生物體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)分離提取研究

湯安英

（貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴陽(yáng) 550001）

隨著微生物在制藥工程中的突破性應(yīng)用，越來(lái)越多的人把目光投向生物抗菌活性物質(zhì)的應(yīng)用。各類生物由于生存在不同的自然環(huán)境中，其抗菌活性物質(zhì)作用各不相同。目前，人們已經(jīng)從各類生物體內(nèi)提取各種抗菌活性物質(zhì)并運(yùn)用于醫(yī)療保健、食物防腐等方面。

1 抗菌活性物質(zhì)來(lái)源

1.1 植物內(nèi)生真菌抗菌活性物質(zhì)

研究者大多都集中研究植物內(nèi)生真菌的抗菌活性。植物內(nèi)生菌是寄生在植物組織中的一大類群特殊微生物，越來(lái)越多的研究表明，運(yùn)用植物內(nèi)生菌能研制大量新型藥物。例如，蛹蟲(chóng)草菌株中抗菌效果較強(qiáng)的CF2菌株對(duì)芽孢桿菌的抑制率較高，對(duì)酵母菌和黑曲霉菌落的生長(zhǎng)也有部分抑制作用[1]；運(yùn)用牛津杯法和最小濃度測(cè)定比較浮萍提取物的體外抗菌活性，結(jié)果表明浮萍甲醇提取物、95%乙醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和農(nóng)桿菌均有不同程度的抑菌效果；該研究表明，結(jié)合浮萍的自身特性，對(duì)浮萍提取物進(jìn)行篩選，能顯著促進(jìn)優(yōu)良藥物的開(kāi)發(fā)[2]。此外，丹參內(nèi)生菌中分離到的一個(gè)抗菌生物堿能有效保護(hù)丹參免受病原真菌的感染[3]；而艾葉中的抑菌物質(zhì)主要是艾葉中的揮發(fā)油，其具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌等有效作用，艾葉的水提物還具有一定的抗肝癌活性作用[4]。近年來(lái)，廖敏等[5]對(duì)阿壩地區(qū)狼毒內(nèi)生放線菌的抗菌活性也有所研究。

1.2 海洋微生物體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)

隨著科學(xué)不斷發(fā)展和進(jìn)一步的深入研究，研究者對(duì)海洋微生物體內(nèi)分泌的抗菌活性物質(zhì)也有了初步研究。海洋環(huán)境較陸地相比，有高壓、高鹽、貧營(yíng)養(yǎng)和低溫等突出特點(diǎn)。為適應(yīng)極其復(fù)雜的海洋環(huán)境，海洋中的微生物有其獨(dú)特特征。自人類開(kāi)發(fā)利用海洋資源以來(lái)，捕撈業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、航海業(yè)以及工業(yè)的快速發(fā)展，使海洋的生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，生態(tài)平衡岌岌可危。海洋微生物以其快速的繁殖速度和強(qiáng)大的適應(yīng)能力在不斷改變的海洋中迅速形成異常環(huán)境微生物區(qū)系，并通過(guò)氧化還原活動(dòng)來(lái)達(dá)到并調(diào)整新的動(dòng)態(tài)平衡。因此，相對(duì)于陸地動(dòng)植物和土壤微生物，海洋微生物由于其獨(dú)特的生存和代謝方式，可以產(chǎn)生特殊的抗菌活性物質(zhì)，對(duì)當(dāng)前的藥物研制與開(kāi)發(fā)具有較大作用。

大多數(shù)海洋細(xì)菌都會(huì)產(chǎn)生抗生素，包括假單胞菌屬、黃桿菌屬、芽孢桿菌屬、欽式菌屬、弧菌屬及許多未鑒定的菌種。海洋假單胞菌中分離得到的抗菌蛋白CAP-1對(duì)枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等具有廣譜的抗菌作用，該蛋白可作為開(kāi)發(fā)無(wú)毒抗菌劑的先導(dǎo)化合物。而目前對(duì)海洋真菌的研究較多，主要集中于青霉和曲霉，其不管對(duì)人類、植物還是水生病原菌都有很強(qiáng)的抗菌活性。目前，只有少數(shù)海洋微生物應(yīng)用于臨床研究，但隨著對(duì)海洋資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)，在海洋微生物抗菌活性物質(zhì)提取方面的成果必將對(duì)新型藥物產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到重要作用[6]。

1.3 動(dòng)物體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)

目前，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)或體表抗菌活性物質(zhì)的研究較植物和海洋微生物較少，已知的有對(duì)東亞飛蝗、黃粉蟲(chóng)、星斑川鰈、草魚(yú)和柞蠶等體內(nèi)的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離和提取。由于外源異物刺激，黃粉蟲(chóng)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生一種肽類物質(zhì)，這類物質(zhì)具有抗菌或殺菌活性。用各類有機(jī)溶劑對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)勻漿物進(jìn)行浸泡，提取黃粉蟲(chóng)體內(nèi)的脂類活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物對(duì)大腸桿菌、金色葡萄糖球菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、黃曲霉和黑曲霉的抑菌效果最好[7]。駱雪等[8]發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗抗菌活性物質(zhì)粗提液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（如枯草芽孢桿菌、金色葡萄糖球菌等）或革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、水稻白葉枯病原菌）均有一定的抑制作用，其中對(duì)金色葡萄糖球菌的抑制作用最為明顯。魚(yú)類黏液中含有大量非特異性抗菌活性成分，在自然條件下可抵抗微量病原菌的侵害，是魚(yú)類先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。星川班鰈相關(guān)免疫組織如脾臟、腎臟、后腸及皮膚黏液提取物對(duì)鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和愛(ài)德華式菌具有抗菌活性[9]。劉倫倫等[10]發(fā)現(xiàn)草魚(yú)腸道抗菌物質(zhì)的最佳提取條件為乙酸體積分?jǐn)?shù)10%，料液比1∶3.5（g/mL），超聲時(shí)間10 min，4 ℃下提取24 h，在此條件下的提取物對(duì)金黃色葡萄糖球菌和大腸桿菌的抑制作用較好。柞蠶在受到創(chuàng)傷、物理作用、化學(xué)物質(zhì)或病原微生物等刺激后，其體內(nèi)會(huì)合成一系列生物活性物質(zhì)，包括防御素、溶菌酶、凝集素和柞蠶抗菌肽等，其中柞蠶抗菌肽有較強(qiáng)的抗菌活性。柞蠶滯育蛹血淋巴產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，能使某種大腸桿菌細(xì)胞膜破裂，最終因內(nèi)容物外流而死亡，而此種大腸桿菌正是導(dǎo)致仔豬腹瀉的致病菌[11]。因此該抗菌活性物質(zhì)未來(lái)有望在畜牧業(yè)飼料添加劑方面有所突破研究，替代或部分替代畜牧業(yè)抗生素，具有廣闊的發(fā)展前景。

2 活性物質(zhì)分離與提取方法

2.1 有機(jī)溶劑提取法

有機(jī)溶劑提取法有乙酸提取法[12]、丙酮和甲醛混合液提取法[13]、乙酸乙酯提取法等。劉倫倫等[10]用不同體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間的乙酸溶液對(duì)草魚(yú)魚(yú)腸菌活性物質(zhì)進(jìn)行提取，綜合研究后發(fā)現(xiàn)8%～12%的乙酸提取液的抑菌作用最好。耿俊麗[7]發(fā)現(xiàn)采用不同溶劑（無(wú)水乙醇、苯、丙酮、乙酸乙酯和石油醚）對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的勻漿物進(jìn)行浸泡提取，通過(guò)5種指示菌的抗菌效果檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物的抗菌效果最佳。

2.2 無(wú)機(jī)溶劑提取法

張希春等[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫酸銨沉淀、 超濾和陽(yáng)離子交換分離得到的蚯蚓抗菌肽 EABP1對(duì)鶉雞腸球菌、綠膿桿菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、土生克雷伯桿菌和糞腸球菌有一定的抑制作用，這為新一代抗感染藥物提供了新思路。張雅靜[15]發(fā)現(xiàn)苦瓜活性物質(zhì)的水提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，因此通常采用水提取苦瓜活性物質(zhì)，而非使用有機(jī)溶劑，如70%的乙醇溶液等。不同種類的活性物質(zhì)在不同的溶劑中各表現(xiàn)出不同的抑菌效果，研究者應(yīng)根據(jù)生物體內(nèi)活性物質(zhì)的狀態(tài)、溶解性等各類因素選擇相應(yīng)的提取工藝。

2.3 超聲波提取工藝

超聲波提取分離是一種依據(jù)物質(zhì)中有效成分和有效成分群體的極性、溶解性和存在狀態(tài)等特性設(shè)計(jì)的一種工藝。通過(guò)超聲波振動(dòng)的方式，能使溶劑進(jìn)入固體中，從而使物質(zhì)中的有機(jī)成分溶解于溶劑中，最終得到多成分混合提取液。通過(guò)超聲波技術(shù)不僅可以強(qiáng)化物質(zhì)的提取分離，大幅度縮減提取時(shí)間，提高物質(zhì)提取分離率，達(dá)到節(jié)約成本的目的，還可以增加產(chǎn)品的最終產(chǎn)量并提高質(zhì)量。郭孝武等[16]利用超聲波提取黃芩苷，認(rèn)為超聲波提取法比常規(guī)煎煮法和浸泡提取法提取效率更高。與常規(guī)提取方法相比，超聲波提取法所需設(shè)備條件要求較高，但提取效率也大幅度提高。研究者在分離和提取生物體內(nèi)的抗菌活性物質(zhì)時(shí)應(yīng)綜合考慮各類實(shí)驗(yàn)條件，選擇最合適的提取方法。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，對(duì)生物體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)的研究日益增多，研究植物體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)能促進(jìn)對(duì)植物抗病害新型無(wú)公害農(nóng)藥的研制與開(kāi)發(fā)，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)有巨大貢獻(xiàn)；研究海洋微生物分泌的抗菌活性成分不僅能使海洋可持續(xù)資源得到開(kāi)發(fā)，也能開(kāi)拓更廣闊的海洋研究領(lǐng)域，同時(shí)促進(jìn)大量新型藥物的開(kāi)發(fā)?？咕钚晕镔|(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)雖較植物和海洋微生物少，但也說(shuō)明了在該領(lǐng)域有更大的發(fā)展空間。生物于自然界中的生存環(huán)境豐富多彩，其自身對(duì)于有害病菌和病毒的抵抗能力各不相同。正是因?yàn)榫哂猩锒鄻有?，研究生物體內(nèi)的抗菌活性物質(zhì)才有價(jià)值和意義。在未來(lái)研究中，生物體內(nèi)抗菌活性物質(zhì)對(duì)于新型藥物的研制與開(kāi)發(fā)必將起到重要的推動(dòng)作用。