磁性載體蛋白抗體阻斷劑制備及性能測定

(上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 上海200240)

人體外診斷(IVD)免疫檢測方法在臨床疾病診斷檢測中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。由于人群存在著基礎(chǔ)生理狀態(tài)的個體差異和疾病階段、狀態(tài)的差異，因此待測臨床體液樣品中往往存在多種干擾檢測準確性的因子， 如嗜異性抗體(HA)，或者能與患者自身免疫球蛋白(Ig)反應(yīng)的類風(fēng)濕因子(RF)，均可能與動物Ig發(fā)生交叉反應(yīng)，而免疫測定通常使用動物源抗體特異識別疾病相關(guān)標志物，結(jié)果導(dǎo)致誤診[1]。此外，在疫苗新藥研發(fā)中需要進行免疫反應(yīng)強度檢測和保護效果評估，對靶標表位的免疫檢測具有重要意義。由于半抗原(如細菌莢膜多糖)或多肽表位自身免疫原性較弱，需要與大分子量的載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)，因此要求載體蛋白具有促進半抗原的識別、遞呈、抗原特異免疫反應(yīng)等免疫增強作用。疫苗常用載體蛋白有白喉毒素(DT)、白喉毒素突變株(CRM197)、破傷風(fēng)類毒素、 霍亂毒素B鏈(CTB)等。 在腫瘤自體抗原疫苗設(shè)計中，使用載體蛋白可以幫助突破免疫耐受和增強自體抗原的免疫原性。近幾年研究表明，白喉毒素跨膜結(jié)構(gòu)域(DTT)是一個很好的載體蛋白，其三維結(jié)構(gòu)全部由α螺旋和轉(zhuǎn)折構(gòu)成，因而具有很高的穩(wěn)定性[2]，可以作為表位肽移植骨架幫助維持表位肽空間構(gòu)象[3]。DTT還可以促進重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達，簡化了疫苗重組蛋白的制造工藝，顯著降低成本?；贒TT的重組抗原如DTT -血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[4]和DTT -腫瘤壞死因子第119位的酪氨酸突變?yōu)樘於０?hTNFY119N)(DTT-hTNFmut)分別在腫瘤和關(guān)節(jié)炎小鼠模型研究中有非常好的療效。載體蛋白不僅能激活T輔助細胞，還能激活B細胞產(chǎn)生載體蛋白特異性抗體，這些抗體的數(shù)量通常是多糖的幾十到幾百倍[5]。DTT本身產(chǎn)生的抗體往往比腫瘤壞死因子(TNF)表位抗體滴度也多一個數(shù)量級以上，常干擾靶標抗原的抗體檢測[6]，因此，在分析血清抗體的酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)時需要用高純度的特異抗原。特異抗原純度與制備純化成本成正比，而DTT作為多種疫苗共有的載體，可以在多種疫苗研發(fā)檢測中使用，具有更廣的用途。為此，本文中試圖采用基于磁珠的DTT親和吸附特性去除血清中的DTT抗體，簡化去除操作步驟，縮短操作時間，提高特異抗原抗體免疫檢測的精準度。

葡聚糖納米磁珠是一種很好的磁力輔助分離材料，比表面積大[7]和分散度高的特點使其能結(jié)合捕獲較多的待測物，利用外加磁場實現(xiàn)快速分離。納米磁珠與抗體或抗原偶聯(lián)后，可從臨床樣品中快速富集抗原或抗體，用于疾病快速檢測和診斷，比經(jīng)典的ELISA檢測和普通斑點熒光檢測更靈敏[8]。

本文中利用高溫多元醇法[9-10]合成葡聚糖納米磁珠，經(jīng)溴化氰活化后[11-12]，共價偶聯(lián)載體蛋白DTT，制備納米磁珠(MP)-DTT抗體阻斷劑；與小鼠抗血清分別在4、 37 ℃動態(tài)孵育，血清中的DTT抗體與MP-DTT特異結(jié)合而被去除；通過ELISA檢測血清中剩余的DTT抗體含量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

主要材料包括：pGEX-6P-1-DTT、 pET-28a-hTNFmut重組質(zhì)粒， 上海交通大學(xué)生物制造實驗室構(gòu)建；DH5α、BL21 (或DE3)感受態(tài)，天根生化科技(北京)有限公司；谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶 -鎳(GST-Ni)親和層析柱，美國GE公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)， 美國Sigma公司； 聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒， 上海翊圣生物科技有限公司； 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液， 天根生化科技(北京)有限公司； 辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗人IgG抗體，上海中科英沐生物有限公司；品系為C57BL/6的小鼠(6～8周齡，雌性，無特定病原體(SPF)級)，上海斯萊克實驗動物有限公司；免疫過DTT-VEGF或DTT-hTNFmut的小鼠抗血清，上海交通大學(xué)生物制造實驗室制備。

1.2 包裹葡聚糖的四氧化三鐵納米磁珠合成與活化

合成包裹有葡聚糖反應(yīng)臂的四氧化三鐵納米磁珠。分別稱取5.41 g六水合三氯化鐵、 1.99 g四水合氯化亞鐵(兩者物質(zhì)的量比為2 ∶1)， 將5 g分子量為40 000的葡聚糖溶解于200 mL一縮二乙二醇(DEG)中， 在210 ℃條件下充分攪拌反應(yīng)30 min后，用蠕動泵以18 mL/min的速率加入20 mL濃度為50 mmol/L氫氧化鈉反應(yīng)液(溶解于DEG溶劑)，在210 ℃條件下反應(yīng)2 h。 待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后， 先后用乙酸乙酯和質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇(體積比為1 ∶1)的混合溶液、質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇和去離子水(體積比為1 ∶1)的混合溶液清洗磁珠，除去未反應(yīng)物和DEG，最后將終產(chǎn)物分散在去離子水中。在通風(fēng)櫥中，乙腈清洗磁珠，向3 mL磁珠(風(fēng)干后的質(zhì)量為294 mg)中邊搖晃邊逐滴加入3 mL濃度為1 mol/L的溴化氰溶液，反應(yīng)1 min后逐滴加入3 mL濃度為1.5 mol/L的三乙胺終止液， 終止反應(yīng)3 min。反應(yīng)結(jié)束后立即將溶液倒入冰浴的清洗液(乙腈和濃度為0.1 mol/L的鹽酸，體積比為1 ∶1)，用磁鐵在底部吸附磁珠，棄上清。 依次用乙腈、 冰水、 偶聯(lián)緩沖液(濃度為0.1 mol/L的碳酸氫鈉和濃度為0.5 mol/L的氯化鈉的混合溶液，pH=8.5)清洗磁珠，以供后續(xù)與蛋白進行偶聯(lián)。

1.3 蛋白表達純化與鑒定

分別將pGEX-6p-1-DTT、pET-28a-hTNFmut轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂平板后于37 ℃培養(yǎng)，待菌落長至適當大小后挑選單克隆搖菌提質(zhì)粒，確認序列正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)，挑選10個單克隆小批量誘導(dǎo)，通過電泳結(jié)果選擇目的蛋白表達量最高的菌。將高表達菌液發(fā)酵至吸光度(OD)值達到0.6后，加入一定濃度為1 mol/L的IPTG溶液至最終濃度為1 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)表達24 h后離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎，高速離心分離收集上清，分別過GST-Ni親和層析柱進行純化獲得目的蛋白。收集洗脫峰，用切割蛋白酶(PSP)或小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)酶切除谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶 -組氨酸(GST-His)標簽后再次過GST-Ni親和層析柱，收集流穿液進行十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和BCA蛋白濃度測定后，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DTT蛋白與納米磁珠偶聯(lián)

用截留分子量為3 ku的超濾管將DTT體系置換到偶聯(lián)緩沖液中，與2.4 mL活化后的磁珠混勻，在4 ℃冰柜中旋轉(zhuǎn)孵育20 h后取出上清，BCA法測定偶聯(lián)前、 后的蛋白濃度，差減法計算偶聯(lián)到磁珠上的DTT蛋白含量。

1.5 ELISA檢測

用包被液稀釋DTT、 hTNFmut至質(zhì)量濃度為1 mg/L， 每孔100 μL，4 ℃孵育過夜。用300 μL封閉液，在37 ℃封閉1 h。 稀釋液梯度稀釋被測血清， 每孔100 μL， 37 ℃孵育1 h。每孔加100 μL稀釋5 000倍HRP標記的羊抗鼠IgG， 37 ℃孵育1 h。底物TMB 37 ℃顯色反應(yīng)10 min。利用濃度為2 mol/L的硫酸終止后， 酶標儀測定波長為450 nm時的吸光值。利用Graphpad Prism 5.0軟件，分析實驗組與對照組在波長為450 nm條件下的吸光值之比不小于2.1時的最大稀釋倍數(shù)作為抗血清的效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 四氧化三鐵納米磁珠的磁響應(yīng)性

將0.5 mL磁珠混勻在10 mL去離子水中,放置在磁場強度為1.5×106A/m的豎直磁場下，在不同時間點于大約1/2液體高度處取樣，測定在波長為600 nm時的透光率，如圖1所示。由圖可知，1 min之后90%以上的納米磁珠能夠被吸附到試管底，磁響應(yīng)性較好。

圖1 四氧化三鐵納米磁珠的磁響應(yīng)性

2.2 重組蛋白的表達純化與鑒定

GST-DTT和His-SUMO-hTNFmut重組質(zhì)粒的表達菌株經(jīng)小量試表達篩選得到高表達單克隆后，進行發(fā)酵規(guī)模表達。通過GST或鎳 -金屬鰲合親和層析介質(zhì)(Ni-IDA)親和層析純化以及PSP或SUMO蛋白酶切除標簽后，分別獲得DTT和hTNFmut蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示純化獲得的蛋白分子量符合預(yù)期理論值，DTT分子量為20 ku ，hTNFmut分子量為17 ku，分別如圖2(a)、(b)所示?；叶确治霰砻鞯鞍准兌染?5%以上。BCA法測得DTT、hTNFmut的蛋白質(zhì)量濃度分別為3.0、 2.1 g/L。

圖2 白喉毒素跨膜結(jié)構(gòu)域(DTT)、腫瘤壞死因子第119位的酪氨酸突變?yōu)樘於０?hTNFmut)蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測

2.3 納米磁珠活化以及與DTT供價偶聯(lián)

納米磁珠經(jīng)溴化氰活化反應(yīng)臂后與DTT蛋白孵育(條件為4 ℃、 16 h)，BCA法測定偶聯(lián)前、 后的蛋白濃度，計算出磁珠上偶聯(lián)的DTT的蛋白密度，結(jié)果如表1所示。圖3所示為偶聯(lián)前、 后的上清液經(jīng)SDS-PAGE檢測的結(jié)果，與BCA蛋白定量結(jié)果一致，計算可得DTT的偶聯(lián)效率高達98%。

表1 四氧化三鐵納米磁珠與白喉毒素跨膜結(jié)構(gòu)域(DTT)偶聯(lián)前、后的蛋白量的變化

泳道1、 2、 3—蛋白分子量標準(蛋白Marker)、偶聯(lián)前DTT、偶聯(lián)后DTT。圖3 白喉毒素跨膜結(jié)構(gòu)域(DTT)與磁珠偶聯(lián)前、后上清十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測

2.4 血清學(xué)檢測

0.2 mL的MP-DTT與3 μL的DTT-VEGF抗血清在4 ℃下旋轉(zhuǎn)孵育16 h， 血清吸附前、后ELISA檢測結(jié)果如圖4(a)所示， 血清中的DTT抗體效價由1 ∶35 840降至0。 圖4(b)、 (c)所示為DTT-hTNFmut抗血清在37 ℃條件下與MP-DTT旋轉(zhuǎn)孵育不同時間后的血清ELISA檢測結(jié)果。從圖中可以看出，孵育1 h后的血清稀釋3 200倍的條件下，DTT抗體去除率為55.5%，效果最好；但由于血清中DTT抗體水平太高，而磁珠用量又不足，因此血清中DTT抗體去除不徹底。

3 討論

對于多糖不完全抗原、構(gòu)象表位或者容易產(chǎn)生免疫耐受的自身抗原，可以通過與載體蛋白交聯(lián)、或者移植重組來提高其免疫原性。由于載體蛋白本身具有很強免疫原性，產(chǎn)生的抗體滴度是半抗原和靶表位的幾十到幾百倍，因此會嚴重干擾疫苗靶抗原抗體檢測。本文中建立了利用載體蛋白納米磁珠作為親和介質(zhì)，從血清中去除針對載體抗體的方法，有效地減弱了酶聯(lián)免疫檢測中載體對靶抗原抗體的交叉反應(yīng)。本文中探究了不同溫度和時間對DTT抗體去除效果的影響，結(jié)果表明：4 ℃動態(tài)孵育16 h能去除90%以上的DTT抗體；37 ℃旋轉(zhuǎn)孵育時間只需1 h。 此外，蛋白偶聯(lián)量、磁珠用量、血清用量均會影響抗體的去除效果。

(a)白喉毒素跨膜結(jié)構(gòu)域 -血管內(nèi)皮生長因子(DTT-VEGF)抗血清經(jīng)磁性載體 -白喉毒素跨膜結(jié)構(gòu)域(MP-DTT)于37 ℃時吸附前、 后的DTT抗體水平

(b)白喉毒素跨膜結(jié)構(gòu)域 -腫瘤壞死因子第119位的酪氨酸突變?yōu)樘於０?DTT-hTNFmut)抗血清經(jīng)MP-DTT于4 ℃時吸附前、 后的hTNFmut抗體水平

(c)DTT-hTNFmut抗血清經(jīng)MP-DTT于4 ℃時吸附前、 后的DTT抗體水平圖4 四氧化三鐵納米磁珠吸附前、 后血清在波長為450 nm條件下的酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)

常規(guī)的免疫吸附法只適用于能夠通過離心沉淀的大顆粒抗原物質(zhì)，例如菌體抗原抗體的純化，使用范圍有限[13-14]。本文中基于免疫吸附法的原理，制備的磁性載體蛋白抗體阻斷劑是一種比表面積較大的磁性載體，在動態(tài)的旋轉(zhuǎn)孵育中，給抗原抗體的結(jié)合提供了更多的機會，通過磁力克服了大顆?？乖镔|(zhì)和顆粒吸附劑的分離難題，能充分將血清中的雜抗體去除干凈，并實現(xiàn)了快速分離。

臨床上利用夾心法進行免疫檢測時會面臨HA、 RF的干擾， 目前市場上有多款能夠降低免疫檢測中非特異性結(jié)合的抗體阻斷劑， 包括美國Meridian Life Science公司開發(fā)的一種名為TRU BlockTM的阻斷劑。IgM抗體檢測是早期和近期感染的重要診斷指標之一，然而IgM抗體豐度較低而IgG豐度高，為了確保檢測的精準度，需要阻斷含量豐富的IgG抗體和其他非特異性蛋白質(zhì)。未來可以將納米磁珠作為固相載體與阻斷劑結(jié)合，不僅能夠有效去除多種干擾，還能夠重復(fù)利用、 降低成本。