圍手術(shù)期自體血回收分離機(jī)制備富血小板血漿和自體凝血酶的研究

鄭少強(qiáng)，張文杰，何錫強(qiáng)，周 雁，趙堯平，王 庚

(北京積水潭醫(yī)院麻醉科，北京 100035)

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是全血經(jīng)離心分離后獲得的血小板(platelet，PLT)濃縮物，是自體源性血液制品。PRP含有生理濃度數(shù)倍的PLT，因制備方法不同，其可能含有高濃度白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、生長因子和纖維蛋白原等[1-2]物質(zhì)。大量研究表明，圍手術(shù)期應(yīng)用PRP有益于患者康復(fù)[3-6]。術(shù)前采集自體PRP，術(shù)中必要時(shí)予以回輸，可改善患者凝血功能，減少術(shù)中、術(shù)后出血及異體用血量[5,7-9]。PRP的激活產(chǎn)物包括富血小板凝膠(platelet-rich gels，PRG)和PRP釋放物或提取物。已有證據(jù)表明，局部使用PRG可減少術(shù)后引流量，加快切口恢復(fù)，促進(jìn)組織修復(fù)，從而改善骨折不愈合、肌肉韌帶損傷、骨性關(guān)節(jié)炎、難愈創(chuàng)面患者的預(yù)后[5-6,10-12]。可見，安全、經(jīng)濟(jì)、有效、可操作性強(qiáng)的PRP及PRG制備方法對PRP能否在臨床廣泛應(yīng)用十分重要。但市售PRP制備設(shè)備存在耗材價(jià)格昂貴的問題，不利于臨床推廣使用。而自體血回收分離機(jī)設(shè)置為分離模式，可將患者全血進(jìn)行分離制備PRP。本研究旨在驗(yàn)證圍手術(shù)期使用自體血回收分離機(jī)制備PRP的可行性及有效性，并探索制備自體凝血酶，及用自體凝血酶激活PRP制備PRG的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年10月至2019年1月在北京積水潭醫(yī)院行單側(cè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的30例患者作為研究對象，按照隨機(jī)數(shù)字法分為觀察組和對照組，各15例。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲，體重>60 kg，性別不限；②因髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，行單側(cè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)；③美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)分級Ⅰ～Ⅲ級；④術(shù)前無貧血(血紅蛋白>120 g/L，血細(xì)胞比容>35%)，PLT>150×109/L，無PLT功能障礙，凝血功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肺、心、腎、肝等功能異常，凝血功能異常；②術(shù)前高熱及貧血；③不能配合或其他原因不能行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)；④不愿配合或拒絕參加研究。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)北京積水潭醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

表1 兩組行單側(cè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的一般資料比較

對照組：患者在術(shù)前30 min使用自體血回收分離機(jī)制備PRP，制備成功后，使用10%葡萄糖酸鈣激活PRP；觀察組：患者在術(shù)前30 min使用自體血回收分離機(jī)制備PRP，制備成功后，將制得的PRP 1.5 mL用于制備自體凝血酶，使用自體凝血酶激活自身PRP以制備PRG；PRP：富血小板血漿；PRG：富血小板凝膠；a為χ2值，余為t值

1.2試驗(yàn)設(shè)備及材料 血液回收分離機(jī)(美國血液技術(shù)公司，型號：cell saver 5+)、一次性使用血細(xì)胞分離器(美國血液技術(shù)公司，規(guī)格261、244)、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：DK-S22)、微型低速離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司，型號：AS-4K-1069)、水平震蕩儀(常州榮華制造有限公司，型號：TY-80B)、EP管、一次性使用無菌注射器[美國BD (Becton,Dickinson and Company)公司，規(guī)格2 mL、5 mL、10 mL]、醫(yī)用三通(德國貝朗醫(yī)療有限公司生產(chǎn)，型號：409511CN)。

1.3試驗(yàn)方法 所有患者均在術(shù)前30 min使用自體血回收分離機(jī)制備PRP。制備成功后，觀察組將制得的PRP 1.5 mL用于制備自體凝血酶，使用自體凝血酶激活自身PRP以制備PRG；對照組使用10%葡萄糖酸鈣激活PRP。除激活物不同外，兩組的其他激活條件均相同?；颊哂谑中g(shù)當(dāng)天進(jìn)入手術(shù)室后建立無創(chuàng)血壓檢測、脈搏氧飽和度監(jiān)測、心電圖監(jiān)護(hù)和靜脈通路，輸入乳酸鈉林格液500 mL，Allen試驗(yàn)陰性后，行橈動(dòng)脈穿刺置管，連接動(dòng)脈測壓裝置。采血前取動(dòng)脈血行血?dú)夥治?，測定pH值、動(dòng)脈血二氧化碳分壓、動(dòng)脈血氧分壓、血紅蛋白、血細(xì)胞比容等。

1.3.1PRP分離 按血液回收分離機(jī)操作規(guī)程安裝離心杯、分離管路、儲(chǔ)血袋等耗材，使用枸櫞酸鈉注射液預(yù)充管路抗凝。主機(jī)選擇分離模式，將采血端連接動(dòng)脈，開始運(yùn)行，分離出貧血小板血漿、PRP及紅細(xì)胞，分別進(jìn)入相應(yīng)儲(chǔ)存袋。采血過程中輸注羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液300～500 mL，嚴(yán)密監(jiān)測患者生命體征，無創(chuàng)血壓監(jiān)測選擇連續(xù)測壓模式。當(dāng)患者出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)明顯變化(血壓、心率變化范圍超過基礎(chǔ)值20%)或有相關(guān)不適主訴時(shí)，停止采血，并予以記錄。采血完成后，再次取動(dòng)脈血行血?dú)夥治?，測定pH值、動(dòng)脈血二氧化碳分壓、動(dòng)脈血氧分壓、血紅蛋白、血細(xì)胞比容等，開始麻醉手術(shù)。取PRP 2 mL送檢，檢測PLT及WBC含量。將分離出的PRP置于水平震蕩儀振蕩保存，振蕩頻率為60 次/min，振幅5 cm。

1.3.2自體凝血酶制備 參照Franco等[13]制備自體凝血酶的方法，取PRP 1.5 mL與10%葡萄糖酸鈣溶液0.5 mL置入EP管混勻，37 ℃水浴15 min，水浴結(jié)束后，900×g離心10 min后，使用注射器接16 G 針頭吸出EP管上層物質(zhì)，即為自體凝血酶。

1.3.3PRP凝膠制備 觀察組將4 mL PRP與 1 mL 凝血酶分別置入注射器，通過醫(yī)用三通勻速推注混勻，噴入容器。對照組使用同樣方法將4 mL PRP與1 mL 10%葡萄糖酸鈣混合?；旌辖Y(jié)束時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔1分鐘觀察PRP是否聚集成半固體凝膠，若聚集凝集，將容器傾斜至60°，觀察PRP是否流動(dòng)；若3 min時(shí)不聚集，則之后每隔3分鐘觀察1次， 記錄凝集時(shí)間。若PRP與激活物混合30 min后仍未聚集，停止觀察，記為未凝集。

1.3.4自體血回輸 依據(jù)輸血原則，術(shù)中必要時(shí)將分離出的貧PLT血漿、紅細(xì)胞及剩余PRP回輸。術(shù)野回收自體血也根據(jù)輸血原則在必要時(shí)予以輸注。

2 結(jié) 果

所有患者在采血過程中血流動(dòng)力學(xué)無明顯變化，無相關(guān)不適主訴，均完成采血及PRP制備。30例患者的平均采血量為(316±34) mL，制備PRP(33±7) mL；與采血前相比，采血后血紅蛋白下降(8.1±1.4) g/L，血細(xì)胞比容下降(4.8±0.9)%。兩組患者的PRP生成量、PLT基礎(chǔ)值、PRP中PLT含量及富集度、WBC基礎(chǔ)值、PRP中WBC含量及富集度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。觀察組將PRP與5%葡萄糖酸鈣混合物水浴離心后制得自體凝血酶(圖1a)，將其與PRP混合后，可發(fā)生聚集形成PRG(圖1b)，其中12例2 min時(shí)凝集成凝膠，3例3 min時(shí)凝集，容器傾斜至60°不流動(dòng)；對照組PRP與5%葡萄糖酸鈣混合后30 min后均無凝集，容器傾斜至60°液體流動(dòng)。

3 討 論

PRP是全血經(jīng)離心分離后獲得，由于全血中紅細(xì)胞、WBC、血漿、PLT等血液成分比重不同，故將全血進(jìn)行離心時(shí)，各種血液成分會(huì)進(jìn)行分離，分為紅細(xì)胞、貧血小板血漿及PRP，PRP即據(jù)此原理制造。隨著PRP在臨床中的廣泛應(yīng)用，各類商用PRP制備套裝層出不窮。大多數(shù)商用套裝機(jī)器主體及耗材需分別購買，機(jī)器安裝需獨(dú)立空間[14]。自體血回收分離機(jī)為PRP制備裝置的一種，其同時(shí)具備制備PRP和術(shù)野自體血回收的功能。對于因預(yù)計(jì)術(shù)中出血量大而使用術(shù)野自體血回收的患者，自體血回收分離機(jī)僅在血液回收耗材基礎(chǔ)上增加成分血儲(chǔ)存袋，更改主機(jī)工作模式即可完成PRP制備。而其他類型設(shè)備需單獨(dú)設(shè)立空間安裝，故自體血回收分離機(jī)在圍手術(shù)期可一機(jī)兩用，節(jié)約手術(shù)室空間；同時(shí)管路共用，可節(jié)省成本，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前公認(rèn)的PRP的“富血小板”標(biāo)準(zhǔn)，需要PRP中的PLT濃度高于生理全血濃度至少4倍才能達(dá)到有效治療濃度[15-16]。根據(jù)含WBC數(shù)量的多少，PRP可分為富白細(xì)胞PRP和貧白細(xì)胞PRP，其中富白細(xì)胞PRP中的WBC可釋放出遞質(zhì)，誘導(dǎo)多種細(xì)胞黏附和聚集，從而具有更好的抗炎作用，更利于組織修復(fù)。目前，研究已證實(shí)自體血回收分離機(jī)制備PRP的效果[7-8]。本研究對自體血回收分離機(jī)制備的富白細(xì)胞PRP進(jìn)行檢驗(yàn)，其PLT和WBC含量均超過全血4倍，滿足后續(xù)自體凝血酶及PRG制備所需條件。

組別例數(shù)PRP生成量(mL)基礎(chǔ)PLT (×109/L)PPR PLT (×109/L)PLT富集度(倍)基礎(chǔ)WBC(×109/L)PRP WBC(×109/L)WBC富集度(倍)對照組1532.5±4.5203.7±31.4105 5.2±92.15.2±0.56.9±1.232.5±4.55.3±0.9觀察組1533.0±4.2210.9±24.5103 7.7±83.94.9±0.46.6±1.033.3±5.45.0±0.6t值0.2940.7000.5450.6430.5661.0700.748P值0.7710.4900.5900.5420.5760.2940.436

對照組：患者在術(shù)前30 min使用自體血回收分離機(jī)制備PRP，制備成功后，使用10%葡萄糖酸鈣激活PRP；觀察組：患者在術(shù)前30 min使用自體血回收分離機(jī)制備PRP，制備成功后，將制得的PRP 1.5 mL用于制備自體凝血酶，使用自體凝血酶激活自身PRP以制備PRG；PRP：富血小板血漿；PRG：富血小板凝膠；PLT：血小板；WBC：白細(xì)胞

PRP通過激活PLT，向周圍環(huán)境釋放其顆粒內(nèi)容物，發(fā)揮促生長及炎癥抑制作用。PLT被激活后會(huì)釋放多種內(nèi)容物，包括刺激細(xì)胞增殖、合成與代謝的生長因子(血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-13、血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子等)。同時(shí)，PLT還會(huì)釋放一些炎癥反應(yīng)抑制因子，抑制由白細(xì)胞介素-1β引起的炎癥反應(yīng)，使細(xì)胞不受炎癥反應(yīng)的損傷，如γ干擾素、白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑、可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅰ和Ⅱ、白細(xì)胞介素-10 、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-13等。除上述生長因子及炎癥因子外，PLT還會(huì)釋放纖維蛋白原，纖維蛋白原聚合為纖維蛋白，形成具有一定強(qiáng)度和黏附性、肉眼可見的網(wǎng)狀凝膠，即PRG。在聚合過程中，纖維蛋白原參與凝血、收縮創(chuàng)面，為修復(fù)細(xì)胞增殖提供生物支架，對損傷愈合有促進(jìn)作用[16-18]。體外應(yīng)用時(shí)PRP必須激活后使用；當(dāng)作為組織包埋媒介或止血?jiǎng)r(shí)PRP也需要激活。其激活方法有加入氯化鈣或凝血酶，同時(shí)加入氯化鈣和凝血酶以及物理方法等，目前最常用的方法為添加牛凝血酶和氯化鈣[5-6,19-20]。但這種方法制備的PRG存在一定風(fēng)險(xiǎn)：牛凝血酶的添加會(huì)導(dǎo)致凝血因子Ⅴ、Ⅺ抗體形成，并有發(fā)生嚴(yán)重凝血紊亂的可能性，甚至?xí){生命[21-22]。目前，國內(nèi)動(dòng)物來源凝血酶成品價(jià)格較高，其用于人體有過敏、排異等風(fēng)險(xiǎn)，且用于關(guān)節(jié)腔內(nèi)或深部組織注射的安全性尚未完全證實(shí)。有文獻(xiàn)報(bào)道，可使用PRP制備自體凝血酶[13]。本研究在PRP中加入5%葡萄糖酸鈣經(jīng)水浴、離心制得自體凝血酶，并進(jìn)一步成功將PRP激活形成凝膠，證實(shí)了自體凝血酶制備及激活PRP的可行性。使用自體凝血酶激活PRP，不僅避免了過敏與排異的可能，免除異種生物制劑進(jìn)入關(guān)節(jié)腔的風(fēng)險(xiǎn)，還可降低醫(yī)療成本。

未激活PRP呈液態(tài)，其局部用于創(chuàng)面或手術(shù)切口內(nèi)，會(huì)在重力作用下流向最低位置，與創(chuàng)面接觸時(shí)間短，無法充分發(fā)揮作用。PRP與激活劑混合后，凝集為PRG，流動(dòng)性降低，附著于創(chuàng)面，延長作用時(shí)間。而激活劑與PRP混合后短時(shí)間內(nèi)凝集形成PRG，可保證PRG與創(chuàng)面的作用時(shí)間。若激活劑作用于PRP形成PRG所需時(shí)間過長，則PRP可能在未形成PRG時(shí)即因重力作用離開創(chuàng)面，無法保證PRG有效成分充分發(fā)揮作用。本研究在激活劑與PRP混合觀察30 min后即停止，其不足之處為5%葡萄糖酸鈣可能在超過30 min后激活PRP形成PRG而未被觀察到，但即使可激活，其臨床應(yīng)用意義不大。

綜上所述，圍手術(shù)期利用自體血回收分離機(jī)制備自體PRP具有可行性，PRP中的PLT可達(dá)到治療水平。同時(shí)，使用PRP水浴離心制備自體凝血酶，進(jìn)一步激活制備PRG方法可行，且簡便經(jīng)濟(jì)。