利用高通量測(cè)序快速定位目標(biāo)性狀位點(diǎn)的研究

林 靜，趙青松，張孟臣，楊春燕，趙團(tuán)結(jié)

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，國(guó)家大豆改良中心石家莊分中心，農(nóng)業(yè)部黃淮海大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北省農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心，農(nóng)業(yè)部大豆生物學(xué)與遺傳育種 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(綜合)，國(guó)家作物遺傳與種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

大豆(GlycinemaxL.)是我國(guó)主要的糧、油、飼兼用作物。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平發(fā)展和人民生活水平的日益提高，我國(guó)對(duì)大豆的需求總量與日俱增。據(jù)報(bào)道，我國(guó)近幾年大豆消費(fèi)量維持在1億t以上，而我國(guó)大豆年生產(chǎn)量?jī)H為1 200萬(wàn)t左右(http://www.stats.gov.cn/)，自給率不足20%，大豆嚴(yán)重依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀對(duì)我國(guó)糧食安全造成巨大的隱患[1-3]。目前，我國(guó)大豆單產(chǎn)水平在1.8 t/hm2左右，而大豆前三大生產(chǎn)國(guó)美國(guó)、阿根廷和巴西的單產(chǎn)水平分別為3.51，3.02，2.91 t/hm2[4]，因此，我國(guó)大豆單產(chǎn)有很大的提升空間，通過(guò)提高我國(guó)大豆單產(chǎn)水平，可以一定程度上緩解對(duì)進(jìn)口大豆的依賴性。

常規(guī)的作物育種需要通過(guò)雜交、選育、株行觀察、加代穩(wěn)定、產(chǎn)量鑒定、產(chǎn)量比較、區(qū)試和生產(chǎn)試驗(yàn)等步驟[5]，整個(gè)育種周期需要5～10 a。常規(guī)品種選育一般至少需要5代以上，要求主要農(nóng)藝性狀穩(wěn)定。然而，在實(shí)際選育過(guò)程中，即使到F5以上，選育株行中仍會(huì)出現(xiàn)農(nóng)藝性狀分離，其對(duì)育種家造成很大的困擾。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，分子輔助育種(Marker assistance selection, MAS)被應(yīng)用到現(xiàn)代育種當(dāng)中，利用與性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記可以快速篩選出有利于生產(chǎn)的純合性狀[6]，不僅減輕了田間工作量，并且顯著縮短了育種周期。因此，鑒定與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，即定位調(diào)控目標(biāo)性狀的關(guān)鍵位點(diǎn)是分子輔助育種的基礎(chǔ)。

目前，常用基因定位的遺傳群體有F2、RIL、DHL和自然群體等。其中F2群體為臨時(shí)群體，一般用于定位質(zhì)量性狀位點(diǎn)(Qualitative trait locus)效果較好[7-9], RIL和DHL則為穩(wěn)定遺傳的永久性群體，適用于需要多重復(fù)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative trait locus, QTL)的定位[10-11]。自然群體屬于非人工構(gòu)建的，經(jīng)過(guò)自然馴化而成的群體，其優(yōu)點(diǎn)是含有豐富的遺傳多樣性，而缺點(diǎn)則是不適用于鑒定微效的QTL位點(diǎn)[12-13]。另外，自然群體往往受群體大小的限制，多種情況下仍然難以獲得調(diào)控目標(biāo)性狀關(guān)鍵基因的精確位置。因此圖位克隆(Map-based cloning)往往需要擴(kuò)大遺傳群體。而數(shù)量性狀由于受遺傳背景的影響，需衍生出次級(jí)群體，例如剩余雜合系(Residual hybrid lines, RHL)和近等基因系(Near-isogenic line, NIL)等，進(jìn)而進(jìn)行精細(xì)定位和圖位克隆，目前RHL和NIL已經(jīng)廣泛用于水稻、玉米、小麥和大豆等作物的精細(xì)定位研究[14-17]。

圖位克隆從方法和策略上已日趨成熟，但構(gòu)建基本遺傳群體、鑒定性狀和構(gòu)建次級(jí)群體，過(guò)程繁瑣且耗時(shí)耗力。尤其是次級(jí)群體RHL和NIL的構(gòu)建往往需要連續(xù)回交或自交至4～5代以上，才可以將90%以上的遺傳干擾去除。而育種過(guò)程中，F(xiàn)5以上的單株行如發(fā)生性狀分離，其本身就包含RHL和NIL 2種特性，但由于檢測(cè)技術(shù)手段的限制往往被忽略?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀，本研究利用高世代的中間材料，以調(diào)控大豆花色的基因位點(diǎn)W1為例，在田間F6株行中篩選花色分離的家系，運(yùn)用近等基因系原理和重測(cè)序技術(shù)快速挖掘調(diào)控目標(biāo)性狀的遺傳位點(diǎn)，進(jìn)而闡釋本策略的有效性，結(jié)果將提供一種可以快速挖掘調(diào)控目標(biāo)性狀遺傳位點(diǎn)的定位策略，以加速育種進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及性狀鑒定

試驗(yàn)材料選用大豆MS輪回群體中364個(gè)F6株行，于2017年在河北石家莊堤上實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行種植，行長(zhǎng)6 m，每行播種50～100粒，在開花期對(duì)株行的花色進(jìn)行統(tǒng)計(jì)觀察，對(duì)出現(xiàn)分離的株行進(jìn)行單株收獲形成F6∶7。分別取F6∶7每個(gè)家系的種子20～30粒，于2018年繼續(xù)進(jìn)行株行觀察花色分離情況。

1.2 DNA樣品采集與重測(cè)序方法

2017年對(duì)出現(xiàn)分離的株行單株進(jìn)行掛牌，每單株取1～2片嫩葉凍存?zhèn)溆谩?018年對(duì)F6∶7每家系進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)分離情況。在每個(gè)不發(fā)生分離的株行中隨機(jī)掛牌1株，取1～2片嫩葉，并將株行表型一致的葉片混合凍存?zhèn)溆谩?/p>

重測(cè)序在廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行。具體方法如下：利用商用基因組試劑盒提取植株DNA。運(yùn)用NEB建庫(kù)試劑盒(NEBNext? ΜLtraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序均在Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行。將去除接頭后的測(cè)序數(shù)據(jù)和參考基因組Wm82.a2.v1進(jìn)行比對(duì)，參數(shù)設(shè)置為“mem 4-k 32-M”[18]，SNP變異運(yùn)用GATK′s Unified Genotyper軟件進(jìn)行分析。

1.3 dCAPS標(biāo)記開發(fā)和檢測(cè)方法

在重測(cè)序結(jié)果基礎(chǔ)上，利用鑒定到的SNP變異開發(fā)目標(biāo)區(qū)間的dCAPs標(biāo)記。具體流程方法如下：明確在目標(biāo)區(qū)段的SNP變異位點(diǎn)，在Phytozome v.12(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載SNP變異位點(diǎn)上下游各30 bp的DNA序列，將野生型和突變類型的DNA序列同時(shí)輸入至網(wǎng)站http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并在F5植株的DNA中進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證。將F5植株的DNA提取后利用200 μL 1×TE Buffer進(jìn)行稀釋。PCR反應(yīng)液根據(jù)TaKaRa 的PrimerSTAR Max DNA Polymerase試劑盒說(shuō)明進(jìn)行配制。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；92 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；70 ℃ 10 min。SSR引物的PCR產(chǎn)物銀染后在8%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳拍照記錄，dCAPS引物的PCR產(chǎn)物利用對(duì)應(yīng)的酶進(jìn)行酶切后，在3%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳拍照記錄。

1.4 花色基因連鎖定位

分別與紫花或白花DNA池一致的多態(tài)標(biāo)記分別記為“a”或 “b”，不清楚或偏分離的記為“-”。表型為紫花和白花的分別記為“d”和“b”，利用Join Map 4.1 內(nèi)置算法Regression algorithm 和 Kosambi函數(shù)對(duì)進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建。運(yùn)用MapChart 2.2軟件進(jìn)行圖譜繪制[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色性狀遺傳分析

MS輪回群體的F6于2017年進(jìn)行夏播，行長(zhǎng)6 m，在開花期調(diào)查其花色性狀，發(fā)現(xiàn)1個(gè)花色分離的株行。75個(gè)單株有58個(gè)表現(xiàn)為紫花，17個(gè)白花，符合3紫花∶1白花的表型分離比例(P>0.05) (表1)；對(duì)75個(gè)單株衍生的F6∶7家系。2018年種植75個(gè)單株衍生的F6∶7家系，結(jié)果顯示，17個(gè)白花的后代株行均表現(xiàn)為白花；58個(gè)紫花的后代株行中，20個(gè)株行未出現(xiàn)花色性狀分離，38個(gè)株行出現(xiàn)花色性狀分離，符合1紫花∶2花色分離∶1白花的預(yù)期分離比例(P>0.05)。結(jié)果表明，在本研究群體中大豆花色性狀由單基因位點(diǎn)控制，其中紫花對(duì)白花為顯性性狀，研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致[20]。

表1 大豆花色的遺傳分析Tab.1 The genetic analysis of soybean flower color

2.2 重測(cè)序變異基本分析

2018年在 MS輪回群體F6∶7的20個(gè)和17個(gè)純紫花或白花株行中隨機(jī)取1株采集葉片，將紫花和白花分別混成樣品池，提取其DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)量為10 Gb。對(duì)樣品池間SNP變異進(jìn)行比對(duì)分析，共檢測(cè)到329 992個(gè)SNP變異位點(diǎn)。由基因功能區(qū)分布可知(圖1-A)，其中252 651個(gè)(占比76.56%)SNP變異位點(diǎn)分布于基因間隔區(qū)(Intergenic region)。可變剪切區(qū)(Splicing region)中SNP變異位點(diǎn)分布最少，僅為81個(gè)(占比0.02%)。此外，3個(gè)SNP變異位點(diǎn)分別跨5′UTR和3′UTR區(qū)域，4個(gè)SNP變異位點(diǎn)位于外顯子的可變剪切區(qū)。由SNP變異位點(diǎn)在整個(gè)基因組和染色體的分布可知(圖1-B、C)，SNP變異位點(diǎn)在20條染色體上分布相對(duì)均勻，占比在4.5%左右。其中，20號(hào)染色體富集最多，有32 341個(gè)SNP變異位點(diǎn)(占比9.80%)，11號(hào)染色體最少，僅含有5 186個(gè)(占比1.57%)SNP變異位點(diǎn)，此外，不同染色體區(qū)段存在多個(gè)明顯SNP變異位點(diǎn)富集區(qū)，表明這些區(qū)段可能為大豆花色調(diào)控基因的候選區(qū)段。但此結(jié)果仍無(wú)法判斷調(diào)控大豆花色位點(diǎn)的區(qū)間，因此需要進(jìn)一步篩選。

2.3 花色候選區(qū)段篩選

為進(jìn)一步明確大豆花色調(diào)控基因的候選區(qū)間，針對(duì)原始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行2步篩選：①選出質(zhì)量較高的SNP(Quality>100)變異位點(diǎn)；②去除雜合位點(diǎn)。篩選后統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：共獲得3371個(gè)高質(zhì)量且純合的SNP變異位點(diǎn)。由基因功能區(qū)分布可知(圖2-A)，其中2 424個(gè)(占比71.93%)SNP變異位點(diǎn)分布在基因間隔區(qū)(Intergenic region)，可變剪切區(qū)(Splicing region)分布最少，僅為2個(gè)(占比0.06%)。由SNP變異位點(diǎn)在整個(gè)基因組和染色體分布可知(圖2-B、C)，SNP變異位點(diǎn)在20條染色體上分布比例為0.98%～20.77%。其中，13號(hào)染色體富集最多，有700個(gè)SNP變異位點(diǎn)(占比20.77%)，表明調(diào)控大豆花色的基因最可能位于13號(hào)染色體上(圖2-C)。進(jìn)一步分析其富集的區(qū)段，結(jié)果顯示，在13號(hào)染色體20～30 Mb的物理區(qū)間有顯著的SNP富集區(qū)(圖2-B)，表明該SNP變異位點(diǎn)富集區(qū)為強(qiáng)候選區(qū)間。

圖1 篩選前SNP變異位點(diǎn)分布Fig.1 The original distribution of SNP variation before screening

圖2 篩選后SNP變異位點(diǎn)分布Fig.2 The distribution of SNP variation after screening

2.4 dCAPs 標(biāo)記的開發(fā)和調(diào)控大豆花色基因位點(diǎn)的連鎖分析

為進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果的可信性，在候選區(qū)間物理位置21 931 375和21 948 774處分別開發(fā)了2對(duì)dCAPS標(biāo)記(表2)，同時(shí)為了防止設(shè)計(jì)標(biāo)記出現(xiàn)異位擴(kuò)增現(xiàn)象，同時(shí)篩選出了2對(duì)具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記Satt149和Satt516作為參照。進(jìn)一步利用F6株行的75個(gè)單株和4個(gè)多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析。結(jié)果顯示(圖3)， dCAPS-1、dCAPS-2、W1、Satt149和Satt516之間均呈現(xiàn)連鎖，遺傳距離為Satt149-(8.8 cM)-W1-(0.4 cM)-dCAPS-1-(2.3 cM)-dCAPS-2-(8.7 cM)-Satt516，整個(gè)遺傳圖譜共可覆蓋20.2 cM的遺傳距離，其中2個(gè)dCAPS標(biāo)記位于W1的同一側(cè)，遺傳距離分別為0.4，2.7 cM。結(jié)果表明，新開發(fā)的dCAPS標(biāo)記未出現(xiàn)異位擴(kuò)增，可以代表目標(biāo)位置的多態(tài)性。此外，新開發(fā)的標(biāo)記均與目標(biāo)性狀緊密連鎖，且定位W1所在的位置與以往報(bào)道一致[21]，表明新開發(fā)的dCAPS標(biāo)記可以用于后續(xù)的MAS中。

表2 本研究中使用的dCAPS引物Tab.2 The dCAPS primers used in this study

注：引物中下劃線的堿基表示引入的突變堿基位點(diǎn)。

Note：The underlined font indicates the position of introduced SNP variation.

圖3 花色位點(diǎn)W1的連鎖圖譜Fig.3 The genetic map of W1 for flower color

3 討論

群體分離分析(Bulk segregation analysis, BSA)是一種可用于快速定位質(zhì)量性狀或含有主效位點(diǎn)的數(shù)量性狀的研究方法，在水稻、小麥、玉米和大豆等作物的遺傳定位的研究中被廣泛使用[22-24]，通常使用F2或RIL群體進(jìn)行混池的構(gòu)建。其中F2群體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單快速，但對(duì)于質(zhì)量性狀而言，子代池中顯性性狀池會(huì)混入雜合基因系，對(duì)定位效果存在很大干擾；雖然利用RIL群體材料可以很好解決這個(gè)問(wèn)題，但RIL群體構(gòu)建周期較長(zhǎng)，并且對(duì)數(shù)量性狀定位的效果并不十分理想。對(duì)數(shù)量性狀位點(diǎn)的精細(xì)定位需要構(gòu)建更高級(jí)的遺傳群體，例如剩余雜合系和近等基因系?；ㄉ誀钤谟N過(guò)程中是非常容易區(qū)分的一個(gè)質(zhì)量性狀，盡管沒(méi)有證據(jù)表明對(duì)大豆產(chǎn)量具有顯著影響，但在品種審定的過(guò)程中，花色分離往往會(huì)被淘汰。在田間育種的過(guò)程中，高世代株行發(fā)生花色分離是一種常見的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了育種的效率。本研究從解決田間高世代株行材料發(fā)生花色分離的現(xiàn)象入手，將高世代F6∶7中不分離的株行構(gòu)建成紫花和白花DNA池，采用重測(cè)序的辦法進(jìn)行定位研究。由于使用了高世代材料，材料間遺傳背景相似度高，材料間屬于近等基因系，極大排除了遺傳背景的干擾，易于鑒定。結(jié)果也顯示，篩選出的SNP標(biāo)記形成了明顯的富集區(qū)，在富集區(qū)開發(fā)的dCAPS標(biāo)記可以很好地追蹤花色性狀，表明這2個(gè)標(biāo)記可以應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助育種當(dāng)中。

大豆是古四倍體作物，約在5 900萬(wàn)a和1 300萬(wàn)a之前經(jīng)過(guò)2次染色體加倍事件[25]，隨后經(jīng)歷染色體丟失、重排、分化等事件逐漸形成現(xiàn)代的2倍體大豆。因此，大豆基因間序列具有高度的同源性，因此一個(gè)基因可能存在多個(gè)拷貝的現(xiàn)象。而不同拷貝間的變異又是相對(duì)獨(dú)立的，因此不同拷貝間也存在變異。目前主流的重測(cè)序技術(shù)是二代重測(cè)序，主要以在50～250 bp的DNA片段加接頭的方式進(jìn)行高通量的測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析來(lái)確定遺傳變異[26]。但受限于參考基因組拼接質(zhì)量和基因組中多拷貝變異之間的影響，往往會(huì)鑒定出大量假陽(yáng)性的SNP變異位點(diǎn)，這種假陽(yáng)性率在大豆、小麥等古四倍體或多倍體作物中尤為高。而一般測(cè)序比對(duì)默認(rèn)的篩選參數(shù)較低[27]，因此加大了假陽(yáng)性出現(xiàn)的概率。在研究中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)測(cè)序通用標(biāo)準(zhǔn)在紫花和白花2個(gè)混池中僅鑒定到約33萬(wàn)個(gè)SNP變異位點(diǎn)，說(shuō)明從F6∶7株行的植株間遺傳背景已經(jīng)非常相近。但這33萬(wàn)個(gè)SNP變異位點(diǎn)未呈現(xiàn)明顯的富集區(qū)，不能明確調(diào)控花色位點(diǎn)的準(zhǔn)確遺傳位置，推測(cè)存在較多的假陽(yáng)性位點(diǎn)。因此，通過(guò)提高測(cè)序質(zhì)量(Quality 參數(shù))，進(jìn)一步提高位點(diǎn)真實(shí)性。此外，構(gòu)建紫花和白花使用的單株均為花色純合單株，因此與目標(biāo)位點(diǎn)連鎖的區(qū)域也趨于純合，因此進(jìn)一步將呈現(xiàn)雜合的位點(diǎn)排除。最終得到3 371個(gè)候選位點(diǎn)，并且在13號(hào)染色體處形成了一個(gè)明顯的富集區(qū)，說(shuō)明未篩選前數(shù)據(jù)確實(shí)存在大量假陽(yáng)性的SNP變異。

本研究利用田間高世代育種材料和高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)大豆花色調(diào)控基因位點(diǎn)W1進(jìn)行了快速定位。研究結(jié)果顯示，利用高世代分離材料可用于有效、快速排除遺傳背景的干擾，提高了遺傳定位效率，在W1位點(diǎn)候選區(qū)間內(nèi)開發(fā)的分子標(biāo)記可以有效地跟蹤W1的遺傳走向，研究結(jié)果為今后的MAS育種提供了理論參考基礎(chǔ)。