電針干預基因修飾神經(jīng)干細胞移植調控 Notch 通路重建神經(jīng)環(huán)路研究進展

楊藝 譚龍旺 張勇

脊髓損傷 ( spinal cord injury，SCI ) 嚴重復雜，甚至危及生命，不但遠期預后差，且致殘率高[1-3]。在病理上可劃分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個階段[4]。最先出現(xiàn)脊髓組織和結構被破壞，繼而傷區(qū)發(fā)生缺血、缺氧、炎性反應、細胞凋亡等一系列變化，致使神經(jīng)元變性壞死、神經(jīng)膠質細胞修復功能被抑制、軸突慢性脫髓鞘，最終導致神經(jīng)功能障礙。筆者通過查閱大量文獻，結合目前 SCI 的病理機制，發(fā)現(xiàn)可以從基因修飾神經(jīng)干細胞移植、Notch 信號通路和電針這三個方面開展研究，為 SCI 后神經(jīng)環(huán)路的重建提供思路。現(xiàn)對以上三個方面進行詳細綜述。

一、基因修飾神經(jīng)干細胞移植

1. 神經(jīng)干細胞的來源：神經(jīng)干細胞屬于未分化的神經(jīng)祖細胞，可分化為具不同功能的各類型細胞如神經(jīng)元等，SCI 后其能通過自我更新、復制進而形成神經(jīng)組織[5-7]。1992 年研究者首次從大鼠腦組織紋狀體中分離出神經(jīng)干細胞[8]，隨后相繼于腦室周、齒狀回及海馬等部位發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞[9]。目前認為，成年哺乳動物的腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下層是神經(jīng)干細胞的獲取部位[10]。

2. 神經(jīng)干細胞的特點：神經(jīng)干細胞具有定向遷移、組織融合、免疫豁免性及多能性，且經(jīng)多次傳代后其基本特性保持不變，較易獲得、培養(yǎng)和增殖，移植入機體后能保持長期存活，對其研究具有不受倫理學問題困擾等優(yōu)勢[11]。神經(jīng)干細胞在含血清的培養(yǎng)基中通過球形懸浮生長和貼壁生長兩種方式逐漸伸展，進而形成軸突或樹突樣連接，最終分化為成熟神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞[12]。神經(jīng)干細胞表達的特征在于 CD133+、CD34-、CD45-的出現(xiàn)[13]，尤其是神經(jīng)元中間絲蛋白-神經(jīng)巢蛋白 ( nestin ) 的表達，但 nestin 出現(xiàn)時間較短，在有絲分裂后期即前體細胞分化成神經(jīng)元或膠質細胞時，其表達量便開始逐漸減少，神經(jīng)絲和膠質纖維酸性蛋白等特異性中間纖維的大量出現(xiàn)最終將其取代[14]。神經(jīng)干細胞未分化的這一自身特點決定了其具有免疫豁免性，表現(xiàn)為神經(jīng)干細胞不表達細胞抗原，因此將其移植入機體后免疫排斥的發(fā)生率大大降低。神經(jīng)干細胞還具有多能性，表現(xiàn)為它們分化的子細胞可以依據(jù)機體的需求，通過對稱分裂或不對稱分裂分化出神經(jīng)系統(tǒng)所需的各種類型細胞。兩種分裂方式的區(qū)別在于，不對稱分裂必定生成干細胞和前體細胞，而對稱分裂由于產(chǎn)生的細胞類型相同可能出現(xiàn)無干細胞生成或無前體細胞生成的結果[14]。

3. 神經(jīng)干細胞的移植途徑：SCI 后的前 7 天為急性期，機體會產(chǎn)生一系列炎性反應，至 41 天后逐漸轉為慢性期，此時纖維瘢痕已經(jīng)形成，若神經(jīng)干細胞于此兩階段移植入機體則均無成活可能。相反，在 8～41 天即亞急性期時，急性期表現(xiàn)的炎癥逐漸消退，毒性代謝產(chǎn)物和氧自由基減少，微環(huán)境得以改善的同時纖維瘢痕尚未形成，相對適合神經(jīng)干細胞存活、生長，故此階段最適宜將神經(jīng)干細胞移植入機體。目前主要有局部注射、經(jīng)腦脊液注射、經(jīng)血液循環(huán)注射三種神經(jīng)干細胞移植途徑[15]，但何種移植途徑最安全且有效尚無統(tǒng)一定論。局部注射移植通過立體定向將特定劑量神經(jīng)干細胞直接注射入病損腦區(qū)或脊髓周圍區(qū)域[16]，建立了新的突觸結構[17]，在替代凋亡的神經(jīng)細胞的基礎上預防了脊髓空洞癥的發(fā)生。經(jīng)腦脊液途徑移植是基于干細胞歸巢性和腦脊液循環(huán)理論將外源性干細胞注射入腦室、腦池。例如基于腦脊液循環(huán)理論可在腰椎穿刺時將神經(jīng)干細胞直接注射入蛛網(wǎng)膜下腔，使神經(jīng)干細胞通過腦脊液循環(huán)間接到達病損腦區(qū)。此移植途徑還包括利用腦室穿刺和枕大池穿刺的方法，但多見于基礎研究，臨床應用較少報道[18]。經(jīng)外周血液移植包括靜脈移植和動脈移植，靜脈移植是應用最早的移植方式，但操作時對細胞需求量大，且靶向療效較差[19]。動物實驗研究表明，神經(jīng)干細胞通過動脈移植較靜脈能在更短的時間內遷移至傷區(qū)替代凋亡的神經(jīng)細胞[20]，顯著降低了神經(jīng)干細胞的失活量和死亡率。

4. 基因修飾神經(jīng)干細胞移植治療 SCI 的機制：神經(jīng)干細胞有效到達傷區(qū)后開始更新、復制，并在局部微環(huán)境作用下誘導微血管再生，促使細胞定向分化為神經(jīng)前體細胞，釋放生長因子，建立新的軸突連接，修復損傷、壞死的神經(jīng)元。此外進一步研究發(fā)現(xiàn)，利用生長因子對神經(jīng)干細胞加以修飾后再移植到傷區(qū)，其生物效用將遠高于單一的細胞替代或基因治療。生長因子基因治療是采用基因轉染技術，通過為中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長提供一個適宜的微環(huán)境而促進其再生[21]。目前主要研究構建神經(jīng)營養(yǎng)因子 ( neurotrophic factors，NTFs ) 基因載體，通過基因轉染神經(jīng)干細胞，再將其移植于脊髓傷區(qū)，使之持續(xù)表達并充分發(fā)揮 NTFs 的生物學活性，進而促進神經(jīng)再生。NTFs 分兩大類，以神經(jīng)生長因子 ( nerve growth factor，NGF ) 為主的神經(jīng)營養(yǎng)素家族和睫狀 NTFs 等生長因子，后者主要包括堿性成纖維細胞生長因子 ( basic fibroblast growth factor，bFGF ) 和血管內皮生長因子 ( vascular endothelial growth factor，VEGF ) 等。

bFGF 是 Hoftman 在 1940 年從腦和垂體的抽提物中發(fā)現(xiàn)的一種促細胞分裂、活性廣泛的 NTFs 蛋白，不僅可以抑制神經(jīng)元凋亡還能提高神經(jīng)元成活率，促進軸突定向生長[22]。生理情況下 bFGF 在脊髓中表達水平低，一旦發(fā)生 SCI，則其呈高水平表達。表現(xiàn)在它可以抑制脊髓神經(jīng)元 c-fosm RNA 的活性進而促進少突膠質細胞和神經(jīng)元生長；可以促進損傷皮質周圍區(qū)域的星形膠質細胞增殖[23]，上調內皮細胞 β1 整合素表達以增強內皮細胞的黏附、識別和遷移以誘導新生血管形成；加快神經(jīng)干細胞向少突膠質祖細胞分化進而增加白質和皮質中少突膠質細胞的數(shù) 量[24]；抑制谷氨酸鹽的細胞毒性以保護神經(jīng)功能[25]；穩(wěn)定 Ca2+穩(wěn)態(tài)，拮抗缺氧、興奮性氨基酸、自由基等的損害，以改善脊髓水腫局部微環(huán)境而保護神經(jīng)元。

VEGF 是具有高度特異性的生長因子，主要由 7 個內含子和 8 個外顯子組成，包括 VEGF-A、VEGF-C 和 VEGF-E 等，可以促血管內皮細胞生長增殖、遷移，能夠對血管通透性起到誘導效應[26]。在 SCI 后局部低氧微環(huán)境條件下，VEGF 與內皮細胞膜上的受體相結合，使 VEGF 受體自身磷酸化并激活活化激酶，促進有絲分裂，使血管內皮細胞的血管得以再生[27]。已有研究表明，VEGF mRNA 的表達水平愈高，新生的血管數(shù)量愈多[28]。VEGF 通過調控血管的通透性及細胞的分化、遷移和增殖，有效改善了 SCI 局部微循環(huán)障礙，直接抑制了神經(jīng)細胞凋 亡[29]，由此進一步加快了神經(jīng)功能的恢復。

二、Notch 信號通路

1. Notch 信號通路的基本結構：Notch 信號通路在動物體內廣泛存在，在體內各細胞間轉導、傳遞各種信號，但表現(xiàn)有保守的特點，參與各細胞的整個生命階段，還涉及神經(jīng)干細胞的增殖和分化。Lassiter 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠 SCI 后敲除小鼠的 Notch1 受體、RBP-j 基因、γ- 分泌酶抑制劑 DAPT 甚或配體 Delta 造成 Notch 信號轉導發(fā)生障礙時，小鼠體內的神經(jīng)元可較快得到修復；而當 Notch 信號無障礙轉導時，則出現(xiàn)相反的結果。Notch 信號通路主要由三大部分組成，分別為 Notch 受體、Notch 配體和 CSL [ CBF1 ( C promoter Binding Factor-1 ) / Su ( H ) ( Suppr essor of Hairless ) / LAG-1 ]-DNA 結合蛋白[31]。

Notch 受體在本質上屬于跨越脂雙層的膜整合蛋白，其肽鏈長度約 300 kD，分為高度保守的細胞內、外區(qū)域和貫穿生物膜兩端的跨膜片段，是決定細胞命運的核心部分。其中，胞外部分存在基因序列的多拷貝現(xiàn)象，如表皮生長因子 ( epidermal growth factor，EGF ) 樣基因富含半胱氨酸的 Notch / Lin-12。Notch 的跨膜受體是類表皮生長因子域 7 ( epitcrmis-like growth factor domain 7，EGFL7 ) 結合分子，分泌性 EGFL7 可以識別 Notch 的某個區(qū)域，并在配體的信號作用下拮抗 Notch 信號。在哺乳動物體內 Notch 受體存在 Notch1、Notch2、Notch3 和 Notch4 共 4 個同源基因，其各亞型的 EGF 樣重復序列和胞內域的長度是不同的。Tatsumi 等[32]研究證實了 Notch1 受體存在于大腦皮層表面到髓質這 6 個層次中，可以觸發(fā) Notch 信號通路的轉導從而參與神經(jīng)系統(tǒng)的功能發(fā)揮。

Notch 配體也稱 DSL ( Delta / serrate / LAG22 ) 蛋白，含有 Delta 樣和 Serrate 樣配體，分別為 Delta-1、Delta-3、Delta-4 以及 Jagged-1 和 Jagged-2，它們都以短單向跨膜蛋白的形式存在于胞漿區(qū)。細胞外區(qū)域為不同 EGF 樣基因序列的多拷貝和保守的半胱氨酸含量較高的 N 端 DSL 片段[33]，后者是結合 Notch 受體實現(xiàn)活化的必需基序，是 Notch 受體相互作用的關鍵所在。

CSL 蛋白家族成員可以在結構上聯(lián)系 Notch 細胞內結構域 ( notch intracellular domain，NICD ) 的錨蛋白 ( Ank ) 序列形成復合物，同時結合核內的 CSL 以激活 CSL 相關下游目的基因。Notch 主要的下游目的基因如 Hes-1、Hes-5 等主要編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋 ( basic helix-loop-helix，bHLH ) 轉錄調節(jié)因子家族如 Mash1、NeuroD、Neurogenins 等抑制調節(jié)因子。CSL 中的 CBF-1 蛋白是 Notch 信號迄今為止惟一已知的轉錄因子，其又稱為 RBP-j[34-35]，可以活化與 E ( spl ) 屬共同始祖分子在序列或結構上相似的 Hes1 /5，阻斷神經(jīng)干細胞的分化。

2. Notch 信號通路的激活及轉錄機制：CBF-1 / RBP-j 依賴途徑是激活 Notch 信號通路的經(jīng)典途徑。旁細胞的 Notch 配體與受體特異性結合后觸發(fā) Notch 信號，隨后 Notch 蛋白歷經(jīng)三次剪切釋放 NICD 于胞質，繼之 NICD 入細胞核并結合轉錄因子 RBP-j 形成 NICD / RBP-j 轉錄激活復合體，最后啟動 bHLH 轉錄抑制因子家族的靶基因實現(xiàn) Notch 信號通路的活化與 mRNA 的合成。具體過程為：Notch 受體蛋白與配體在核糖體內相互識別形成需翻譯后加工的新的 Notch 受體多肽鏈，在蛋白質前體轉化酶類 furin 蛋白酶的作用下，于物流中心高爾基復合體的反面網(wǎng)狀結構內切割 S1 位點將多肽鏈水解為三部分，分別為 NICD、胞外的 N-末端片和跨膜的 C-末端片，三部分兩兩以非共價鍵結合成 Notch 異源二聚體表達于細胞表面。繼之 Notch 受體與配體在胞外區(qū)相互識別后啟動金屬蛋白酶家族的腫瘤因子 α-轉換酶 ( TNF-α-convertingenzyme，TACE )，被 TACE 于 S2 位點裂解為 2 個肽鏈，N 端肽鏈 ( ECN ) 被配體介導的細胞吞并，C 端產(chǎn)物被 γ-分泌酶 ( γ-Secretase ) 于 S3 位點水解，被剪接下的 NICD 從質膜轉位至細胞核，由此改變了貫穿生物膜兩端的跨膜片段和細胞內區(qū)域的構象。NICD 中的 RAM 域存在一個可與 RBP-j 高度親和的位點，而 Ank 則與 RBP-j 形成弱聯(lián)系，并在轉錄激活因子如組蛋白乙酰轉移酶 p300 等作用下形成轉錄激活復合體，啟動 bHLH 基因家族，誘發(fā) Notch 信號。其中，γ-分泌酶是 C 端產(chǎn)物在 S3 位點水解的必須因素，早老素 ( presenilin，ps ) 1 是其實現(xiàn)催化作用的部位。

bHLH 是激活 Notch 信號通路的直接目的基因，分為發(fā)揮抑制效應的 Hes1、Hes3 和 Hes5 等以及發(fā)揮促進效應的 math、mash1 / hash、ngn 等。其中 mash1 與 bHLH 轉錄因子活性劑 E47 作用形成糖基化肽鏈加速神經(jīng)干細胞特化為神經(jīng)元。Hes 作為 mash1 的上游基因，其中的 Hes1 通過與啟動子部位結合抑制 mash1 的表達和活性。因此，Hes1 實為 Notch 信號激活的最關鍵感受器，通過抑制 Hes1 阻斷 Notch 信號通路，實現(xiàn) mash1 高表達，最終促進神經(jīng)再生。

三、電針調節(jié) SCI 后的局部微環(huán)境變化

SCI 在祖國醫(yī)學上稱之為“痿證”“體墮”等，且根據(jù)經(jīng)絡循行理論認為其本質為督脈受損，施治當以活血化瘀、通調督脈為則[36]。對 SCI 的病理機制目前有待進一步探究，但已明確的機制包括氧化應激、炎性反應和微循環(huán)障礙等[37-38]，在 SCI 早期盡快予以相關治療不僅能減輕繼發(fā)性損傷，而且對患者遠期預后的改善具有重要意義[39]。研究表明，炎性反應在 SCI 的病理機制中起核心作用，是誘導繼發(fā)性損傷的主要原因[40]。炎性環(huán)境使傷區(qū)大量膠質細胞聚集，同時分泌大量的細胞外基質，導致瘢痕組織形成，嚴重阻礙了神經(jīng)元再生及神經(jīng)功能恢復。因此減輕 SCI 早期炎性反應是關鍵[41-42]。大量文獻報道了針灸不僅對急性 SCI 有效，而且對慢性 SCI 同樣有確切的療效[43-45]。傳統(tǒng)微針針刺聯(lián)合低頻直流電組成電針，可實現(xiàn)針刺激和電刺激雙倍興奮性效應，大量研究證明，電針具有改善 SCI 脊髓供血、抑制急性期炎性反應、加速炎性因子的代謝、減少神經(jīng)細胞凋亡、減輕細胞受損、促進神經(jīng)功能恢復以及局部鎮(zhèn)痛等神經(jīng)保護作用，對治療 SCI 療效確切[43-44,46-53]。

四、SCI 后電針干預基因修飾神經(jīng)干細胞移植與 Notch 通路相互關系

SCI 后雖然傷區(qū)脊髓內的內源性神經(jīng)干細胞開始遷移、增殖和分化，但大多數(shù)分化為星形膠質細胞形成瘢痕組織，極少分化為功能性神經(jīng)元和少突膠質細胞參與對損傷脊髓的修復。干細胞是一類具有向多種成熟細胞特定分化潛能的祖細胞，故干細胞移植為 SCI 的治療提供了新思路。其中的神經(jīng)干細胞在向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞等定向分化的同時還具有免疫豁免等諸多自身優(yōu)勢，因此非常適宜用細胞替代療法的種子細胞。但單一的細胞移植存在成活率低及向神經(jīng)元定向分化的效率低等問題，為此，利用基因轉染技術以 NTFs 等對神經(jīng)干細胞加以修飾后再移植，在成活率和分化率提高的基礎上[54]，又達到了細胞替代及基因治療的雙重生物效用。電針在改善 SCI 后局部微環(huán)境的同時還調控相應信號通路，參與神經(jīng)干細胞的增殖和分化。其中 Notch 信號通路與細胞的生長、發(fā)育乃至凋亡均密切相關，涉及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與并調控神經(jīng)干細胞的增殖和分化[55]。武鑫等[56]基于 Notch 信號通路研究電針干預對放射線照射小鼠神經(jīng)干細胞增殖和分化的影響，結果顯示，電針組與放射線照射組比較，電針組神經(jīng)干細胞分化的功能神經(jīng)元 ( BrdU / NeuN 免疫熒光染色的陽性細胞 ) 顯著增加，Notch1 蛋白均顯著減少，mash1 蛋白均顯著增加，說明了電針通過調控 Notch1 和 mash1 的表達抑制了 Notch 信號通路，從而促進神經(jīng)干細胞增殖并向功能神經(jīng)元分化，實現(xiàn)對放射線照射損傷小鼠神經(jīng)干細胞增殖分化的逆轉。姚海江[57]在前期研究基礎上，進一步證實了督脈電針通過調節(jié) Notch 信號促進神經(jīng)干細胞分化的機制，采用免疫組織化學和 Western Blot 方法檢測大鼠局部 Delta-1、ps1、Hes1 以及 Hes5 的表達情況。結果顯示，與空白對照組相比，不同時間點上述 4 個觀察指標的表達量均明顯降低，表明督脈電針通過抑制配體 Delta-1 的表達進而抑制剪接蛋白 ps1 的表達，從而抑制了 Notch 信號通路，減少了其下游基因 Hes1 和 Hes5 的表達。既有效促進了神經(jīng)干細胞定向分化為神經(jīng)元細胞和少突膠質細胞，同時還抑制了神經(jīng)干細胞向星形膠質細胞過度分化。

五、總結

SCI 后神經(jīng)環(huán)路的重建涉及軸突、樹突、神經(jīng)元等多個水平，主要是通過損傷神經(jīng)的軸突殘端芽生生殖并定向至相應目的細胞以形成新的突觸聯(lián)系，進而使神經(jīng)環(huán)路得以建立，并逐漸恢復神經(jīng)對目的細胞的支配能力。Notch 信號參與有絲分裂后神經(jīng)元結構成熟的過程，表現(xiàn)為抑制 Notch 信號，細胞停止于有絲分裂的 S 期，軸突分支增加，神經(jīng)發(fā)生增加。SCI 后 Notch 信號被激活，采用電針干預 Notch 信號通路，在改善局部微環(huán)境的同時進一步促進了基因修飾神經(jīng)干細胞的增殖與分化。這雖然為 SCI 提供了治療思路和治療途徑，鑒于電針對 Notch 信號通路的調控非常復雜，且基因修飾神經(jīng)干細胞移植多見于動物實驗基礎研究層面，臨床研究缺乏大數(shù)據(jù)研究支持，故需更進一步更加深入的研究為 SCI 的治療提供理論依據(jù)支持。