花生白絹病生防菌篩選及防控作用研究

張金鳳，成 波，曹延麗，遲玉成，鄢洪海*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生是世界上最重要的油料作物，在我國(guó)栽培歷史悠久，種植面積居世界第二位，產(chǎn)量居世界第一位，是我國(guó)為數(shù)不多的具有出口優(yōu)勢(shì)的農(nóng)作物之一[1]。花生白絹病是花生的一種重要土傳真菌病害，世界各地均有發(fā)生，在美國(guó)和印度危害尤為嚴(yán)重[2]。近年來，由于耕作制度的改變，花生種植密度的增加，使得田間小氣候顯著改變，導(dǎo)致花生白絹病在我國(guó)一些主要種植區(qū)發(fā)生逐年加重，成為北方生產(chǎn)田的重要病害[3]。花生白絹病是由齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)侵染引起的土傳真菌病害，該病原菌具有寄主范圍廣，能侵染500多種植物，其中包括小麥、大豆、花生等一些重要農(nóng)作物[4]。

生產(chǎn)上防控花生白絹病以化學(xué)防治為主，因此存在著許多問題，如農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境、對(duì)人畜健康傷害大等。相比之下，生物防治有著安全、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。在眾多的生防菌中，木霉(Trichodermaspp.)以其高效性和廣譜性應(yīng)用最為廣泛，對(duì)病原真菌如鐮刀菌(Fusariumspp.)、腐霉(Pythiumspp.)、疫霉(Phytophthoraspp.)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)均有抑制作用[5]。木霉菌可防控多種病原真菌，對(duì)土傳病害的防控尤為顯著，利用木霉菌可防治黃瓜枯萎病[5]、馬鈴薯黃萎病[6]、煙草黑脛病[7]及苦瓜枯萎病等[8-11]。

芽孢桿菌不僅能夠抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)繁殖，而且可以誘發(fā)植物抗病力增強(qiáng)[12]，如用芽孢桿菌防治花生白絹病[13]、煙草黑脛病[14]、煙草白粉病[15]等，Yongli對(duì)芽孢桿菌的研究也證明其具有誘導(dǎo)抗病性作用[16-17]。

本試驗(yàn)研究了木霉菌和芽孢桿菌對(duì)花生白絹病的防治效果及對(duì)花生植株抗性生理的影響，意在為今后木霉菌和芽孢桿菌制劑的研發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。供試菌株：木霉菌篩選采用土壤分離法獲得。取花生田植株根際的土壤1g，用無菌水稀釋制備10-1、10-2和10-3的土壤懸浮液。將10-2、10-3稀釋液1mL倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，待PDA冷卻倒入培養(yǎng)皿，使土壤懸浮液與PDA充分混勻。于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2～3d。獲得的菌株進(jìn)行純培養(yǎng)、鏡檢，觀察菌絲和孢子梗以及菌落形態(tài)特征并初步鑒定其分類地位。芽孢桿菌篩選采用土壤分離法獲得。首先制備10-2和10-3的土壤懸浮液，然后采用平板劃線法，獲得單菌落后再進(jìn)行純化培養(yǎng)。花生白絹病菌：從山東省花生研究所萊西試驗(yàn)田發(fā)病的花生植株上采集病菌，分離獲得。供試花生品種為魯花11號(hào)，由山東省花生研究所提供。

1.2 防治花生白絹病的生防菌株篩選

用打孔器在已經(jīng)純化好的木霉菌、芽孢桿菌和白絹病菌培養(yǎng)基上分別制取直徑為1cm的菌餅，將白絹病菌菌餅置于PDA培養(yǎng)皿中距離中心點(diǎn)2cm的一側(cè)，而距離2cm的另一側(cè)分別放置木霉菌或芽孢桿菌菌餅，以無菌空白PDA餅塊作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。對(duì)峙培養(yǎng)在26℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，2～3d后觀察木霉菌、芽孢桿菌對(duì)白絹病菌拮抗和抑制效果，7d后測(cè)定抑菌效果。

抑菌率/%=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直經(jīng))/對(duì)照菌落直經(jīng)×100

(用十字交叉法測(cè)量病菌菌落直徑)

1.3 生防菌對(duì)花生白絹病控制作用

1.3.1 盆栽防控效果試驗(yàn)

將滅菌后的土壤裝在塑料盆中，把提前催芽的花生種子播于盆中，每盆10粒，共4個(gè)處理1個(gè)對(duì)照，重復(fù)3次?；ㄉ雒绾竺颗柚槐Ａ?株，之后正常管理，于開花期接種花生白絹病菌，即直接把病原真菌接種到土壤中，并于2d后將篩選出來的木霉菌株和芽孢桿菌同樣接種到土壤中，進(jìn)行防治花生白絹病效果測(cè)定。

1.3.2 菌株防控白絹病效果檢測(cè)

采取病情指數(shù)法進(jìn)行防治效果測(cè)定，花生白絹病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病根數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總根數(shù)×最高級(jí)代表值)×100

防治效果/%=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100

1.3.3 花生防御酶活性測(cè)定

在花生接菌前和花生發(fā)病時(shí)分別對(duì)花生葉片進(jìn)行取樣，用于寄主防御酶活性測(cè)定。葉片SOD、CAT防御酶活性的測(cè)定參照劉家堯等[18]方法。

1.4 生防菌木霉菌與芽孢桿菌分子鑒定

1.4.1 芽孢桿菌RNA提取

菌種在液體培養(yǎng)基中過夜，取1.5mL菌液于EP管中，8000r/min離心1min獲得菌體，參考Frederick等[19]從細(xì)菌中制備基因組RNA法提取芽孢桿菌RNA。擴(kuò)增引物為27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。50μL PCR反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中加入10μL Taq PCR master Mix、2μL PrimerF、2μL PrimerR、1μL DNAtemplate，雙蒸水補(bǔ)足至50μL。根據(jù)下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性94℃ 4min、變性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸 73℃10min。

表1 花生白絹病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

取5mL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后用手提式紫外燈分析儀觀察條帶，并送往生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。50μL PCR反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中加入10μL Taq PCR master Mix、2μL PrimerF、2μL PrimerR、1μL DNAtemplate，雙蒸水補(bǔ)足至50μL。根據(jù)下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性94℃ 4min、變性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸 73℃10min。

取5mL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后用手提式紫外燈分析儀觀察條帶，并送往生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.2 木霉菌DNA提取

將獲得的木霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3d。取適量菌絲于研缽中，加液氮研磨成粉末，移入EP管中。參照Frederick[21]利用CTAB法制備植物DNA法提取木霉菌DNA。擴(kuò)增引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。20μL PCR反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中加入10μL 2xMix、1μL Primer 2 、2μL DNA凝膠、雙蒸水補(bǔ)足到20μL。根據(jù)下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性94℃ 2min、變性 94℃ 30s、退火 55℃ 30s、延伸 72℃ 1min、35個(gè)循環(huán)、最后延伸 72℃ 10min[21]。取5mL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后用手提式紫外燈分析儀觀察條帶，并送往生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2016對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖表制作和對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用NCBI進(jìn)行序列DNA鑒定，利用MEGA.7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離的供試生防菌菌株室內(nèi)抑菌測(cè)定

從土壤中獲得的真菌經(jīng)鏡檢(圖1)確定8個(gè)為木霉菌株，從土壤中獲得的1株細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色及性狀觀察確定為芽孢桿菌。經(jīng)平板對(duì)峙抑菌試驗(yàn)篩選有3個(gè)木霉菌株抑菌效果較好(圖2)，對(duì)花生白絹病菌的抑制率分別為：T1菌株58.52%、T2菌株47.73%、T3菌株39.02% ；1株芽孢桿菌對(duì)白絹病菌的抑制率60.8%(表2)，其抑菌效果最好(圖4)。

圖1木霉菌形態(tài)

Fig.1Trichodermamicroscopy

圖2木霉對(duì)花生白絹病菌的抑制效果

Fig.2AntagonisticeffectsofTrichodermaonCorticiumrolfsiiSaccardo

圖3花生白絹病菌(CK)

Fig.3CorticiumrolfsiiSaccardo(CK)

圖4芽孢桿菌對(duì)花生白絹病菌抑制效果

Fig.4AntagonisticeffectofBacillusonCorticiumrolfsiiSaccardo

表2 木霉及芽孢桿菌對(duì)白絹病菌的抑制率

表3 生防菌株的相似性分析與分子鑒定

2.2 木霉菌及芽孢桿菌菌株鑒定

對(duì)篩選出3株防治效果較好的木霉菌菌株和1株細(xì)菌菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和性狀觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)屬的特征較顯著，但種的特點(diǎn)不明確，為此，對(duì)它們進(jìn)行基因測(cè)序和分子鑒定(表3)。將測(cè)序獲得的木霉菌株序列在NCBI上以ITS序列進(jìn)行BLAST，進(jìn)行同源性分析。結(jié)果T1與棘孢木霉的基因相似度99.83%，T2與擬康寧木霉的基因相似度100%，T3與鉤狀木霉的基因相似度99.83%。測(cè)序獲得的芽孢桿菌序列在NCBI上以16s rDNA序列采用BLAST進(jìn)行同源性分析，T4與蠟狀芽孢桿菌的基因相似度為99.66%。

通過對(duì)木霉菌株ITS序列的測(cè)定，與NCBI上相似序列進(jìn)行比對(duì)，選擇同源性較高的3個(gè)菌株。利用MEGA.7軟件，將木霉的ITS序列作為外接菌，使用最大似然法構(gòu)建病原真菌系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5。采用Bootstrap1000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹各分支的置信度。結(jié)果表明，木霉菌株T1聚類到Trichodermaasperllum進(jìn)化分枝上，木霉菌株T2聚類到T.asperellum進(jìn)化分枝上，木霉菌株T3聚類到T.hamatum進(jìn)化分枝上。T2與擬康寧木霉有較大的親緣關(guān)系；T1與棘孢木霉有進(jìn)化關(guān)系；T3與鉤狀木霉有較大的親緣關(guān)系。分子生物學(xué)鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定一致，T1菌株為棘孢木霉T.asperellum，T2菌株為擬康寧木霉T.koningiopsis，T3菌株為鉤狀木霉T.hamatum。通過對(duì)芽孢桿菌16s rDNA序列的測(cè)定，與NCBI上相似序列進(jìn)行比對(duì)，選擇同源性較高的3個(gè)菌株。利用MEGA.7軟件，將歐文氏菌的16s rDNA序列作為外接菌，使用最大似然法構(gòu)建病原細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6。采用Bootstrap 1000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹各分支的置信度。結(jié)果表明，芽孢桿菌菌株T4聚類到Bacilluscereus進(jìn)化分枝上，因此T4菌株為蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus。

圖5 木霉菌株進(jìn)化樹

圖6 芽孢桿菌進(jìn)化樹

2.3 生防菌株防控花生白絹病效果測(cè)定

土壤接種不同拮抗木霉和芽孢桿菌后，各個(gè)菌株對(duì)花生白絹病均有一定的防治效果(表4)。棘孢木霉的防治效果最好，防治效果可達(dá)68.05%，但是發(fā)病率為42.86%。擬康寧木霉的發(fā)病率最低為38.10%，防治效果為65.77%。鉤狀木霉的發(fā)病率為40%，防治效果為56.87%，防治效果較差。芽孢桿菌的發(fā)病率在4組處理中最高為61.7%，防治效果僅為13.28%。

2.4 供試生防菌株處理對(duì)花生植株抗性的影響

2.4.1 花生葉片中超氧化物歧化酶(SOD)變化

圖7表明，接種不同菌種花生葉片中超氧化物歧化酶在發(fā)病前與發(fā)病后變化差異較大?；ㄉ捉伈“l(fā)病后超氧化物歧化酶的活性顯著高于發(fā)病前，其中以接種棘孢木霉的花生葉片超氧化物歧化酶最高，芽孢桿菌次之。

圖7接種花生白絹病菌對(duì)花生植株SOD活性的影響

Fig.7EffectofinoculationofCorticiumrolfsiiSaccardoonSODactivityofpeanutplants

注：T1為棘孢木霉，T2為擬康寧木霉，T3為鉤狀木霉，T4為蠟狀芽孢桿菌。下同。

圖8接種花生白絹病菌對(duì)花生植株中CAT活性的影響

Fig.8EffectofinoculationofCorticiumrolfsiiSaccardoonCATactivityinpeanutplant

Note:T1isT.asperellum,T2isT.koningiopsis,T3isT.hamatum,T4isBacilluscereus.Thesameasbelow.

2.4.2 花生葉片中過氧化氫酶(CAT)的變化

圖8表明，接種不同菌種花生葉片中過氧化氫酶在發(fā)病前與發(fā)病后變化差異大?；ㄉ捉伈“l(fā)病后過氧化氫酶的活性顯著高于發(fā)病前，其中以接種芽孢桿菌的花生葉片過氧化氫酶最高，鉤狀木霉次之 (圖8)。

3 結(jié)論與討論

3.1 本試驗(yàn)從種植花生的土壤中分離到多株木霉菌和芽孢桿菌，但通過對(duì)峙培養(yǎng)篩選僅獲得3株木霉菌和1株芽孢桿菌對(duì)花生白絹病菌抑制效果較好。經(jīng)菌株形態(tài)觀察和DNA基因序列擴(kuò)增比對(duì)，3個(gè)木霉菌株分別為棘孢木霉、擬康寧木霉和鉤狀木霉，芽孢桿菌為蠟狀芽孢桿菌。

3.2 經(jīng)培養(yǎng)皿對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，對(duì)花生白絹病菌抑制效果依次為芽孢桿菌>棘孢木霉>擬康寧木霉>鉤狀木霉；盆栽接菌處理防病試驗(yàn)效果依次是擬康寧木霉>鉤狀木霉>棘孢木霉>芽孢桿菌，生防菌對(duì)白絹病菌的拮抗作用與盆栽試驗(yàn)具有一定相關(guān)性，但并不完全呈正相關(guān)。張春秋等人研究的木霉與黃瓜枯萎病的平板對(duì)峙試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)[5]結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。這可能是由于生防菌的生長(zhǎng)速度快，在平板試驗(yàn)中由于環(huán)境適宜、養(yǎng)分充足等原因在競(jìng)爭(zhēng)中占明顯的優(yōu)勢(shì)，但是在盆栽試驗(yàn)中，可能由于土壤濕度、溫度、物理化學(xué)等諸多因素，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

3.3 當(dāng)植物用生防菌或誘抗劑處理時(shí)，植物體內(nèi)的SOD酶、CAT酶等防御酶活性往往會(huì)升高[5，8]。本試驗(yàn)在接種白絹病菌的花生土壤中施入生防木霉和芽孢桿菌后測(cè)定SOD等主要的防御酶系，發(fā)現(xiàn)花生植株體內(nèi)SOD酶、CAT酶也發(fā)生了不同程度升高，說明木霉菌和芽孢桿菌誘導(dǎo)了花生植株對(duì)白絹病菌的抗病性，這可能與防病控病作用有關(guān)。