白腐菌木質(zhì)素降解酶高產(chǎn)菌株的篩選

徐安民，李 力，馬 森

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

小麥麩皮含有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還富含膳食纖維，適量的小麥麩皮添加到面制品中可提高面制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但同時(shí)由于其口感粗糙使得面制品食用品質(zhì)降低。因?yàn)樾←滬熎ぶ校w維素形成細(xì)胞壁的骨架，半纖維素與纖維素由氫鍵締合，木質(zhì)素通過(guò)醚和酯鍵與半纖維素相連接[1]，所以對(duì)木質(zhì)素的降解成為改性小麥麩皮的關(guān)鍵。利用微生物降解木質(zhì)素是相對(duì)可行的途徑，白腐菌目前是最有效、最主要的木質(zhì)素降解微生物。白腐菌屬于擔(dān)子菌綱，腐生在木材或死樹(shù)樁上，引起木質(zhì)腐爛，故此得名[2]。它是整個(gè)碳素循環(huán)的中心，是已知的唯一能在純系培養(yǎng)中將木質(zhì)素降解成 CO2和 H2O 的一類(lèi)微生物[3]。白腐菌在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中形成了一套獨(dú)特的降解系統(tǒng)，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、錳過(guò)氧化物酶(mangnase peroxidase，MnP)、漆酶(laccase，Lac)共同構(gòu)成了白腐菌的木質(zhì)素降解酶系[4-5]。

近年來(lái)，關(guān)于白腐菌降解木質(zhì)纖維素的基礎(chǔ)研究有很多，但主要集中在對(duì)單一菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究。在篩選高效降解木質(zhì)素降解菌時(shí)，有些研究的篩選指標(biāo)比較單一，沒(méi)有較強(qiáng)的說(shuō)服力[6]，缺乏綜合性。為了能全面系統(tǒng)地進(jìn)行高效降解木質(zhì)素菌株的篩選工作，筆者結(jié)合愈創(chuàng)木酚平板變色法、產(chǎn)酶比較和定量測(cè)定木質(zhì)素含量的方法，從9株白腐菌中篩選出1株高效降解麥麩纖維的菌株，為篩選開(kāi)發(fā)高效降解木質(zhì)素工業(yè)菌株提供思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

CICC 14121(AP1)、CICC 50017(AP2)：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；CGMCC 7004(AP3)、CGMCC 7002(AP4)、CGMCC E5.95(AP5)、CGMCC E5.94(AP6)：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；BNCC 336040(AP7)、BNCC 336039(AP8)、BNCC 143171(AP9)：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 小麥麩皮

小麥麩皮：中鶴現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)集團(tuán)有限公司。小麥麩皮的前處理參照陶顏娟[7]的方法。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面固體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，1×105Pa滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏2 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB10.5 g/L，pH自然，1×105Pa滅菌30 min。

愈創(chuàng)木酚-PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB10.02 g/L，愈創(chuàng)木酚1 g/L，pH自然，1×105Pa滅菌30 min。

液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麥麩30 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，(NH4)2SO41.4 g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，MnSO4·H2O 1.6 mg/L，VB10.02 g/L，pH自然，分裝至250 mL的三角瓶中，每瓶100 mL, 1×105Pa滅菌30 min。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TH2-D型恒溫振蕩器：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HWS 型恒溫恒濕箱：寧波東南儀器有限公司；FYB101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海梳理儀器有限公司；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C型精密酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；LS-75LJ型立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療有限公司；752 N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種初篩

采用孫江慧[8]的方法，并略作改動(dòng)。用0.1%愈創(chuàng)木酚加入PDA培養(yǎng)基中做成平板，從斜面試管培養(yǎng)基中挑取活化后的9株菌株，每一株菌株做2個(gè)平行，于26 ℃培養(yǎng)10 d。觀察分析平板中菌落圈和顯色圈直徑的大小和菌落顏色變化。

1.3.2 粗酶液制備

用培養(yǎng)6 d的菌株分別定量接種，吸取搖勻的種子液10 mL加入裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每一株菌株接種2瓶，于26 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)15 d。菌種液體培養(yǎng)從第4天開(kāi)始取樣，每隔1 d取樣1次，發(fā)酵液用4層紗布過(guò)濾，濾液在3 000 r/min條件下離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.3.3 酶活的測(cè)定

漆酶酶活的測(cè)定參照Glenn 等[9]的方法。

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活的測(cè)定參照Cacchio等[10]的方法。錳過(guò)氧化物酶酶活的測(cè)定參照Glenn等[11]的方法。

1.3.4 麥麩木質(zhì)素降解能力的測(cè)定

分別取不同菌株的種子液10 mL，接種至含麩皮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 ℃搖床培養(yǎng)15 d后，將生物預(yù)處理后的小麥麩皮過(guò)濾洗凈， 60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎混勻，備用。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。麥麩中木質(zhì)素含量測(cè)定方法參考王玉萬(wàn)等[12]的檢測(cè)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶活性的平板檢驗(yàn)

Ander等[13]認(rèn)為能在以愈創(chuàng)木酚為指示劑的選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生顯色圈的微生物具有降解木質(zhì)素的能力，產(chǎn)漆酶的菌株在該培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌絲能產(chǎn)生明顯的紅褐色。在愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)9株菌株10 d，每天對(duì)各平板的變色情況進(jìn)行觀察記錄，其結(jié)果列于表1。根據(jù)菌株在平板上的生長(zhǎng)和變色情況，可將9株菌株分為以下4種類(lèi)型：(1)在平板上沒(méi)有顯色圈，有AP2；(2)在平板上有紅褐色的顯色圈，但顯色圈直徑與菌落圈直徑比值小于1，有AP5；(3)在平板上有紅褐色的顯色圈，顯色圈直徑與菌落圈直徑比值大于1，但菌株生長(zhǎng)較稀疏，有AP1、AP4；(4)在平板上有紅褐色的顯色圈，顯色圈直徑與菌落圈直徑比值大于1，菌株生長(zhǎng)較旺盛，有AP9、AP6、AP8、AP7、AP3。圖1為不同菌株在PDA顯色平板上第7天時(shí)的生長(zhǎng)情況。

表1 不同菌株菌落圈、顯色圈直徑隨時(shí)間的變化

注：同列不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)。

圖1 不同菌株在PDA顯色平板上第7天時(shí)的生長(zhǎng)情況

Ander 等[13]認(rèn)為對(duì)于白腐菌，顯色圈的形成有兩種：一種是顯色圈在菌落的外圈形成，此時(shí)D菌落圈/D顯色圈<1；另一種是顯色圈在菌落的內(nèi)圈形成，此時(shí)D菌落圈/D顯色圈>1。Eriksson等[14]的研究表明,菌落圈與顯色圈直徑的比值可作為判斷該菌是否能選擇性降解木質(zhì)素的依據(jù),比值小于1則該菌能選擇性降解木質(zhì)素，比值大于1的菌則首先降解纖維素。綜上所述，經(jīng)過(guò)愈創(chuàng)木酚法定性篩選，從9株菌中共篩選出5株能產(chǎn)生顯色圈且生長(zhǎng)旺盛的菌株用來(lái)做后續(xù)復(fù)篩試驗(yàn)。

許多學(xué)者在研究木質(zhì)素降解菌時(shí)僅選擇一種定性篩選培養(yǎng)基，這樣只能檢測(cè)出1種或2種木質(zhì)素降解酶。事實(shí)上許多研究表明,白腐真菌對(duì)木質(zhì)素的降解不是依靠1種酶作用,而是幾種酶共同作用的結(jié)果,主要通過(guò)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶這3種酶來(lái)完成[15]，而且，顯色圈大小與漆酶活性的高低有必然聯(lián)系但不是線性的正相關(guān)[16]。因此，本試驗(yàn)對(duì)木質(zhì)素降解菌進(jìn)行第2次篩選時(shí)，選用液體產(chǎn)酶試驗(yàn)以便綜合考慮菌株產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的能力，獲得降解木質(zhì)素能力較強(qiáng)的白腐真菌。

2.2 木質(zhì)素降解酶系酶活對(duì)比分析

2.2.1 產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活的比較

用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本計(jì)算，Orign軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，LSD法檢驗(yàn)差異顯著性，顯著水平設(shè)置為P=0.05。由圖2可知，5株白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活曲線隨時(shí)間的變化都是先升高，直到達(dá)到酶活高峰，然后開(kāi)始下降。AP8、AP3 這2株菌株產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶能力最強(qiáng)時(shí)間都是在第7天，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活分別為112.28、119.42 U/mL。AP9在第9天酶活最高，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活為95.71 U/mL。AP6和AP7則是在第11天時(shí)出現(xiàn)酶活高峰，最高酶活分別為87.84、90.16 U/mL。5株白腐菌最高木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活大小順序?yàn)锳P3>AP8>AP9>AP7>AP6，5株菌株酶活最低時(shí)與酶活最高時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶活值差異顯著(P<0.05)。

圖2 菌株產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶酶活隨時(shí)間的變化

2.2.2 產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶酶活的比較

由圖3可以看出，AP9產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶出現(xiàn)的最高峰在第9天，錳過(guò)氧化物酶酶活為97.95 U/mL。AP8和AP3產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶的最佳時(shí)間都是在第7天，最高酶活分別為116.55、124.35 U/mL。而AP6和AP7則是在第11天產(chǎn)酶能力最高，最高酶活分別為85.17、92.62 U/mL。5株白腐菌錳過(guò)氧化物酶最高酶活大小順序?yàn)锳P3>AP8>AP9>AP7>AP6，差異顯著(P<0.05)。

圖3 菌株產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶酶活隨時(shí)間的變化

2.2.3 產(chǎn)漆酶酶活的比較

由圖4可以看出，AP9、AP6、AP7產(chǎn)漆酶的高峰期出現(xiàn)在第7天，而AP8、AP3產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)時(shí)間出現(xiàn)在第9天。5株菌株產(chǎn)漆酶能力大小差異顯著(P<0.05)。其中，AP3產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)，酶活為173.45 U/mL，AP6產(chǎn)漆酶能力最弱，酶活為141.75 U/mL。AP9和AP7產(chǎn)漆酶能力一般，最高酶活分別為151.67、156.95 U/mL。5株白腐菌最高漆酶酶活大小順序?yàn)锳P3>AP8>AP7>AP9>AP6。

圖4 菌株產(chǎn)漆酶酶活隨時(shí)間的變化

白腐菌的生長(zhǎng)狀況與它們分泌的木質(zhì)素酶系的酶活高低有一定的關(guān)系，在菌株生長(zhǎng)的初期，菌株不斷消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供自身生長(zhǎng)需要，菌落逐漸增多，該階段主要是菌株生長(zhǎng)時(shí)期，因而菌株分泌的3種酶都較少；之后3種酶酶活逐漸增大直到達(dá)到最高峰，這是因?yàn)榫赀M(jìn)入了次生代謝階段，菌株不斷分泌3種酶；高峰期后酶活開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，抑制了菌株的生長(zhǎng)，而且培養(yǎng)基中菌株產(chǎn)生大量的代謝廢物也會(huì)使其生長(zhǎng)受到抑制，出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象[17]。

對(duì)5株菌株15 d內(nèi)產(chǎn)酶量的變化進(jìn)行分析比較，可以發(fā)現(xiàn)AP8和AP3木質(zhì)素降解酶系的多種酶酶活均顯著高于其他3株菌株，且達(dá)到酶活高峰的時(shí)間要早于另外3株菌株。綜合考慮，將AP8和AP3作為復(fù)篩菌株。同時(shí)由圖2、圖3、圖4可以看出，5株菌株在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)漆酶高，且產(chǎn)少量的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶。

2.3 麥麩木質(zhì)素降解能力的比較

木質(zhì)素的降解與酶活關(guān)系密切。由圖2、圖3、圖4可以看出，AP8和AP3產(chǎn)酶效果都較好，但從表2可以看出，AP3對(duì)麥麩木質(zhì)素的降解率明顯高于AP8，這可能是因?yàn)?種菌株自身的適應(yīng)能力和產(chǎn)酶能力不同，從而造成對(duì)木質(zhì)素降解有差異[18]。AP3產(chǎn)酶量高且產(chǎn)酶速度快，對(duì)麥麩木質(zhì)素降解效果最佳，因而，選取AP3作為最優(yōu)菌株，對(duì)麥麩木質(zhì)素進(jìn)行降解。

表2 不同菌株對(duì)麥麩木質(zhì)素的降解效果

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)木質(zhì)素降解酶系多種酶酶活的比較，從9株白腐菌中篩選出1株高效降解麥麩纖維的菌株AP3。麥麩纖維經(jīng)AP3液態(tài)發(fā)酵15 d后，木質(zhì)素降解率達(dá)到了36.24%。此外，在菌株產(chǎn)酶比較分析中發(fā)現(xiàn)，AP3在產(chǎn)酶時(shí)能分泌較多的漆酶，產(chǎn)生較少的木質(zhì)素過(guò)氧化酶和錳過(guò)氧化物酶。這可能是因?yàn)锳P3在改性木質(zhì)素時(shí)是以漆酶為主導(dǎo)的，漆酶在木質(zhì)素降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用。關(guān)于其特有的降解機(jī)制將在后期試驗(yàn)中進(jìn)行分析探討。

本試驗(yàn)是研究木質(zhì)素降解菌的初期階段，下一階段試驗(yàn)是對(duì)AP3液體深層發(fā)酵麥麩的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高漆酶的產(chǎn)酶量，達(dá)到對(duì)麥麩纖維良好的降解效果。

小麥麩皮是我國(guó)重要的農(nóng)副產(chǎn)品，因此，研究木質(zhì)素降解菌，從而高效改性小麥麩皮，對(duì)其開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。