馬鈴薯甲蟲(chóng)結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物基因LdTSC1和LdTSC2基因的克隆及功能分析

廖蘭蘭， 付開(kāi)赟， 常 瑞, 丁新華， 何 江， 吐?tīng)栠d·阿合買提， 任 羽 , 郭文超

1塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300； 2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091； 3新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后流動(dòng)站，新疆 烏魯木齊 830091； 4喀什大喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844006； 5新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，新疆 烏魯木齊 830091；

TSC1-TSC2即結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2 (Tuberous sclerosis complex1/2)，屬于抑癌基因，位于蛋白激酶B(Akt)下游，是PI3K (phosphoinositide 3-kinase)-AKT信號(hào)通路重要的調(diào)控位點(diǎn)。在昆蟲(chóng)體內(nèi)，TSC1和TSC2直接形成異二聚體(TSC1/TSC2)，作為關(guān)鍵抑制性信號(hào)整合器發(fā)揮作用，可整合生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)、能量、細(xì)胞因子、胞外基質(zhì)及環(huán)境脅迫等刺激信號(hào)，從而調(diào)節(jié)雷帕霉素靶標(biāo)信號(hào)通路(mammalian target of rapamycin, mTOR)，進(jìn)而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、增殖及凋亡。

昆蟲(chóng)的類胰島素信號(hào)通路(insulin/insulin-like peptide signaling pathway， IIS)具有多種功能，主要控制體內(nèi)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)蛋白質(zhì)、糖、脂肪的代謝和貯存。除此之外，在生殖、壽命、協(xié)調(diào)新陳代謝和營(yíng)養(yǎng)物利用率相關(guān)的生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要作用(Vafopoulou & Xanthe,2014)。除黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和家蠶BombyxmoriL.外， IIS在其他昆蟲(chóng)中僅有零星報(bào)道。在果蠅中，TSC1或dTSC2的失活都能增加細(xì)胞體積和促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之,TSC1和TSC2共同過(guò)表達(dá)會(huì)減小細(xì)胞體積，這些發(fā)現(xiàn)支持TSC1和TSC2可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的觀點(diǎn)(Potter,2001)。IIS-TORC1信號(hào)整合生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)和能量信號(hào)調(diào)控細(xì)胞和個(gè)體的生長(zhǎng)(周順和李勝,2012)。TSC2是Akt下游在脂肪誘導(dǎo)細(xì)胞分化的關(guān)鍵底物，脂肪細(xì)胞分化必需激活mTORC1(Zhangetal.,2009)。研究表明，馬鈴薯甲蟲(chóng)LeptinotarsadecemlineataSay (Colorado potato beetle)幼蟲(chóng)經(jīng)口攝入dsILP2(insulin-like protein)后，其體重、化蛹率和羽化率受嚴(yán)重影響(Fuetal.，2016)。近期，在果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)，DOR (a new co-activator for the ecdysone receptor)是連接IIS信號(hào)和蛻皮激素(molting hormone， MH)信號(hào)參與調(diào)控昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育時(shí)期代謝平衡的關(guān)鍵蛋白原因(Rénald & Pierre,2010)。ILP可刺激家蠶和長(zhǎng)虹錐蝽RhodniusprolixusSt?l前胸腺分泌蛻皮激素(molting hormone, MH) (Guetal.,2012)，促進(jìn)煙草天蛾Manducasexta(Poster)前胸腺的生長(zhǎng)(Kemirembeetal.,2012; Smithetal.,2014; Walsh & Smith,2011)；在前胸腺以外的器官，ILPs還可刺激埃及伊蚊Aedesaegypti(L.) (Wenetal.,2010)和黑腹果蠅(Jarosch & Moritz,2011)在卵巢中合成和分泌MH。在果蠅中樞分泌細(xì)胞npc1與npc2突變體，具有幼蟲(chóng)致死的表型。實(shí)驗(yàn)證明,果蠅的蛻皮激素的缺失是npc缺失品系幼蟲(chóng)致死的主要原因(黃勛,2007)。以上結(jié)果表明，昆蟲(chóng)IIS通路和MH通路存在交叉對(duì)話的機(jī)制，但是具體通過(guò)何種方式、如何互相影響、其他類群昆蟲(chóng)中IIS的作用機(jī)制也都知之甚少。

馬鈴薯甲蟲(chóng)，屬鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae，是我國(guó)對(duì)外重大檢疫對(duì)象之一(郭文超,2013)。鈴薯甲蟲(chóng)對(duì)RNA干擾非常敏感，喂食dsRNA可有效敲低對(duì)應(yīng)的靶基因，便于研究 IIS下游關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因TSC1和TSC2的功能，為揭示 IIS調(diào)控幼蟲(chóng)蛻皮的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)合RNAi和qPCR，從被干擾馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)的糖脂代謝等生理指標(biāo)為切入點(diǎn)來(lái)探明LdTSC1/2的生理學(xué)功能，旨在鑒定馬鈴薯甲蟲(chóng)中IIS信號(hào)級(jí)聯(lián)關(guān)鍵因子TSC1和TSC2，弄清其生物學(xué)功能，為闡明IIS調(diào)節(jié)保幼激素(juvenile hormone， JH)和蛻皮激素信號(hào)途徑的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

馬鈴薯甲蟲(chóng)于2018年5月采自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠綜合試驗(yàn)場(chǎng)天敵資源繁育研究中心，飼養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光周期16 L∶8 D，相對(duì)濕度75%±5%。幼蟲(chóng)用新鮮馬鈴薯葉片飼喂，待發(fā)育至2齡開(kāi)始用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑TRIzol(Invitrogen公司)、DNA Marker(TaKaRa公司)、One Step Clonging kit(南京諾唯贊公司)、DNA凝膠回收試劑盒(Omega公司)、pEASY-T3載體感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金公司)、KpnⅠ和NOTⅠ(TaKaRa)、酵母提取液(yeast extract)和胰蛋白胨(tryptone)(Oxiod公司)、糖原含量測(cè)試盒、甘油三酯含量測(cè)試盒、葡萄糖含量測(cè)試盒和海藻糖含量測(cè)試盒(北京索萊寶公司)、總膽固醇(TC)含量測(cè)試盒(南京建成公司)。

1.3 鈴薯甲蟲(chóng)LdTSC1/2基因克隆

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)在線BLAST獲取馬鈴薯甲蟲(chóng)LdTSC1/2(GenBank登錄號(hào)；KR075833.1、KR075843.1)基因cDNA全長(zhǎng)，結(jié)合sidirect在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)(http:∥sidirect2.rnai.jp/)300 bp左右高特異性siRNA片段,利用Primer 5.0設(shè)計(jì)克隆引物，引物設(shè)計(jì)相見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)；cDNA模板1 μL，dNTP 1 μL，10×Mg2+Buffer2.5 μL，上下游引物各1 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件；94 ℃60 s；94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃2 min，循環(huán)40次；72 ℃10 min。反應(yīng)完成后樣品通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)條帶切膠并參照膠回收試劑盒回收片段。

表1 用于構(gòu)建dsRNA原核表達(dá)載體的引物

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和多重序列對(duì)比分析

通過(guò)NCBI blastx搜索、挑選并下載近緣種TSC1及TSC2序列，利用ClustalX 2.0進(jìn)行序列比對(duì)，在GeneDoc中處理獲得最終效果圖。經(jīng)ClustalX 2.0比對(duì)獲得結(jié)果，在MEGA 7.0.26中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，選擇模型為鄰接法，替代模型為泊松模型，自展次數(shù)1000次。

1.5 馬鈴薯甲蟲(chóng)LdTSC1/2基因功能的RNAi分析

1.5.1 dsRNA原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌EscherichiacoliHT115(DE3) RNaseⅢ缺失品系和pET-2p dsRNA表達(dá)載體均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送。載體構(gòu)建方法參照Fuetal. (2014)，用于構(gòu)建dsTSC1和dsTSC2，dsEGFP為對(duì)照，PCR克隆獲得。以1.3節(jié)中獲得的各個(gè)組織的混合模板cDNA 1.0 μL，參照TaKaRa公司rTaq反應(yīng)體系以25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行克隆，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min。反應(yīng)獲得的片段連入全式金公司pEasy-T3載體，最終挑取獲得的陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞測(cè)序，測(cè)序獲得的結(jié)果通過(guò)GeneDoc比對(duì)序列的正確性。驗(yàn)證的片段通過(guò)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并提取含有片段的Transit-T1載體，通過(guò)KpnⅠ和NotⅠ酶切產(chǎn)生黏性末端，目標(biāo)片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離后通過(guò)膠回收純化，利用T4連接酶連入已通過(guò)KpnⅠ和NotⅠ產(chǎn)生黏性末端的pET-2p載體，連接完成的載體轉(zhuǎn)入HT115 (DE3)細(xì)胞中在含有卡那霉素(50 μg·mL-1)和四環(huán)素(12.5 μg·mL-1)的固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，并通過(guò)測(cè)序和異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside， IPTG)誘導(dǎo)發(fā)酵dsRNA驗(yàn)證結(jié)果。誘導(dǎo)發(fā)酵的步驟參照呂東(2010)，在菌液重新擴(kuò)大培養(yǎng)至D600 nm=1.0時(shí)加入IPTG至終濃度為0.1 mmol·L-1，發(fā)酵表達(dá)dsRNA 6 h即可獲得穩(wěn)定表達(dá)的濃度約為0.05 μg·μL-1的dsRNA。以上所用試劑盒均按照其說(shuō)明書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行。

1.5.2 喂食dsRNA菌液的制備 將已構(gòu)建好的pET-2p-TSC1/2大腸桿菌表達(dá)載體，在含有100 μg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中以體積比1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，于37 ℃ 220 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)3.5 h，即D600 nm=1.0時(shí)，按1∶1000比例添加已經(jīng)配好的IPTG母液(母液濃度為0.0238 g·mL-1)，至終濃度為0.1 mmol·L-1，繼續(xù)恒溫震蕩45 h，以此過(guò)程獲得新鮮dsRNA。

1.5.3 喂食dsRNA的室內(nèi)生物測(cè)定 選取發(fā)育一致的2齡初孵幼蟲(chóng)，分別設(shè)置超純水與表達(dá)dsEGFP菌液為空白對(duì)照和陰性對(duì)照，每個(gè)處理30頭，其中10頭用于收樣，每個(gè)處理6組生物學(xué)重復(fù)，總計(jì)處理約720頭幼蟲(chóng)。將馬鈴薯葉片置于各處理的新鮮菌液中，將表達(dá)完成的菌液用CK稀釋5倍后均勻涂抹于馬鈴薯葉片上，待風(fēng)干后接入馬鈴薯甲蟲(chóng)，每24 h更換一次處理過(guò)的葉片，干擾3 d后更換新鮮葉片。干擾的第6天解剖收集足量的血淋巴和脂肪體(收集幼蟲(chóng)血淋巴樣本須立即放入有少許苯基硫脲的1.5 mL管中)；記錄0和72 h體重，每天觀察體表變化特征并記錄試蟲(chóng)死亡率，直至馬鈴薯甲蟲(chóng)出現(xiàn)化蛹跡象，將其轉(zhuǎn)移至土壤深度為512 cm的人工化蛹場(chǎng)地內(nèi)，觀察最終的死亡率、化蛹率及成蟲(chóng)羽化率。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

用Beacon Designer 7.3和GenScript在線網(wǎng)站(https:∥www.genscript.com/ssl-bin/app/primer)設(shè)計(jì)qPCR引物，參數(shù)選擇默認(rèn)。目的基因qPCR引物：LdTSC1上游引物5′-GGACAGGACAGCACTCTCAG-3′；下游引物5′-ACAACAGGGCCATTCAGCTA-3′。LdTSC2上游引物5′-TGACTTCGATTTAACAGATATCGT-3′；下游引物5′-CGGTAAGGCACTGCAAGG-3′。內(nèi)參基因?yàn)锳RF4和RP18 (Shietal.,2016),ARF4上游引物5′-GGACCTATCTTCAGCTATGCGT-3′；下游引物5′-CAATCCCTCGTGAAGGCCA-3′。RP18上游引物5′-ACTTCGTGTCACTGAAACTGC-3′；下游引物5′-TATCCGCACGACTTCCTGC-3′。

將收集的已調(diào)低LdTSC1/2的馬鈴薯甲蟲(chóng)利用Trizol提取(Invitrogen)總RNA，每一組樣品包含34的個(gè)體，每組處理具有3次生物學(xué)重復(fù)。反轉(zhuǎn)錄采用One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金)合成cDNA。qPCR反應(yīng)體系為20 μL；RNA使用1 μg，qPCR Mix Buffer 10 μL，qPCR上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye I 0.4 μL，剩余ddH2O補(bǔ)齊。qPCR的反應(yīng)步驟參考ABI 7300默認(rèn)反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均給出均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，qPCR數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，顯著性水平P<0.05；存活率、化蛹率和羽化率、RNA干擾的qPCR數(shù)據(jù)利用單因素ANOVA檢驗(yàn)，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯甲蟲(chóng)TSC1/2的多序列比對(duì)及進(jìn)化分析

在NCBI在線BLAST獲取馬鈴薯甲蟲(chóng)LdTSC1基因全長(zhǎng)，ORF包含3689 bp，編碼1019個(gè)氨基酸；LdTSC2基因全長(zhǎng)，ORF包含6011 bp，編碼1800個(gè)氨基酸。通過(guò)NCBI在線BLAST將馬鈴薯甲蟲(chóng)TSC1/2基因翻譯的氨基酸序列進(jìn)行相似性搜索比對(duì)，將多種昆蟲(chóng)的氨基酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，TSC1和TSC2基因編碼不同的蛋白(分為hamartin和tuberin)，序列之間沒(méi)有相似性。TSC1編碼一種分子量為130 ku的錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白(hamartin)，但沒(méi)有催化結(jié)構(gòu)域(圖1A)。TSC2編碼分子量為200 ku抗結(jié)核菌素蛋白(tuberin)，具有一個(gè)螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain)和一個(gè)與Rap-GTP酶激活蛋白(GAP)同源的C末端(圖1B)。

利用NJ系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)樹(shù)方法發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯甲蟲(chóng)LdTSC1與鞘翅目的玉米根螢葉甲DiabroticavirgiferaLeConteTSC1聚為一支(圖2)，自展一致度為100%；馬鈴薯甲蟲(chóng)LdTSC2與玉米根螢葉甲TSC2和赤擬谷盜TriboliumcastaneumHerbstTSC2聚為一支，自展一致度為100%；其他各目昆蟲(chóng)的TSC2各自聚成小類群，表明LdTSC2基因在進(jìn)化過(guò)程中較LdTSC1有更好的保守性。

2.2 dsTSC1/2對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)體重和化蛹率的影響

通過(guò)喂食馬鈴薯甲蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)原核表達(dá)的328/235 bp長(zhǎng)度的dsTSC1/2，能顯著降低靶標(biāo)基因的表達(dá)量較(圖3C、D)，較dsEGFP處理組分別降低240%和160%(P<0.05)。同時(shí)能顯著降低靶幼蟲(chóng)體重(圖3A)，較空白對(duì)照組，處理組幼蟲(chóng)平均分別降低22和23 mg(P<0.05)。相較空白對(duì)照組，處理能在幼蟲(chóng)的化蛹率也顯著降低(圖3B)，相較空白對(duì)照組降低了6.0%和5.0%(P<0.05)。

2.3 敲低LdTSC1/2對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)糖脂代謝及蛻皮激素合成的影響

與陰性對(duì)照試蟲(chóng)相比，敲低LdTSC1/2，其血淋巴中葡萄糖含量分別上升了2和3.4倍(圖4A)；脂肪體中的葡萄糖含量分別下降了700%倍和400%(圖4B) 。在敲低LdTSC1/2的幼蟲(chóng)中，在血淋巴中甘油三酯含量較陰性對(duì)照，分別降低了310%和330%(圖4C)；脂肪體中較陰性對(duì)照，分別降低了170%和220%(圖4D)。在敲低LdTSC1/2的幼蟲(chóng)中，海藻糖含量則均有上升；較陰性對(duì)照，在血淋巴中分別上升了1.2和1.1倍(圖4E)，在脂肪體中別上升了1.2和1.1倍(圖4F)。

圖1 TSC1/2蛋白的氨基酸序列比對(duì)

圖2 基于鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 敲除LdTSC1/2對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)體重(A)、化蛹率(B)及LdTSC1/2相對(duì)表達(dá)水平(C、D)的影響

3 討論與結(jié)論

研究顯示，敲低LdTSC1/2后，由于TSC1/2為反式調(diào)控元件基因，因此類胰島素信號(hào)上升，幼蟲(chóng)血淋巴和脂肪體的海藻糖均富集上升，葡萄糖含量顯著下降，表明幼蟲(chóng)的血淋巴和脂肪體中葡萄糖和海藻糖的相互轉(zhuǎn)化，海藻糖降解成葡萄糖和轉(zhuǎn)化為甘油三酯的過(guò)程均受阻,與Xuetal. (2013)的研究結(jié)果一致。敲低LdTSC1/2后，試蟲(chóng)攝入的葡萄糖進(jìn)入血淋巴后，在脂肪體內(nèi)轉(zhuǎn)化成海藻糖的速率降低，故血淋巴中葡萄糖高于對(duì)照；在脂肪體內(nèi)海藻糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖用于蟲(chóng)體的能量供應(yīng)，合成的海藻糖減少，故脂肪體內(nèi)的葡萄糖低于對(duì)照。

圖4 敲低LdTSC1/2對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)的糖脂代謝的影響

Taponeetal. (2001)在果蠅TSC1和TSC2/gigas基因中鑒定了突變，任一基因中的失活突變均導(dǎo)致生長(zhǎng)延長(zhǎng)，也和本研究中發(fā)現(xiàn)處理幼蟲(chóng)發(fā)育受阻的結(jié)果一致。本研究未從蛋白磷酸化水平研究TSC復(fù)合體受RNAi調(diào)控下對(duì)幼蟲(chóng)蛻皮的影響，并測(cè)定信號(hào)通路中其他節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)變化，在未來(lái)有待通過(guò)以上技術(shù)方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)明確TSC復(fù)合體的功能。

基于RNAi研究發(fā)現(xiàn)，TSC1和TSC2參與并調(diào)控海藻糖的合成和代謝，敲低LdTSC1/2會(huì)下調(diào)其表達(dá)量，其糖脂代謝也會(huì)阻滯，級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致蟲(chóng)體變小、死亡率升高及發(fā)育延遲。研究也為蛻皮激素或保幼激素參與類胰島素信號(hào)通路和RNAi生物技術(shù)作物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了理論依據(jù)，同時(shí)為RNAi技術(shù)篩選致死候選基因奠定了一定基礎(chǔ)。