檢疫性有害生物李痘病毒生物學特性及預防控制技術(shù)

王 浩， 萬方浩,2， 于 翠， 武 強， 張桂芬,2*

1中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物有害生物綜合治理重點實驗室，北京100193； 2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外來入侵生物預防與控制研究中心，北京100193； 3上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135

李痘病毒(Plumpoxvirus, PPV)為馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒組成員，位列造成危害最嚴重和研究熱點的十大植物病毒之一(崔曉艷等,2013)，在核果類果樹上引起巨大的損失。該病毒最先在歐洲東部的保加利亞被發(fā)現(xiàn)(Atanassov,1932)，并迅速傳播至歐洲大部分地區(qū)和地中海沿岸區(qū)域(OEPP/EPPO,2006)，之后又在南美洲的智利(1992年)(Rosalesetal.,1998)，以及北美洲的美國(1999年)(Levyetal.,2000b; Promed,2006; Snover-Cliftetal.,2007)、加拿大(2000年)(Thompsonetal.,2001)等國家被發(fā)現(xiàn)，目前已在56個國家和地區(qū)有發(fā)生和報道(CABI,2019)。PPV在核果類果樹上的危害已引起各國的高度關(guān)注，是歐洲和地中海植物保護組織(European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO)A2類檢疫性有害生物(OEPP/EPPO,2004)，也是加拿大、美國、以色列、阿根廷等國家的限制性有害生物(鄭耘等,2009; Lláceretal.,1985; Wetzeletal.,1991a)，2004年中國湖南發(fā)現(xiàn)其危害杏樹(Navratiletal.,2005)，2007年我國將其列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。

PPV毒力強、株系多、危害大、風險高。本文擬從該病毒的生物學特性、傳播擴散途徑、診斷檢測方法及預防控制技術(shù)等方面進行闡述，以期為阻止PPV隨果樹花卉種苗再次傳入和進一步傳播擴散提供借鑒。

1 生物學特性

1.1 寄主植物

在自然條件下，李痘病毒主要侵染薔薇科Rosaceae的李屬Prunus核果類果樹，包括杏P.armeniaca、桃/碧桃P.persica、歐洲李/杏梅P.domestica、李子P.salicina、櫻桃李/紅葉李P.cerasifera、中國李/日本李子P.salicina及其雜交種，以及甜櫻桃/歐洲大櫻桃P.avium、山桃P.davidiana、圓葉櫻桃P.mahaleb等(Jamesetal.,2013)；亦可偶爾侵染扁桃P.dulcis(Llácer & Cambra,2006)。此外，PPV的其他自然寄主還有刺李/黑刺李P.spinosa、貝西櫻桃/西方沙櫻桃P.besseyi、毛櫻桃P.tomentosa、麥李P.glandulosa、郁李P.japonica、櫻桃/野櫻桃P.serotina、櫻李梅Prunus×blireiana、榆葉梅P.triloba等(James & Thompson,2006)，以及歐洲女貞Ligustrumvulgare和歐洲衛(wèi)矛Euonymuseuropaea(Polák,2001)等。

1.2 危害癥狀

李痘病毒可以在寄主植物的花期、果期以及營養(yǎng)生長期侵染，且葉片、枝條、花瓣、果實、樹皮及果核均可表現(xiàn)癥狀(CABI,2019; Cambraetal.,2019)。其中，春季桃樹葉片上的癥狀尤為明顯，包括褪綠斑點、條斑或環(huán)斑，以及脈明甚至畸形，而且有些桃樹品種還會出現(xiàn)斷花或破花癥狀(Barbaetal.,2011)；果實上則常會出現(xiàn)褪綠斑點或環(huán)形斑(CABI,2019; Cambraetal.,2019)。罹病的李子或杏常在葉片和果樹上出現(xiàn)典型的痘泡癥狀，果實畸形、果肉褐變或黑化、未熟先落等；杏和歐洲李子果實的畸形癥狀與蘋果褪綠葉斑病毒Applechloroticleafspotvirus引起的癥狀極為相似(Cambraetal.,2019)；而在杏核上則會出現(xiàn)灰白色環(huán)形斑或斑點，種子褪綠、頂梢枯死等(Dunez,1987)。通常，PPV的危害癥狀與發(fā)生地點、發(fā)病季節(jié)以及李屬植物的種、品種和侵染的植物組織(葉片或果實)等密切相關(guān)(Dosbaetal.,1986; Kegler & Hartmann,1998; Nemchinovetal.,1998a)。

1.3 株系

根據(jù)癥狀學、致病性、宿主范圍、媒介蚜蟲的傳播方式、流行病學、基因組序列等差異，李痘病毒的分離物可分為9個單源株系，即D(Dideron)、M(Marcus)、EA(E1Amar)、C(櫻桃)、W(Winona)、Rec(重組)、T(土耳其)、CR(俄羅斯櫻桃)和An(始祖Marcus)株系等(Jamesetal.,2013)。其中D和M株系是較為流行的2種株系(CABI,2019; Cambraetal.,2019)。D株系最早發(fā)現(xiàn)于法國杏樹上，并在北美洲的美國、南美洲的智利等國家嚴重危害，但經(jīng)蚜蟲傳播后，其侵染植株的能力變?nèi)?，而且蚜蟲的傳毒效率比較低(Levyetal.,2000a)。M株系最早發(fā)現(xiàn)于希臘的桃樹上，在歐洲廣泛分布，且只在桃樹上發(fā)生，蚜蟲對其傳播能力較強，侵染植株的能力亦較強，在李痘病毒的9個株系中，該株系是侵染力最強的株系(Cambraetal.,2019; Levyetal.,2000a)。EA株系主要分布于北非地區(qū)，可侵染杏樹。在埃及，當天氣炎熱、氣溫較高時，其侵染癥狀并不表現(xiàn)(Llácer,2006)；并且EA株系與D和M株系在RNA序列上存在差異(Wetzeletal.,1991a)。一些歐洲國家鑒定出侵染甜櫻桃和酸櫻桃P.cerasus的PPV分離物，被分別命名為C株系和CR株系，在意大利、匈牙利、保加利亞、摩爾多瓦等國家均有分布(Cambraetal.,2019; Crescenzietal.,1995,1997; Kalashyanetal.,1994; K?lberetal.,1997; Nemchinov & Hadidi,1996; Nemchinovetal.,1995,1996,1998a,1998b; Topchiiska,1991,1996)；C株系在生物學、血清學和分子特性上與其他李痘病毒株系存在顯著差異。W株系于加拿大發(fā)現(xiàn)(Jamesetal.,2003; James & Varga,2005)，但據(jù)報道，該株系可能起源于歐洲，且至今在歐洲仍然存在(Croftetal.,2008)。Rec株系是D株系和M株系自然重組形成的重組型株系，具有共同的系統(tǒng)發(fā)育聯(lián)系，最早在歐洲東部的斯洛伐克發(fā)現(xiàn)(Glasaetal.,2002,2004)。T株系是近期土耳其報道的另外一種重組株系分離物(Ulubaetal.,2009)。An株系推測可能是M株系的一個先祖(Palmisanoetal.,2012)。此外，近年還有人提出了一新的酸櫻桃適應(yīng)性假定株系(Tat)，該假定株系既非C株系亦非CR株系(Chirkovetal.,2016)。

此外，有報道顯示，在意大利、德國、摩爾多瓦和匈牙利等歐洲國家，PPV的C株系可以自然侵染酸櫻桃和甜櫻桃/歐洲大櫻桃(Crescenzietal.,1995,1997; Nemchinovetal.,1996,1998a)；并且，該株系已經(jīng)借助人工嫁接或媒介昆蟲將PPV傳播給了其他核果類果樹(Crescenzietal.,1997; Kalashyanetal.,1994; Nemchinovetal.,1996)。此外，多數(shù)野生或觀賞型李屬種類可以通過蚜蟲取食、人工嫁接等方式，感染PPV的D株系(Damsteegtetal.,1997)。

1.4 環(huán)境適應(yīng)性

PPV喜歡溫帶—中溫帶的氣候條件(最冷月平均溫度0～18 ℃，最熱月平均溫度10 ℃以上)，對終年潮濕的暖溫帶氣候(溫暖季平均溫度>10 ℃，寒冷季平均溫度>0 ℃)亦能忍受(CABI,2019)。PPV具有比較廣的溫度適應(yīng)范圍，最熱月平均最高氣溫30～40 ℃、最冷月平均最低氣溫-25～0 ℃的溫度范圍均適合其發(fā)生。此外，其對降雨量亦無特殊需求，干旱季節(jié)(月降雨量<40 mm)持續(xù)時間1～2 m、年平均降雨量0～900 mm，對該病毒發(fā)生均無明顯不利影響(CABI,2019)。

2 傳播擴散方式

2.1 介體傳播

蚜蟲是PPV的主要傳播媒介，有翅蚜在染病植株上取食危害后多遷飛到其他植株上繼續(xù)刺吸取食，因此，受PPV侵染的植株數(shù)量常與有翅蚜的種群密度密切相關(guān)(CABI,2019)。Gottwaldetal. (1995)分析西班牙東部蚜蟲傳毒的空間分布格局后認為，蚜蟲可以將PPV傳播到幾株樹以外的植株上，而不是直接傳播到緊鄰的植株上。蚜蟲主要以非持久性方式傳播PPV，可從感病植株的葉片、花或果實以幾秒鐘到幾分鐘的速度快速獲取病毒，并能在幾分鐘內(nèi)將病毒傳給新的植株，而且不存在潛伏期(CABI,2019)。目前，已知的能傳播李痘病毒的蚜蟲共計14種，包括苜蓿蚜Aphiscraccivora、黑豆蚜A.fabae、棉蚜A.gossypii、常春藤蚜A.hederae、繡線菊蚜A.spiraecola、李薊圓尾蚜Brachycauduscardui、杏圓尾蚜B.helichrysi、桃黑短尾蚜B.persicae、桃大尾蚜/梅大尾蚜Hyalopteruspruni、桃蚜Myzuspersicae、桃卷葉蚜M.varians、忽布疣蚜Phorodonhumuli、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi、麥無網(wǎng)長管蚜Metopolophiumdirhodum等。而這些蚜蟲多為世界性分布，如棉蚜、桃蚜、苜蓿蚜等。

2.2 人為傳播

李痘病毒主要通過帶毒的種子或砧木、苗木等繁殖材料，借助人類活動(種苗流通、嫁接等)進行遠距離傳播；而短距離擴散主要依賴帶毒媒介蚜蟲(CABI,2019)。嫁接傳播是疫區(qū)病害擴散的最主要方式，尤其是使用未經(jīng)認證許可的繁殖材料；李痘病毒在區(qū)域間或國家間的傳播，亦與使用未經(jīng)認證的繁殖材料密切相關(guān)(Diekmann & Putter,1996)。如，在東歐出口到美國的果樹材料上時常截獲到PPV(Waterworth,1994)。

2.3 種子傳播

盡管種殼和子葉均可檢測到李痘病毒，但其胚胎組織和幼苗不表現(xiàn)出任何癥狀，且酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和PCR檢測亦均呈PPV陰性。迄今為止，沒有任何PPV分離株被發(fā)現(xiàn)可以通過種子傳播。因此，PPV從染病母株向其后代垂直傳播的可能性很小(Pasquini & Barba,2006)。

3 經(jīng)濟影響

李痘病毒對很多國家核果類果樹(杏、李、桃等)的安全生產(chǎn)存在巨大風險，而且已經(jīng)對發(fā)生國植物材料的出口認證帶來了不利影響。如，PPV嚴重影響歐洲的水果產(chǎn)業(yè)(Kegler & Hartmann,1998; Nemchinovetal.,1998a; Németh,1994)，尤其是在歐洲的中部和東部區(qū)域，并不斷向埃及(Mazyadetal.,1992; Wetzeletal.,1991a)、西班牙(Lláceretal.,1986)、葡萄牙(Louro & Monte,1986)以及智利(Herreraetal.,1998)等地中海沿岸國家擴散。特別是核果類果樹，一旦被感染便損失慘重，部分高感品種直接產(chǎn)量損失高達83%～100%(Kegler & Hartmann,1998; Nemchinovetal.,1998a; Waterworth & Hadidi,1998)。此外，PPV危害造成的間接經(jīng)濟損失亦不能小覷；據(jù)估算，自20世紀70年代以來，全球每年用于與李痘病毒防治相關(guān)的費用(不包括間接貿(mào)易成本)達100億歐元(Cambraetal.,2006)。

4 診斷檢測方法

4.1 生物學鑒定

生物學鑒定方法，即通過汁液摩擦或嫁接將PPV接種到指示植物/鑒別寄主上，根據(jù)鑒別寄主表現(xiàn)特征的不同，從而達到鑒定病毒的目的。迄今，生物學鑒定法依然是病毒鑒定的一種基礎(chǔ)方法(谷大軍和張琪靜, 2013)。李痘病毒的指示植物主要有紅葉李栽培品種GF31、桃砧木品種GF305，以及李和山桃雜交后的栽培品種Nemaguard或毛櫻桃等；用于生物學鑒定的指示植物/鑒別寄主的物候期為幼苗期(CABI,2019)。此外，由紅葉李栽培品種GF31、桃砧木品種GF305和毛櫻桃雜交種(IR473×IR474)構(gòu)成的組合鑒別寄主，接種6～8周后即能表現(xiàn)癥狀，可用于區(qū)分李痘病毒的M株系和D株系(CABI,2019; Damsteegtetal.,1997)。

4.2 免疫學法

應(yīng)用最為廣泛的免疫學方法是酶聯(lián)免疫吸附測定法，該方法首次應(yīng)用于李痘病毒的檢測，可明確根、樹皮、花、葉、果實或種子中是否帶毒(Adams,1978)。尤其對于大量樣本的篩選檢測，ELISA法是首選(Cambraetal.,2019)。此外，利用PPV的單克隆和多克隆抗體不僅可以檢測鑒定PPV，還可鑒定其所有的9個株系。如，單克隆抗體5B-IVIA可有效區(qū)分M、D、EA和C株系(Cambraetal.,1994)；同時，該方法還可用于定量檢測(Himmleretal.,1987)。此外，基于透射電鏡(亦即免疫電鏡)(Kerlanetal.,1981)和膠體金染色法(Himmleretal.,1989)亦可用于PPV檢測。馬潔等(2012)研發(fā)的由2個單克隆抗體混合的酶聯(lián)免疫吸附TAS-ELISA(三抗體夾心ELISA, triple antibody sandwich ELISA)試劑盒可檢測D和M株系，且特異性強，在PPV檢測鑒定中具有重要作用。

4.3 分子生物學法

分子生物學技術(shù)方法的應(yīng)用，大大提高了PPV檢測的靈敏度、準確性和檢測效率(鄭耘等, 2008)。目前，于PPV檢測的分子生物學方法主要有PCR法、實時熒光反轉(zhuǎn)錄PCR(real-time fluorescent reverse transcription PCR, real time RT-PCR)法、雙重PCR法(diplex PCR)、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)(Varga & James,2006)、基因芯片(DNA chip)技術(shù)、新一代測序技術(shù)(Rodamilansetal.,2014)等。PCR技術(shù)使PPV的檢測靈敏度達到了10 fg純化病毒RNA(Wetzeletal.,1991b)；免疫技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合的免疫PCR(immuno PCR, IPCR)技術(shù)，以及PPV高靈敏度生測技術(shù)—免疫捕捉PCR(Immunocapture-PCR, IC-PCR)檢測技術(shù)也已研發(fā)成功(Candresseetal.,1994,1998)。而后，印記捕獲PCR(imprint capture PCR)替代IC-PCR技術(shù)，該方法無需樣本研磨，且在捕獲階段可以許多蛋白替代PPV特異的免疫球蛋白(Candresseetal.,1998)。實時熒光反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)亦已用于檢測PPV，并可穩(wěn)定地檢測出0～20 fg的病毒RNA(Schneideretal.,2004)，并可用于株系鑒定(高雅紅等，2011)。多重RT-PCR(multiplex RT-PCR)檢測技術(shù)相較于ELISA或分子雜交分析更加靈敏、經(jīng)濟、省時，且能快速區(qū)分PPV與其他核果類果樹病毒(Sánchez-Navarroetal.,2005)。將基于核酸序列的擴增法與快速導流雜交法相接合用于PPV檢測，其檢測靈敏度比ELISA法提高1000倍(Olmosetal.,2007)。而直接實時PCR(direct real-time PCR, drtPCR)技術(shù)可用于田間樣本的規(guī)?；瘷z測(Kimetal.,2008)。目前，使用的血清學和分子檢測方法一般情況下均可鑒定出PPV的D和M株系(Cambraetal.,2019)；陳定虎等(2017)研發(fā)的基因芯片檢測技術(shù)，可快速擴增6個株系(即D、M、EA、C、W和Rec株系)中的任一株系，且檢測結(jié)果直觀、準確，在口岸檢疫中具有舉足輕重的作用?；魜喸?2018)研究建立的李痘病毒恒溫擴增檢測技術(shù)，不僅特異性好，還能快速區(qū)分多種核果類果樹病毒，可以在實驗室及海關(guān)推廣使用。

5 預防控制技術(shù)

5.1 檢疫措施

鑒于李痘病毒可通過種苗傳帶，一方面要加強口岸檢疫，防止該病毒跨境傳入我國，尤其以生產(chǎn)為目的引進果樹和花卉種苗，要在海關(guān)總署指定的進境口岸入境，且要根據(jù)引進目的在隔離檢疫圃隔離種植至少2個生長季，觀察并檢測植株是否帶毒；另一方面要加強調(diào)運檢疫，在種苗調(diào)運前要進行嚴格的產(chǎn)地檢疫、調(diào)運檢疫、種苗復檢、田間監(jiān)測等，對湖南等地的李痘病毒進行跟蹤監(jiān)測，防止通過國內(nèi)花卉苗木的調(diào)運進一步傳播和擴散蔓延。

5.2 徹底清除感病植株

在新果園建立前應(yīng)徹底清除李痘病毒侵染過的所有核果類果樹，此乃有效清除PPV的唯一途徑，在輕度感染地區(qū)新果園的建設(shè)中尤為重要和適用。在已發(fā)病果園，采取生長期專業(yè)人員檢測、徹底銷毀陽性發(fā)病株及其周邊500 m內(nèi)的植株等措施，對PPV亦能起到明顯的控制作用(谷大軍和張琪靜,2013; Gougherty,2011)。

5.3 控制傳播媒介

蚜蟲是李痘病毒的主要傳播媒介。通常，有效的控制方法就是在認證體系下種植健康植株，定期施用殺蚜劑防治蚜蟲，并銷毀果園中所有的病株，這些方法在法國、意大利等國家常被用于抑制李痘病毒的發(fā)生(Barba,1998; Kegler & Hartmann,1998)，且收效顯著。

5.4 選育抗病或耐病品種

借助常規(guī)育種或通過轉(zhuǎn)基因選擇育種，培育或選育抗病或耐病品種是控制李痘病毒最有效的途徑(Cmaraetal.,1992; Escalettesetal.,1994; Ravelonandroetal.,1998; Scorzaetal.,1998)。通過不同類型或不同PPV抗性機制，已經(jīng)培育或選育出抗PPV的李、杏、桃和油桃等新品種(Hartmann,1998; Kegler & Hartmann,1998; Lahmatovaetal.,1998; Papr?teinetal.,1998; Rankovi & Paunovi,1989; Scorzaetal.,2007; Tomaetal.,1998)。

5.5 繁育無毒苗木

病毒在染病植株上的分布并非一致。通常，在老葉以及成熟的組織和器官中病毒的含量較高，嫩葉及未成熟的組織和器官中的含量較低，而生長點則幾乎不含病毒(陳正華,1986)。據(jù)此，利用微莖尖(<0.2 mm)脫毒原理(曹孜義,1998)進行脫毒，即可獲得無毒苗木。目前，該技術(shù)在我國已用于杏的脫毒以及組培快繁(鄧成軍等,2005)。

6 展望

李痘病毒僅在我國局部區(qū)域分布，但其對核果類果樹的危害嚴重，潛在威脅巨大，加之PPV可以借助李屬果樹或花卉繁殖材料遠距離傳播擴散，而我國每年從國外輸入的李屬果樹種子、砧木、芽條以及果實等的數(shù)量較大，漏檢或假陰性現(xiàn)象時有發(fā)生，因此，再次傳入我國及進一步傳播擴散的可能性極大。而且，我國桃、李、杏等核果類果樹和花卉隨處可見，適于其侵染的品種也是我國南北方的主栽品種，栽培面積大(鄭耘等,2008)。此外，傳播PPV的主要媒介蚜蟲在我國亦多有分布，且我國的氣候類型與PPV主要疫區(qū)歐洲國家的氣候類型非常相似，均為PPV在我國的成功定殖乃至暴發(fā)成災(zāi)提供了可能。因此，應(yīng)加強口岸進境核果類種子、砧木、芽條等繁殖材料檢驗檢疫工作，杜絕傳染源，切斷其傳入途徑，確保我國核果類果樹和園林花卉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。