基于不同培養(yǎng)基底的肝癌細(xì)胞成像及力學(xué)特性分析

謝瑩，王佳佳，王瑩，曲英敏

（長春理工大學(xué) 國家納米操縱與制造國際聯(lián)合研究中心，長春 130022）

二十世紀(jì)八十年代初，掃描隧道顯微鏡（Scanning Tunneling Microscope，STM）的問世，使得人類首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)原子在物質(zhì)表面排列狀態(tài)的實(shí)時(shí)觀察，這對(duì)材料科學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)且不可磨滅的影響。掃描隧道顯微鏡的工作原理是基于量子力學(xué)的隧道效應(yīng)，這就要求所觀察的物體必須具有一定的導(dǎo)電能力，因而在一定程度上限制了它的應(yīng)用范圍。為了彌補(bǔ)這一不足，Binnig等人于1986年在掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)上成功研制出了原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope，AFM）［1］，在納米尺度上實(shí)現(xiàn)了對(duì)導(dǎo)電和非導(dǎo)電樣品的三維觀測。原子力顯微鏡具有對(duì)測試材料不敏感以及對(duì)應(yīng)用環(huán)境要求寬松等優(yōu)點(diǎn)，所有操作可在特定氣體、大氣和液相（如生理緩沖液等）中進(jìn)行，甚至可直接在近生理?xiàng)l件下實(shí)現(xiàn)對(duì)生物細(xì)胞［2］、病毒［3］、蛋白質(zhì)分子［4］等的實(shí)時(shí)監(jiān)測、表征和操縱，并輸出具有超高分辨率的三維圖像及信息，這種獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使其逐漸發(fā)展成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的有效工具［5］。隨著時(shí)間的推移，人們逐漸認(rèn)識(shí)到AFM是直接表征生物樣品表面信息和力學(xué)性能的理想工具［6-9］。

肝癌，即肝臟惡性腫瘤，是我國高發(fā)的、危害極大的惡性腫瘤。肝癌的發(fā)病原因是受環(huán)境和飲食等多因素、多步驟影響的復(fù)雜過程，且其分子機(jī)制尚不完全清楚。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國肝癌的年死亡率在惡性腫瘤死亡順位中占第二位，但截至目前為止，仍然缺少預(yù)防或治療肝癌的有效手段，導(dǎo)致病患在身體和心理上遭受巨大的痛苦。由于癌癥的可怕性及危害性，人人談癌色變。目前，在全世界范圍內(nèi)每年都投入巨大的人力和物力致力于研發(fā)治療癌癥的有效方式和藥物，雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍然難以解決治愈癌癥的難題。

形貌特征和力學(xué)信息是細(xì)胞的兩個(gè)基本特性，與細(xì)胞的基本功能直接相關(guān)，并且可以作為判斷疾病狀態(tài)的參考指標(biāo)。為了推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域?qū)Σ∽兗?xì)胞特征的深入研究，進(jìn)一步了解肝癌突變細(xì)胞的形貌和力學(xué)信息，為癌癥藥物的研發(fā)和療效評(píng)估提供參考依據(jù)，本文以人肝癌細(xì)胞SMMC-7721為樣本，采用 AFM（JPK NanoWizard? 3 BioScience）對(duì)培養(yǎng)于蓋玻片、石英和ITO表面的細(xì)胞形貌特征和力學(xué)特性進(jìn)行了深入的測量和對(duì)比分析。

1 AFM工作原理

AFM是一種納米級(jí)測量分析儀器，也能夠進(jìn)行納米刻蝕、納米操縱，細(xì)胞與基底或細(xì)胞間相互作用力譜實(shí)驗(yàn)。AFM主要由力檢測單元、光傳感單元和反饋單元構(gòu)成，如圖1所示［10］。在該系統(tǒng)中，利用微懸臂檢測探針針尖與待測樣品表面之間不斷變化的相互作用力，這種力的變化會(huì)促進(jìn)微懸臂的擺動(dòng)，進(jìn)而使得照射在微懸臂末端的激光反射光的位置發(fā)生偏移，從而引起四象限中光電探測器的位置發(fā)生改變，反饋系統(tǒng)根據(jù)其位置的改變量對(duì)系統(tǒng)做出調(diào)整指令，然后計(jì)算機(jī)將數(shù)據(jù)加以分析處理并轉(zhuǎn)換成圖像呈現(xiàn)出來。

圖1 AFM系統(tǒng)示意圖

以探針與樣品表面距離的不同為依據(jù)，AFM的工作模式可以劃分為接觸成像模式（Contact Mode）、非接觸成像模式（Non-Contact Mode）和輕敲模式（Tapping Mode）。

接觸成像模式，也被稱為靜態(tài)掃描模式，是AFM中較為常用的工作模式。在成像過程中，探針尖端始終在樣品表面上方震蕩并與樣品表面保持一定程度的接觸，這種持續(xù)性的接觸可能會(huì)對(duì)樣品表面造成一定程度的損壞。接觸模式利用樣品與探針間不斷改變的作用力（主要是原子間的庫倫排斥力）引起微懸臂的不同形變，進(jìn)而得到樣品表面形貌信息的高分辨率圖像。

在非接觸模式成像過程中，探針始終在距離樣品表面幾個(gè)納米的位置震蕩以減小對(duì)樣品的損傷。在這種工作模式下，原子間的相互作用以范德華吸引力為主，但由于針尖與樣品的非接觸導(dǎo)致圖像分辨率低，容易引起反饋不穩(wěn)。非接觸模式的探針振動(dòng)會(huì)對(duì)液體造成較大的擾動(dòng)，所以該模式不適用于液相下工作，這在一定程度上限制了它的應(yīng)用范圍。

輕敲模式的工作原理與上述兩種方式有所不同，探針的微懸臂始終在其共振頻率范圍內(nèi)保持振動(dòng)，并通過在一定的時(shí)間間隔內(nèi)敲擊樣品表面的形式與樣品保持短暫的接觸，既不會(huì)損傷樣品也能解除對(duì)分辨率的影響。在這種工作模式下，反饋系統(tǒng)會(huì)根據(jù)探針振動(dòng)頻率的變化及時(shí)更改壓電陶瓷施加的電壓值，從而獲得樣品的表面形貌。

在JPK系統(tǒng)中，存在一種特殊的工作模式，即Quantitative Imaging（QI）模式，其工作原理與輕敲模式相似，在獲得樣品形貌的同時(shí)還能夠得到每一個(gè)像素對(duì)應(yīng)的力學(xué)曲線，主要用于對(duì)生物樣品的測量，文章中展示的圖像均是通過QI模式獲得的。

2 實(shí)驗(yàn)材料及方法

（1）細(xì)胞

將人肝癌細(xì)胞SMMC-7721置于含有10%胎牛血清（FBS，HyClone）的RPMI-1640培養(yǎng)液（Hy-Clone）中，并在環(huán)境溫度為37°、CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天。要求每天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一次培養(yǎng)液更換并檢查細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞繁殖到覆蓋80%的培養(yǎng)瓶時(shí)，用1 mL胰蛋白酶處理1分鐘使其變成懸浮液，然后用移液槍量取40 μL的細(xì)胞懸浮液并分別平鋪到蓋玻片、石英和ITO基底上。實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞取出，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）緩緩地沖洗基底上的細(xì)胞，以去除雜質(zhì)和凋亡細(xì)胞。

（2）探針

在細(xì)胞成像和楊氏模量測量的過程中，選擇懸臂梁材料為氮化硅的探針（MLCT，BRUKER）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。探針給定的彈性系數(shù)為0.07 N/m，針尖半徑為20 nm，共振頻率為22 kHz。在實(shí)驗(yàn)開始前，以硅片為參考對(duì)象對(duì)探針的彈性系數(shù)進(jìn)行了校準(zhǔn)，校準(zhǔn)后的數(shù)值為0.065 N/m，并將這一數(shù)值用于以下的力學(xué)數(shù)據(jù)測量和計(jì)算中。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）細(xì)胞成像

表面形態(tài)特征對(duì)于癌細(xì)胞的研究是必不可少的，為了獲得基底材料對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，將培養(yǎng)于近生理?xiàng)l件下的SMMC-7721肝癌細(xì)胞在QI模式下進(jìn)行了成像實(shí)驗(yàn)。在圖像掃描范圍為50 μm×50 μm，掃描速度為300 μm/s，像素設(shè)置為256×256的條件下，獲得了如圖 2（a）、圖 2（b）和圖 2（c）所示的三組分別培養(yǎng)于蓋玻片、石英和ITO基底的SMMC-7721活細(xì)胞的表面形貌圖。從圖中可以看出，培養(yǎng)于蓋玻片和石英基底的細(xì)胞整體呈現(xiàn)橢圓形結(jié)構(gòu)，且表面光滑，輪廓清晰，細(xì)胞表面沒有明顯的雜質(zhì)；而培養(yǎng)于ITO基底的細(xì)胞呈現(xiàn)出類梭形結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜表面的精細(xì)結(jié)構(gòu)清晰可見。

為了獲得培養(yǎng)于上述三種基底的SMMC-7721肝癌細(xì)胞在橫向和縱向伸展的差異，選取圖2（a）-圖2（c）中虛線位置的斷面，對(duì)細(xì)胞橫截面的高度和寬度數(shù)據(jù)進(jìn)行測量，對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖2（d）-圖2（f）中。由此可以看出，細(xì)胞的生長呈現(xiàn)出中間高兩側(cè)低的趨勢(shì)，最高位置出現(xiàn)在細(xì)胞中心線附近。相比較來說，這三種基底對(duì)細(xì)胞的生長尺寸影響不大，其寬度在25 μm左右，高度在4 μm左右。

（2）黏附力測量

為了獲得細(xì)胞與探針間的黏附信息，相關(guān)的圖像處理軟件也被用于分析細(xì)胞在成像過程中與探針間作用力的大小，由此得到了細(xì)胞-探針之間對(duì)應(yīng)的黏附力，并繪制成如圖3所示的細(xì)胞-探針黏附力分布圖。由圖片右側(cè)的標(biāo)尺信息可知，圖中較暗的區(qū)域與較小的黏附力相對(duì)應(yīng)，較亮的區(qū)域與較大的黏附力相對(duì)應(yīng)。三者的黏附關(guān)系均呈現(xiàn)出由細(xì)胞中心向四周逐漸增加的趨勢(shì)，最低值位于細(xì)胞中心附近。此外，培養(yǎng)于蓋玻片基底的細(xì)胞-探針之間的黏附力稍大一些，石英和ITO基底的細(xì)胞-探針之間的黏附力大小相當(dāng)?？傮w來說，細(xì)胞-探針之間的黏附力小于基底-探針之間的黏附力。

為了進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)在不同基底上生長的SMMC-7721肝癌細(xì)胞與探針間作用力的大小，在每一種基底上選取10個(gè)形態(tài)較好的細(xì)胞作為樣本，其中每個(gè)細(xì)胞選擇10個(gè)測試點(diǎn)，并將對(duì)應(yīng)位置的細(xì)胞-探針間的作用力數(shù)值統(tǒng)計(jì)成如圖5所示的統(tǒng)計(jì)圖。由此可以看出，生長在蓋玻片上的細(xì)胞與探針間的黏附力范圍稍大，石英基底的細(xì)胞與探針間的黏附力范圍較小，ITO基底的細(xì)胞與探針間的黏附力分布較平均。

圖2 培養(yǎng)于不同基底的SMMC-7721肝癌細(xì)胞的AFM圖像及與之對(duì)應(yīng)的細(xì)胞高度-寬度圖

圖3 培養(yǎng)于不同基底的SMMC-7721肝癌細(xì)胞與探針間的黏附關(guān)系

圖4 培養(yǎng)于不同基底的SMMC-7721肝癌細(xì)胞與探針間的黏附統(tǒng)計(jì)圖

圖5 培養(yǎng)于不同基底的SMMC-7721肝癌細(xì)胞的楊氏模量分布圖

（3）楊氏模量測量

為了表征基底對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞力學(xué)特性的影響，了解細(xì)胞表面的硬度分布及楊氏模量信息，采用三角錐形探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了壓痕實(shí)驗(yàn)。在完成探針彈性系數(shù)的校準(zhǔn)、基線調(diào)整以及尋找接觸點(diǎn)等一系列必要操作后，采用Hertz模型對(duì)細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)特性分析，并獲得了如圖5所示的培養(yǎng)于不同基底的SMMC-7721肝癌細(xì)胞楊氏模量分布圖。圖中較暗的區(qū)域?qū)?yīng)較低的楊氏模量值，代表硬度低，而較亮的區(qū)域?qū)?yīng)較高的楊氏模量值，代表硬度高。從圖中可以看出，在三種不同基底生長的細(xì)胞楊氏模量范圍大小相當(dāng)，即基底導(dǎo)致的細(xì)胞楊氏模量值的差異并不顯著，且細(xì)胞邊緣的楊氏模量明顯低于中心位置的楊氏模量，即細(xì)胞中心的硬度更高。

為了進(jìn)一步掌握基底引起的SMMC-7721肝癌細(xì)胞楊氏模量的差異，在每種基底上對(duì)10個(gè)細(xì)胞樣品進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，其中每個(gè)細(xì)胞采集10個(gè)數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖6所示。由此可以看出，三種基底的細(xì)胞楊氏模量均在700～1 100 Pa區(qū)間分布較為集中，而在較低值和較高值區(qū)間的分布相對(duì)零散，但三者分布趨勢(shì)的差異并不顯著。

4 結(jié)論

本文利用AFM技術(shù)對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的形貌及力學(xué)特性進(jìn)行了表征，著重分析了不同基底的細(xì)胞在形貌、細(xì)胞-探針間粘附關(guān)系和細(xì)胞表面楊氏模量的分布等三個(gè)方面的差異，并得到基底對(duì)細(xì)胞大小和楊氏模量的分布影響較小，而細(xì)胞與探針間的黏附稍有差別。進(jìn)一步確定了SMMC-7721細(xì)胞的基礎(chǔ)力學(xué)信息，希望能夠?yàn)榕R床醫(yī)學(xué)提供參考，促進(jìn)癌癥藥物的研發(fā)。

圖6 培養(yǎng)于不同基底的SMMC-7721肝癌細(xì)胞的楊氏模量統(tǒng)計(jì)圖