高分辨率顯微內(nèi)鏡對胃潰瘍良惡性鑒別的診斷價值*

賈馥華，屈亞威，劉海峰

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心 消化內(nèi)科，北京 100089）

胃潰瘍是常見的臨床疾病，常常會導(dǎo)致消化不良、上腹部疼痛、胃腸出血和穿孔等癥狀。目前，胃潰瘍惡變的風(fēng)險已得到公認(rèn)，在初診為潰瘍的2年內(nèi)，胃潰瘍患者進(jìn)展為胃癌的風(fēng)險較普通人群明顯增高[1-2]。惡性胃潰瘍是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，其臨床癥狀及在內(nèi)鏡下表現(xiàn)與良性潰瘍有諸多相似之處。內(nèi)鏡下對胃潰瘍良惡性程度的診斷存在較大差異，易造成對惡性病變的漏診、誤診[3-4]。由于兩者病變性質(zhì)不同，早期精確診斷病灶良惡性及分期，對進(jìn)一步治療方案的制定具有積極意義。本團隊自主研發(fā)的高分辨率顯微內(nèi)鏡（high resolution microendoscopy，HRME）是基于高分辨率光纖和分子成像技術(shù)設(shè)計，而開發(fā)出的一種可以實現(xiàn)即時組織病理成像的新型成像系統(tǒng)[5-6]。以往的文獻(xiàn)[7-9]表明，HRME 能夠?qū)φＮ葛つそY(jié)構(gòu)以及胃癌發(fā)展過程中多種病變進(jìn)行特征性成像，具有較高的診斷價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

前瞻性研究2017年4月－2017年10月就診于解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)鏡中心行胃鏡檢查的患者，選擇以上經(jīng)病理確診為良性胃潰瘍和惡性胃潰瘍患者的活檢標(biāo)本各20 例，用于診斷標(biāo)準(zhǔn)的制定。前瞻性研究2017年11月－2018年4月具有消化道癥狀（呈周期節(jié)律上腹痛、反酸和燒心等）的、既往經(jīng)胃鏡檢查后確診為胃潰瘍的患者56 例，用HRME鑒別潰瘍的良惡性。用于研究的40 例胃潰瘍組織共53 處成像位點，獲得了486 張圖像，經(jīng)嚴(yán)密篩選后，選取120 張圖像用于HRME 圖像解析與良惡性潰瘍診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究制定。56 例患者113 處胃潰瘍病變通過白光內(nèi)鏡下檢出并進(jìn)行靶向活檢。其中，賁門11處，胃體36 處，胃竇66 處。對113 處胃潰瘍活檢標(biāo)本進(jìn)行HRME 成像，經(jīng)篩查后選取960 張圖像用于HRME 前瞻性研究。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在60 歲以上的患者；②有腹痛、腹脹和便血等消化道癥狀；③已完善相關(guān)檢查者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已明確患有胃腸道腫瘤并進(jìn)行治療中的患者；②心、肝和肺等功能不全者。本研究獲得解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究試劑與藥品

0.01%吖啶黃鹽酸鹽（美國Sigma 公司），0.9%生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司），碳酸氫鈉（北京泰德制藥股份有限公司），鏈酶蛋白酶顆粒（北京泰德制藥股份有限公司）。

1.3 成像設(shè)備

本團隊自主研發(fā)的HRME 系統(tǒng)的主要組成元件包括一個440 ～480 nm 的LED 光源、一根長1.8 m（內(nèi)含30000 根單絲）的高分辨率光纖、一根長1.8 m（內(nèi)含10000 根單絲）的高分辨率光纖、10×顯微鏡鏡頭、20×顯微鏡鏡頭、500 nm 二向色鏡、濾光片以及一個科學(xué)級電荷耦合器件（charge couple device，CCD）相機。攝取圖像以17 幀/s 的速度，由計算機軟件和CCD 相機共同完成高分辨率效果采圖。見圖1和2。

1.4 研究方法

圖1 HRME 設(shè)備示意圖Fig.1 HRME schematic diagram

圖2 HRME 實物操作示意圖Fig.2 HRME physical operation diagram

1.4.1 檢查過程 所有患者進(jìn)行白光內(nèi)鏡初查，內(nèi)鏡下良性胃潰瘍主要表現(xiàn)為相對規(guī)則的橢圓或圓形，基底覆少量白苔，周圍黏膜充血水腫，無結(jié)節(jié)狀改變，邊界清晰。惡性潰瘍鏡下表現(xiàn)為形態(tài)不規(guī)則，基底凹凸不平，底覆污苔及壞死組織，周圍黏膜堤樣隆起，質(zhì)脆，觸易出血，邊界不清晰。根據(jù)白光內(nèi)鏡下對病變特征形態(tài)的觀察，做出良性潰瘍與惡性潰瘍的判斷，并對病灶位置進(jìn)行精確的靶向活檢。

1.4.2 標(biāo)本處理 獲取活檢標(biāo)本后，首先用0.9%生理鹽水緩慢沖洗約1 min，去除表面殘留廢物，再用配制的碳酸氫鈉和鏈蛋白酶混合液沖洗組織1 min，去除表面黏液，最后再次用0.9%生理鹽水沖洗殘留去黏液劑，干棉球擦拭，備用。

1.4.3 HRME 成像過程 將處理后的活檢標(biāo)本平展置于黑色成像板上，局部噴灑0.01%吖啶黃鹽酸鹽2.0 ～3.0 ml 進(jìn)行染色，染色劑在標(biāo)本組織停留約30 s 后，用生理鹽水反復(fù)緩慢沖洗去除殘留染料，用干紗布將組織表面液體輕柔擦干。穩(wěn)固光纖后，將光纖探頭對準(zhǔn)并貼緊被檢查的目標(biāo)區(qū)域，以不同的角度對組織進(jìn)行觀察，對所觀察部位做局部標(biāo)記，再進(jìn)行HRME 成像，留取清晰的圖像編號整理分析。

1.4.4 病理檢查 HRME 成像后，所有活檢組織用福爾馬林固定，由病理醫(yī)師進(jìn)行包埋、切片、HE 染色，并給予病理學(xué)診斷。

1.5 HRME 圖片質(zhì)量控制

嚴(yán)格篩選所采集的HRME 圖像，每個活檢標(biāo)本優(yōu)選出20 張最清晰圖像留用。選取組織表面清潔、雜質(zhì)覆蓋極少、運動偽影面較小、成像效果清晰并且可視化面積達(dá)70.00%以上的圖片。

1.6 HRME 診斷標(biāo)準(zhǔn)的制定

由2 名經(jīng)驗豐富的內(nèi)鏡主治醫(yī)師對40 例活檢標(biāo)本的HRME 圖像進(jìn)行特征性分析，根據(jù)腺體形態(tài)、胃小凹開口、腺管大小、細(xì)胞核數(shù)量大小、排列、間距和密度等總結(jié)病變特征變化，經(jīng)過與病理醫(yī)師反復(fù)探討，最終制定HRME 對良惡性潰瘍的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 HRME 對良惡性潰瘍診斷的前瞻性研究

依據(jù)制定的良惡性潰瘍診斷標(biāo)準(zhǔn)，由2 名未知病理診斷結(jié)果的內(nèi)鏡主治醫(yī)生對56 例活檢組織所采集的HRME 圖像進(jìn)行預(yù)診斷。結(jié)果包括良性潰瘍的診斷與惡性潰瘍的診斷兩部分。診斷結(jié)果以病理學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)為基準(zhǔn)，對HRME 鑒別診斷良惡性潰瘍的價值做出評估。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用四格表分析方法，計算白光內(nèi)鏡和HRME 對良惡性潰瘍鑒別診斷的準(zhǔn)確性、敏感度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。HRME 與病理診斷的一致性分析采用Kappa 值表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HRME 診斷標(biāo)準(zhǔn)

基于本團隊前期對HRME 的研究成果，依據(jù)HRME 對胃黏膜微結(jié)構(gòu)可視化的原理，通過對腺體形態(tài)、胃小凹開口、腺管大小、細(xì)胞核形態(tài)數(shù)量、排列、間距和密度等指標(biāo)，結(jié)合病理學(xué)診斷，制定出HRME診斷良惡性潰瘍的特征性標(biāo)準(zhǔn)。良性胃潰瘍：胃小凹基本特征尚未發(fā)生改變，排列規(guī)則，圓形小凹部分變成橢圓形，裂隙小凹可見延長扭曲，細(xì)胞核未見明顯異形變化，可見結(jié)構(gòu)與形態(tài)不成熟的新生小腺體。惡性胃潰瘍：腺體結(jié)構(gòu)極紊亂，或腺體結(jié)構(gòu)完全消失，胃小凹形態(tài)呈不規(guī)則變化或消失，細(xì)胞核增大，出現(xiàn)顯現(xiàn)核團聚，排列紊亂無規(guī)則。見圖3。

2.2 白光內(nèi)鏡與HRME 對良惡性潰瘍鑒別的診斷結(jié)果比較

白光內(nèi)鏡與HRME 對良惡性潰瘍鑒別的診斷結(jié)果比較見附表。

2.2.1 白光內(nèi)鏡對良惡性潰瘍的診斷結(jié)果 根據(jù)鏡下對113 處潰瘍型病變觀察，白光內(nèi)鏡診斷良性潰瘍56 處，經(jīng)病理證實42 處。白光內(nèi)鏡診斷惡性潰瘍57處，病理證實為30 處。統(tǒng)計學(xué)分析后，白光內(nèi)鏡鑒別診斷良惡性潰瘍的準(zhǔn)確性、特異性、敏感性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為69.61%、72.55%、67.74%、75.00%和64.91%，與病理診斷一致性Kappa 值為0.399。

2.2.2 HRME 對良惡性潰瘍的診斷結(jié)果 應(yīng)用HRME 對白光內(nèi)鏡下觀察活檢的113 處病變進(jìn)行成像，根據(jù)前期指定的HRME 對良惡性潰瘍診斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，進(jìn)行預(yù)診斷。HRME 共診斷惡性潰瘍45 處，經(jīng)病理證實51 處，漏診6 處，診斷良性潰瘍57 處，經(jīng)病理證62 處，誤診5 處。統(tǒng)計學(xué)分析后，HRME 診斷良性潰瘍準(zhǔn)確性、特異性、敏感性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為88.50%、86.28%、90.32%、88.89%和88.00%，與病理診斷的一致性Kappa 值為0.803。

圖3 良性潰瘍與惡性潰瘍對比Fig.3 Comparison of benign and malignant ulcer

附表 白光內(nèi)鏡與HRME 對良惡性潰瘍診斷的比較Attached table Comparison between white light endoscopy and high resolution microscopic endoscopy in the diagnosis of benign and malignant ulcer

3 討論

HRME 是一種新型的分子影像技術(shù)，不同于傳統(tǒng)的解剖成像，HRME 成像技術(shù)可以實時的進(jìn)行細(xì)胞水平成像，早期觀察到疾病細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化[10-11]。HRME 成像系統(tǒng)通過濾光片將LED 激發(fā)光進(jìn)行過濾，將所形成的415 nm 的窄譜段激發(fā)光通過高分辨率光纖傳導(dǎo)至染色劑噴灑的生物表面組織，產(chǎn)生515 nm的熒光，熒光信號折返后經(jīng)二向色鏡分離，最終將熒光信號傳導(dǎo)至CCD 芯片，從而得到被檢測組織的細(xì)胞水平圖像。近年來，國外有學(xué)者[12-14]應(yīng)用HRME 技術(shù)對口腔黏膜、食道癌癥、肝臟疾病和宮頸癌進(jìn)行成像研究，結(jié)果表明，HRME 具有優(yōu)異的診斷準(zhǔn)確性和應(yīng)用前景。在國外學(xué)者研究的經(jīng)驗基礎(chǔ)上，本課題組自主搭建了一套HRME 成像系統(tǒng)，并對正常胃黏膜、炎癥、癌癥的組織病變進(jìn)行深度成像研究[7-9，15]，已取得顯著的成像效果。

潰瘍型病變是白光內(nèi)鏡下較常見的一種病變，可是精準(zhǔn)判斷潰瘍的性質(zhì)具有一定難度。目前，若在鏡下表現(xiàn)為形狀不規(guī)則的大面積潰瘍、基底凹凸不平、整覆污苔伴出血、周邊成堤狀隆起樣突起及結(jié)節(jié)狀改變，就認(rèn)為是惡性潰瘍[16]。但僅僅依據(jù)潰瘍表面形態(tài)變化難以有效區(qū)分病灶的良惡性質(zhì)。內(nèi)鏡下的較小潰瘍、霜斑樣潰瘍、線性潰瘍、潰瘍瘢痕，也無法排除高級別瘤變及胃癌的可能性，而且某些巨大潰瘍也可能是良性潰瘍[17]。白光內(nèi)鏡下醫(yī)師根據(jù)潰瘍形態(tài)特征對病變進(jìn)行主觀經(jīng)驗性判斷，將會導(dǎo)致部分惡性潰瘍病變漏診以及對良性病變的誤診。本研究表明，白光內(nèi)鏡鑒別胃潰瘍良惡性的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性分別為69.61%、67.47%和72.55%，與病理診斷一致性為0.399。

HRME 主要觀察由柱狀上皮細(xì)胞組成的胃小凹與胃腺體結(jié)構(gòu)[18]，研究對潰瘍病變進(jìn)行回顧性分析時發(fā)現(xiàn)，良性潰瘍中可見形態(tài)不成熟但較為規(guī)則的新生小腺體結(jié)構(gòu)，小腺體排列疏松，小凹周邊上皮細(xì)胞表現(xiàn)幼稚，厚度較均勻；賁門、幽門、胃底處良性潰瘍均可見新生小腺體結(jié)構(gòu)，并且新生腺體結(jié)構(gòu)無明顯差異。當(dāng)胃黏膜受到損傷時，受損黏膜將會再生修復(fù)[19]，黏膜修復(fù)過程中，新生腺體不成熟、腺管大小相對一致、排列疏松，基于特征性新生小腺體結(jié)構(gòu)與胃小凹形態(tài)變化來制定相應(yīng)的HRME 對良性潰瘍的診斷標(biāo)準(zhǔn)。有文獻(xiàn)[20]報道，部分黏膜再生過后，其表面腺管結(jié)構(gòu)不規(guī)則，表現(xiàn)為異型性增生，胃潰瘍癌變往往通過潰瘍邊不典型增生改變而來。HRME 觀察下，惡性潰瘍的胃小凹結(jié)構(gòu)基本消失，腺體結(jié)構(gòu)紊亂或完全被破壞，細(xì)胞核大量團聚。本研究根據(jù)對胃潰瘍患者大量活檢標(biāo)本的前瞻性研究結(jié)果顯示，HRME 鑒別診斷良惡性潰瘍的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性分別為88.50%、90.32%和86.28%，與病理一致性為0.803，對良惡性潰瘍的鑒別診斷具有較高的價值。

本研究結(jié)果表明，HRME 對良惡性潰瘍的鑒別診斷優(yōu)于白光內(nèi)鏡，具有良好的應(yīng)用前景。但本研究仍存在不足之處：①影響HRME 圖像質(zhì)量的因素較多，如消化道黏液、壞死組織、無加固裝置所致運動偽影，掩蓋模糊了正常的腺體結(jié)構(gòu)，在診斷上易出現(xiàn)偏差；②取樣活檢標(biāo)本，樣本數(shù)量較少，且未進(jìn)行在體組織成像。下一步研究中，筆者將改進(jìn)HRME 設(shè)備，更妥善的處理標(biāo)本，改善運動偽影，將HRME 與智能軟件結(jié)合，自動定量分析細(xì)胞核大小、數(shù)量變化和腺體形態(tài)改變，將HRME 與白光內(nèi)鏡檢查相結(jié)合，實現(xiàn)在體組織的精準(zhǔn)高分辨率成像。

綜上所述，HRME 作為一種可實現(xiàn)對組織進(jìn)行實時病理診斷的新型成像工具，可以很有效的鑒別診斷良惡性潰瘍，提高了診斷的準(zhǔn)確性，減少漏診、誤診。隨著HRME 智能化技術(shù)的發(fā)展，將會更好地協(xié)助內(nèi)鏡醫(yī)師完成高效的診療工作。