組裝和解聚從而抑制細胞有絲分裂，對人和動物細胞產(chǎn)生毒害作用；同時受到稻曲菌素污染的稻谷，質(zhì)量明顯下降[1-3]。由于稻曲菌素對細胞的毒性作用，使得其在農(nóng)藥(抗真菌、殺蟲)和醫(yī)藥(抗腫瘤)領(lǐng)域也有廣泛的用途[4-5]。近年來，隨著分離純化技術(shù)的進步，不斷有新類型的稻曲菌素被發(fā)現(xiàn)[6-7]。同時研究發(fā)現(xiàn)，除稻綠核菌外，糧食儲藏過程中常見的黃曲霉在一定的條件下也能合成稻曲菌素[8-10]。由于該毒素與食品質(zhì)量安全及人類健康的密切關(guān)系，其理化性質(zhì)、毒性、化學(xué)合成、生物合成及其調(diào)控機理的研究越來越受到重視。作者主要對稻曲菌素的類型、提取與檢測方法、生物毒性、生物合成途徑及其調(diào)控機理進行綜述。

1 稻曲菌素的類型

截至目前，發(fā)現(xiàn)稻曲菌素共有6種類型，包括A、B、C、D、F、G，均被分離純化并鑒定了結(jié)構(gòu)。其中,稻曲菌素A、B、C、D、F最先被分離鑒定[1-2,6]，而稻曲菌素G在2017年由Wang等[7]從感染稻曲病的大米中分離得到，稻曲菌素G(C的類似物)和之前鑒定的5種毒素有著類似的結(jié)構(gòu)，均具有手性烷基、芳香基醚和13元環(huán)肽的結(jié)構(gòu)。在6種毒素中，稻曲菌素A和B是主要的成分，約占總量的90%[11]。

2 稻曲菌素的提取、分離純化及檢測

2.1 稻曲菌素的提取與分離純化

呂仕瓊等[5]對稻曲菌素A、B、C、D、F的提取與分離純化方法做了詳細的綜述，提取方法主要包括甲醇提取法和硫酸銨沉淀法；純化方法主要采用反相硅膠柱層析進行分離。Wang等[7]對新型稻曲菌素G的分離純化進行了詳細探討，通過對甲醇、乙醇、丙酮和去離子水提取溶液的研究，發(fā)現(xiàn)去離子水提取效果最佳。在室溫下，去離子水和大米假黑穗球以1∶3(kg/L)的比例劇烈震蕩處理24 h，過濾后的濾液在60 ℃下進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到含有稻曲菌素的殘渣。采用大孔吸附樹脂SP207層析，不同比例的乙醇-水為流動相，得到不同組分。然后采用半制備液相配備ODS柱和Sephadex G-15層析柱，不同比例甲醇-水(含有0.02%三氟乙酸)作為流動相，分離得到不同組分的純品。

2.2 稻曲菌素的檢測

目前針對稻曲菌素的檢測方法有傳統(tǒng)的薄層層析法、酶聯(lián)免疫法(多克隆抗體)、高效液相色譜法以及近幾年來廣泛采用的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及單克隆抗體類酶聯(lián)免疫法。由于A和B兩種類型是稻曲菌素的主要組成部分，因此，目前方法主要針對這兩種毒素進行檢測。前3種方法針對的是稻曲菌素A，并且已有文獻[5]綜述，在此主要介紹后兩種新建立的方法，能夠同時檢測主要的兩種稻曲菌素A和B。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。Shan等[12]首次通過液質(zhì)聯(lián)用法(LC-ESI-MS)和高效液相(HPLC-UV)同時測定分析感染了稻綠核菌大米中稻曲菌素A和B的含量。首先采用液相質(zhì)譜聯(lián)用確定組分，再采用高效液相檢測含量。簡要流程如下：取一定量樣品，去離子水抽提3次，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到殘渣，取其中少部分經(jīng)過離子交換處理后，液相-電噴霧質(zhì)譜(LC-ESI-MS)檢測確定樣品組成。液相條件：Synergi reversed-phase Hydro-C18 柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為甲醇-水(體積比為15∶85)含0.02%三氟乙酸，流速1.0 mL/min，紫外檢測器檢測波長220 nm。質(zhì)譜條件：ESI正離子工作模式，掃描范圍100～1 000m/z，壓力35 psi(241.325 kPa)，干燥氣體溫度350 ℃，干燥氣體流量8.0 L/min，毛細管電壓3 500 V，總分析時長30 min。

酶聯(lián)免疫法。陳美軍等[13]、Fu等[14]采用單克隆抗體類酶聯(lián)免疫吸附試驗(icELISA)方法對水稻和飼料樣品中的稻曲菌素A進行檢測，簡要流程如下：首先將大米假黑穗球粉碎并在室溫下用去離子水萃取3次，水提取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后經(jīng)過大孔吸附樹脂HP-20吸附, ODS-AQ、Sephadex LH-20和Sephadex G-15等柱層析，獲得稻曲菌素A和稻曲菌素B純品。使用戊二醛法將稻曲菌素A與BSA、OVA綴合以分別制備免疫原(UA-BSA)和包被抗原(UA-OVA)。然后免疫雌性Balb/c小鼠，產(chǎn)生并純化獲得單克隆抗體mAb 2D3G5，IC50為13.8 ng/mL，工作范圍為2.8～72 ng/mL。在前期工作基礎(chǔ)上，F(xiàn)u等[11]最近成功開發(fā)出直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(dc-ELISA)同時測定稻曲菌素A和B的總含量，簡要流程如下：分別純化得到稻曲菌素A和B，將稻曲菌素B分別通過戊二醛法與雞卵白蛋白和牛血清蛋白結(jié)合制備抗原(UB-OVA/UB-BSA)，將稻曲菌素A與辣根過氧化物酶連接，經(jīng)過免疫小鼠等一系列流程獲得單克隆mAb 4C4F11，對稻米中稻曲菌素A和B的最低檢測限分別為35 ng/g和100 ng/g。

3 稻曲菌素的生物活性

3.1 對微管蛋白的作用

呂仕瓊等[5]對稻曲菌素A、B、C、D、F抑制微管蛋白的組裝和解聚機理進行了詳細綜述，其中稻曲菌素A 對微管蛋白組裝的半抑制濃度最低。稻曲菌素A對于微管蛋白的抑制機理在于阻斷了β-微管蛋白中特定鏈內(nèi)交聯(lián)的形成，同時抑制了碘代乙酰胺對微管蛋白的烷基化作用，并且稻曲菌素 A能夠強烈促進秋水仙堿與微管蛋白的結(jié)合[15]。Joullié等[16]采用化學(xué)合成手段獲得了稻曲菌素D的4種類似物D1、D2、D3、D4，并研究了對微管蛋白聚合的影響。研究結(jié)果顯示D1和D4對微管蛋白無抑制作用，其IC50大于40 μmol/L，這表明天然存在的稻曲菌素D大環(huán)大小是最合適的。D3表現(xiàn)出輕微的抑制作用，但其總的IC50也大于40 μmol/L。醚橋上立體碳去除后獲得的稻曲菌素D2抑制效果較好，其IC50值為 (9.2±2.0) μmol/L。對稻曲菌素D與D2、D3的結(jié)構(gòu)進行分子對接模擬結(jié)果顯示，甘氨酸側(cè)鏈發(fā)生了明顯的扭曲，使其逐漸靠近纈氨酸殘基。外部的甘氨酸側(cè)鏈可能會降低分子在這個位置的結(jié)合能力，但也可能會阻礙與纈氨酸殘基的結(jié)合能力，這對其發(fā)揮抑制作用極其關(guān)鍵。

3.2 對人體癌細胞的抑制作用

Koiso等[17]研究了稻曲菌素A和B對人的胃、肺、心臟、結(jié)腸和腎的癌細胞的抑制作用，結(jié)果顯示兩種毒素均能抑制供試的癌細胞。Wang等[7]采用紫杉醇為陽性對照(CK)，研究了稻曲菌素A、B、D、F、G對結(jié)腸癌細胞系(HCT116)、非小細胞肺癌細胞系(NCI-H1650)、胃癌細胞(BGC-823)、肝癌細胞(HepG2)、肺腺癌細胞(A549)以及黑色素瘤細胞(A375)系的毒性。結(jié)果顯示稻曲菌素D、F和G對HCT116、NCI-H1650、BGC-823和HepG2表現(xiàn)出較弱的抑制活性，此外稻曲菌素G對細胞系A(chǔ)549和A375表現(xiàn)出弱活性，IC50值分別為36.5、22.5 μmol/L;稻曲菌素A對HCT116、NCI-H1650、HepG2抑制活性也較弱，對人腫瘤細胞系BGC-823和A549顯示出中等活性，IC50分別為2.66、3.12 μmol/L；稻曲菌素B對A549抑制活性較差，它們的半抑制濃度IC50均超過了50 μmol/L，對 BGC-823細胞系抑制活性較好，而對HCT116、NCI-H1650和HepG2細胞系的抑制活性一般。

3.3 對種子萌發(fā)的抑制作用

研究表明，大米假黑穗球的水浸出液對水稻、玉米以及小麥等的胚芽和胚根生長均有抑制作用。Koiso等[17]研究了不同質(zhì)量濃度的稻曲菌素A對水稻種子萌發(fā)的影響，結(jié)果顯示當其質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，幾乎完全抑制胚根和胚芽的生長。Wang等[7]以草甘膦為陽性對照，對分離純化得到的稻曲菌素A、B、D、F、G對 “Lijiang”和 “Zhonghua11”兩個水稻品種的種子胚根和胚芽伸長抑制活性研究發(fā)現(xiàn)：稻曲菌素A、B以及G對兩類種子的胚根和胚芽的生長具有較強的抑制作用，同時3種毒素還能夠引起水稻幼苗根系和胚芽的異常膨脹。結(jié)果顯示，稻曲菌素A、B和G的抑制作用強于D和F，說明C-12側(cè)鏈的亞硫?；Y(jié)構(gòu)對于稻曲菌素發(fā)揮抑制作用具有重要影響。

4 稻曲菌素合成途徑

4.1 化學(xué)合成途徑

由于稻曲菌素具有作為抗腫瘤藥物、殺蟲劑等應(yīng)用的潛力，其化學(xué)合成方法的研究也備受關(guān)注。在稻曲菌素家族中，D類型毒素是較簡單的同系物之一，具有較高的生物活性，對其化學(xué)合成方法的研究可為其他化合物的合成提供骨架組成部分[18]。因此，目前稻曲菌素的化學(xué)合成主要集中在D類型的研究[19-21]，其合成途徑已經(jīng)由最初的20個化學(xué)反應(yīng)發(fā)展到通過6個步驟的ammonia-Ugi 反應(yīng)即可得到[22]。

4.2 生物合成途徑及其調(diào)控機理

截至目前，稻曲菌素的合成途徑及調(diào)控機制研究主要集中在黃曲霉中，特別是稻曲菌素B合成途徑的研究。在此，主要以黃曲霉為對象進行介紹。依據(jù)催化酶的不同，可以將次級代謝產(chǎn)物分為聚酮合酶類(polyketide Synthases, PKSs)、非核糖體多肽酶類(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)以及萜環(huán)化物(terpene cyclases)等[23]，比如黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素、震顫毒素等屬于PKS類型的化合物[24]。根據(jù)稻曲菌素由多個非蛋白類的氨基酸組成的特點，最初認為其屬于NRPS類型的化合物。采用基于基序從頭檢測算法(motif-independent de novo detection algorithm, MIDDAS-M)對黃曲霉中基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其合成途徑中的酶并不存在NRPS所具有的特異性催化結(jié)構(gòu)域，如PCP、TE等結(jié)構(gòu)域，而是屬于核糖體合成和翻譯后修飾肽類(Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides, RiPPs)化合物[8]。該類化合物在細菌中較為常見，如1998年發(fā)現(xiàn)的枯草菌素等[25-26]；在真菌中，只有白毒傘蘑菇中的兩個化合物α-amanitin和phallacidin的結(jié)構(gòu)被鑒定[27]。在子囊菌中，目前只有黃曲霉中的稻曲菌素合成途徑得到鑒定[8-10]。

稻曲菌素的生物合成途徑包含了一系列的酶促反應(yīng)過程，涉及多個基因，分布在基因組30 kb范圍內(nèi)。這些基因編碼了稻曲菌素前體蛋白、兩個氧化酶、依賴于腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移酶、細胞色素P450單加氧酶、兩個含黃素單加氧酶、半胱氨酸脫硫酶以及C6類型的途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子等。以下對生物合成途徑涉及的主要酶及基因做詳細介紹。

稻曲菌素前體蛋白(ustA，基因號AFLA_094980)：盡管RiPS類型化合物合成途徑各異，但是都存在一個前體蛋白。在黃曲霉中ustA編碼該蛋白合成，該序列包含16個重復(fù)短肽“YAIG”，是合成稻曲菌素的基本單元。短肽的C端和N端分別包含相似的序列，該序列可能為ustP1、ustP2和ustH編碼肽酶的識別位點。目前已知的RiPS前體蛋白中只含有一個核心肽，而黃曲霉中多個重復(fù)肽段的存在可能有助于稻曲菌素產(chǎn)量的提高[8]。

酪氨酸酶(ustQ, AFLA_095060)與兩個氧化酶(ustYa, AFLA_094990和ustYb, AFLA_095020)：ustQ與ustYb基因單獨缺失之后，稻曲菌素B仍有少量產(chǎn)生；ustYa和ustYb同時缺失之后，稻曲菌素F合成被阻斷，表明這3個基因促進了氧原子與酪氨酸芳香環(huán)以及異亮氨酸側(cè)鏈的交聯(lián)，共同參與了環(huán)肽中間體的形成。其中ustYa和ustYb編碼的酶均含有“HXXHC”基序，可能是該酶的活性中心[10]。

甲基轉(zhuǎn)移酶(ustM, AFLA_095100)、細胞色素P450單加氧酶(ustC, AFLA_094960)、黃素單加氧酶(ustF1, AFLA_094950; ustF2, AFLA_095050)以及依賴于5′-磷酸吡哆醛(PLP)酶(ustD, AFLA_095040): 通過甲基轉(zhuǎn)移酶和單加氧酶催化的氧化還原反應(yīng)，將甲基和硫元素添加至側(cè)鏈，然后在黃素單加氧酶的催化下，通過兩輪N-羥基化反應(yīng)以及脫羧脫水反應(yīng)得到中間化合物，類似的反應(yīng)過程也存在于淺藍霉素A的合成過程中[28]。ustD主要催化天冬氨酸脫羧生成烯胺。

研究表明，稻曲菌素生物合成途徑受到Zn(II)2Cys6 (C6)類型的途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子ustR、枯草桿菌蛋白酶類似的內(nèi)切蛋白酶kexB以及全局調(diào)控因子LaeA的調(diào)控。在黃曲霉中，通過將ustR的啟動子更換為TEF1基因啟動子后，其轉(zhuǎn)錄水平提高了15倍，稻曲菌素B的產(chǎn)量提高了4.8倍[8]。

在黃曲霉和稻綠核菌中，稻曲菌素前體蛋白ustA的N端均含有進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號肽，C端含有一個堿性氨基酸的重復(fù)序列“KR”，這與釀酒酵母中內(nèi)切蛋白酶kex2的作用位點類似[29]。在釀酒酵母中，kex2編碼了依賴于Ca2+的跨膜絲氨酸蛋白酶，能夠水解KR的羧基側(cè)鏈[30]。在米曲霉中，kex2同源基因kexB參與前體蛋白處理得到了驗證，在一株缺失kexB基因且對ustR進行過量表達的菌株(ustREX/ΔkexB)中，雖然ustR轉(zhuǎn)錄水平得到了增強，但是產(chǎn)物中檢測不到稻曲菌素B。為了進一步驗證kexB的作用，同時構(gòu)建了米曲霉10個蛋白酶缺陷株和ustR過量表達菌株(ustREX/ΔP10)，結(jié)果表明與單獨過量表達ustR的菌株相比(ustREX)，二者產(chǎn)生的稻曲菌素含量相同，表明kexB對于稻曲菌素的合成是必須具有特異性[31]。根據(jù)此研究結(jié)果，Umemura等[8]完善了kexB調(diào)控稻曲菌素的合成途徑，首先ustA蛋白在經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被轉(zhuǎn)運到高爾基體的過程中，必須經(jīng)過kexB對其C端的“KR”進行識別并切割，在此過程中還需要另外兩個絲氨酸肽酶ustP和ustH的協(xié)助;然后在ustQ等酶催化下經(jīng)過甲基化、環(huán)化等反應(yīng)，形成中間產(chǎn)物稻曲菌素F;最后在ustM、ustD等作用下經(jīng)過脫羧、脫水機縮合等反應(yīng)形成稻曲菌素B。

LaeA 作為全局性調(diào)控因子廣泛存在于黃曲霉、紅曲霉、稻瘟菌等絲狀真菌中，對黃曲霉毒素、青霉素等多種次級代謝產(chǎn)物具有調(diào)控作用[32]。Lv等[33]最近通過對黃曲霉野生型菌株和LaeA缺陷型菌株蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，包括稻曲菌素合成前體ustA在內(nèi)的4種酶(ustH、ustM和ustD)的表達量均出現(xiàn)了大幅度的下調(diào)，含量分別為野生型的0.13、0.46、0.34和0.22，表明LaeA可能參與了稻曲菌素合成的調(diào)控。

5 展望

目前，稻曲菌素的研究主要集中在新結(jié)構(gòu)的分離鑒定、毒性分析、化學(xué)合成及新的檢測方法的建立，并且取得了較大的進展。然而稻曲菌素生物合成途徑及其調(diào)控機制的研究還處在初級階段，主要集中在生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的功能研究，仍然停留在基因組水平。研究表明，胞外多種環(huán)境因子如溫度、濕度、水分活度等,營養(yǎng)元素如碳源、氮源、無機鹽等,相關(guān)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平以及翻譯后修飾水平(甲基化、乙?；⒘姿峄?、SUMO化、巴豆酰化等)的調(diào)控對次級代謝的產(chǎn)生均具有顯著的影響[34-36]，而稻曲菌素在這些方面的調(diào)控研究鮮有報道。筆者認為在這些方面開展工作，不但有利于進一步闡明稻曲菌素的生物合成途徑及其調(diào)控機理，對于制定新的、有效的策略對稻綠核菌進行生物防控以期阻斷稻曲菌素的污染具有重要的現(xiàn)實意義。