版納微型豬近交系免疫排斥相關(guān)基因B4GALNT2的克隆、表達(dá)及功能生物信息學(xué)分析

宋 雪，王淑燕，陳園園，王 配，霍海龍，張 霞，霍金龍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201； 3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 教務(wù)處，云南 昆明 650031)

碳水化合物對(duì)糖蛋白和糖脂的修飾涉及多種生物學(xué)過(guò)程，包括蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的維持、細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答等重要過(guò)程。碳水化合物在個(gè)體間及物種間修飾的差異，產(chǎn)生了一種免疫自我識(shí)別的機(jī)制[1]。異種器官移植過(guò)程中所產(chǎn)生的一系列免疫排斥反應(yīng)便與這種免疫自我識(shí)別機(jī)制密切相關(guān)。例如人類和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物不產(chǎn)生α-1,3-galactose(αGal)這種末端半乳糖的寡糖，而其他哺乳動(dòng)物卻可合成末端αGal多糖，當(dāng)豬到靈長(zhǎng)類動(dòng)物異種器官移植時(shí)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物受體會(huì)開(kāi)啟免疫自我識(shí)別而產(chǎn)生高水平的抗Gal抗體，這是主要的異種器官移植的免疫屏障[2-4]。Sda(Sid)抗原是一種與任何其他已知血型系統(tǒng)無(wú)關(guān)的新抗原，Sda抗原的免疫顯性聚糖為N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)，是一種潛在的異種抗原，在抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)中起重要作用[5]。Byrne等[6-7]在豬到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物器官移植的探索時(shí)發(fā)現(xiàn)，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物異種移植后產(chǎn)生的抗體是針對(duì)一系列豬內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)和由豬B4GALNT2基因產(chǎn)生的聚糖[8]，而β1,4GalNAcT-Ⅱ在異種移植中可能參與抗體依賴性排斥反應(yīng)，揭示β1,4GalNAcT-Ⅱ是一種誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物受體產(chǎn)生排斥反應(yīng)的非Gal抗原[5,9]。

B4GALNT2屬于N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(N-acetylgalactosaminyltransferases，GalNAc-Tases)家族，該家族是一類非常重要的催化氧糖基化的初始酶，主要負(fù)責(zé)將供體二磷酸尿苷N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)上的GalNAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體蛋白，與多肽鏈特定序列中的Ser或Thr羥基結(jié)合，從而構(gòu)成O-聚糖[10]。目前已知該家族至少有14個(gè)成員，分別為GalNAc-T1-T14，各酶在多種組織中的分布和表達(dá)不同，功能也不盡相同。在對(duì)Sda抗原合成的研究中發(fā)現(xiàn)，該家族成員B4GALNT2是催化合成Sda抗原的關(guān)鍵酶，可催化N-乙酰半乳糖胺的末端添加到唾液酸修飾的半乳糖胺進(jìn)而形成Sda血型抗原(GalNAcβ4[Neu5Acα2,3]Galβ4GlcNAcβ3Gal)[11]。有研究認(rèn)為，通過(guò)免疫抑制可顯著影響誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的T細(xì)胞水平，從而降低T細(xì)胞依賴性和特異性，這對(duì)研究缺乏多種異種糖基合成的供體豬具有很大的前景[9]。

長(zhǎng)期以來(lái)，ABH血型抗原在個(gè)體間表達(dá)的差異是難以進(jìn)行輸血以及異種器官移植的主要原因。不表達(dá)特定ABH抗原的個(gè)體會(huì)受到腸道菌群的刺激，產(chǎn)生針對(duì)該聚糖的抗體，這種預(yù)先形成的抗體可誘導(dǎo)溶血反應(yīng)，也可促進(jìn)與ABH血型不相容的移植物的超急性排斥反應(yīng)或者加速同種異體移植物的排斥反應(yīng)[1]。Sda血型抗原與ABH血型抗原都屬于一類糖蛋白，兩者作用機(jī)制相似，Sda血型抗原并不只特定存在于紅細(xì)胞表面，還存在于移植肝的血管和肝竇的內(nèi)皮細(xì)胞表面以及膽管上皮細(xì)胞表面。對(duì)豬B4GALNT2基因座的基因工程實(shí)驗(yàn)證實(shí)了非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類抗體對(duì)B4GALNT2抗原具有依賴性，雖然Sda血型對(duì)輸血沒(méi)有顯著的排斥風(fēng)險(xiǎn)，但非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中觀察到的誘導(dǎo)抗體應(yīng)答以及癌癥疫苗接種研究的結(jié)果表明，豬血管內(nèi)皮細(xì)胞中B4GALNT2的表達(dá)可能對(duì)人類具有免疫原性[12]。

近交系動(dòng)物不僅遺傳背景相似，還具有遺傳一致性和反應(yīng)均一性等特點(diǎn)[13]，經(jīng)基因改造后與人類的組織可具有較大的生物相容性[14]。BMI是遺傳背景清楚且基因高度純合的大型哺乳類動(dòng)物近交系，其在異種器官移植方面具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值[15-19]。本試驗(yàn)克隆了免疫排斥相關(guān)基因B4GALNT2并研究了其在BMI中的mRNA和蛋白表達(dá)情況，利用生物信息學(xué)方法分析了其編碼的蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能特征，為進(jìn)一步探索B4GALNT2在豬-人異種器官移植中的作用機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和主要試劑

屠宰3只BMI，耳號(hào)為413、417和0847(昆明原種豬場(chǎng))，對(duì)15個(gè)重要組織進(jìn)行采樣，得到的(心、肝、脾、肺、腎、皮膚、回腸、盲腸、大腦、脊髓、淋巴結(jié)、扁桃體、腎上腺、甲狀腺、頜下腺)樣品速凍于液氮，后置于-80 ℃超低溫冰箱保存。從北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司購(gòu)置M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、ExTaq酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑、pMD18-T載體，以及β-Tubulin(2H4)：鼠一抗(艾比瑪特生物醫(yī)藥公司，上海)，β-1,4-GalNAc-T2(Q-12)鼠一抗(Sauta Cruz公司，美國(guó))，羊抗鼠二抗(KPL公司，美國(guó))等試劑。

1.2 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

分別從BMI 15個(gè)組織中提取總RNA，經(jīng)BioPhotometer核酸蛋白儀測(cè)定并電泳鑒定合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，參考GenBank豬B4GALNT2mRNA序列(AY271355)，利用Premier 6.0和Oligo 7軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異引物，引物的名稱和序列、產(chǎn)物序列長(zhǎng)、作用等信息見(jiàn)表1。

1.3 PCR擴(kuò)增及基因克隆

使用引物 F1/R1(表1)，cDNA為模板，進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增體系25 μL：ddH2O 5.75 μL、2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL、引物 F/R(10 μmol/L)各0.5 μL、模板(50 ng/μL) 1.5 μL、ExTaq酶(5 U/μL) 0.25 μL。PCR運(yùn)行條件設(shè)置：預(yù)變性(94 ℃，5 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(56 ℃，40 s)，延伸(72 ℃，2 min)，35次循環(huán)；后延伸(72 ℃，10 min)。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物合格后，將目的條帶回收純化，連接克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單菌落，菌液PCR及測(cè)序鑒定。

1.4 多組織mRNA熒光表達(dá)譜檢測(cè)

選取GAPDH基因作為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照，使用引物F2/R2和GAPDH-F/GAPDH-R(表1)通過(guò)qPCR分析15個(gè)組織中B4GALNT2基因的mRNA水平。擴(kuò)增體系20 μL：無(wú)RNAase ddH2O 6.4 μL、2×SYBR Green 10 μL、引物 F2/R2(10 μmol/L)各0.8 μL、cDNA模板 2 μL。運(yùn)行程序：預(yù)變性(95 ℃，2 min)；變性(95 ℃，15 s)，退火(60 ℃，15 s)，延伸(72 ℃，20 s)，40次循環(huán)；采集熒光信號(hào)20 min。每個(gè)樣本重復(fù)3次，設(shè)置NTC，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.5 B4GALNT2蛋白Western Blotting分析

制備15種組織的蛋白樣品，以β-tubulin(54 ku)為內(nèi)參蛋白進(jìn)行Western Blotting分析。蛋白樣品濃度測(cè)定后，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、暗室曝光和膠片處理等一系列蛋白免疫印跡試驗(yàn)流程，得到最終試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 生物信息學(xué)分析

關(guān)于B4GALNT2蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量(Mw)和等電點(diǎn)(pI)等理化特征的預(yù)測(cè)，以及CDS預(yù)測(cè)、蛋白序列推導(dǎo)等均通過(guò)在線軟件DNAStar來(lái)完成；B4GALNT2蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜螺旋和信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，分別借助CDART、TMHMM、SignalP 4.1預(yù)測(cè)網(wǎng)站完成；B4GALNT2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)則通過(guò)SOPMA和SWISS-MODEL得到。將NCBI BlastP獲取的5個(gè)不同物種(牛、綿羊、人、大鼠和小鼠)的B4GANLT2蛋白序列，利用DNAStar、ClustalX和MEGA 7.0軟件與BMI B4GALNT2蛋白序列(ANH21179.1)進(jìn)行同源比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 B4GALNT2基因PCR擴(kuò)增

F1/R1擴(kuò)增的B4GALNT2基因的完整編碼區(qū)(CDS)及部分非編碼區(qū)(UTR)序列，片段大小為1 773 bp，與預(yù)期一致，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)PCR產(chǎn)物原液和克隆后提取的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得的BMIB4GALNT2的CDS序列長(zhǎng)1 509 bp，GenBank登錄號(hào)為KU358546。

M．DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000； 1.引物F1/R1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。 M. Marker-DL2000; 1.PCR product amplified by primers F1/R1.

2.2 多組織mRNA熒光表達(dá)譜

經(jīng)過(guò)對(duì)qPCR檢測(cè)結(jié)果的分析，B4GALNT2基因在15種組織中mRNA的表達(dá)情況見(jiàn)圖2。相對(duì)于內(nèi)參GAPDH基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)B4GALNT2mRNA在各組織中的表達(dá)均存在差異，其中在扁桃體、肺臟、淋巴結(jié)和脾臟中表達(dá)較高，且表達(dá)量極顯著高于盲腸、頜下腺等其他組織(P<0.01)。

不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。 Different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

2.3 Western Blotting檢測(cè)結(jié)果

利用Western Blotting檢測(cè)分析得到B4GALNT2蛋白在15種組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，BMI B4GALNT2蛋白在各組織中的差異表達(dá)，相對(duì)于內(nèi)參蛋白β-tubulin，在扁桃體、腎上腺、盲腸、腎臟和甲狀腺中表達(dá)較高，并且扁桃體、腎上腺、盲腸3種組織中的表達(dá)量極顯著高于其他組織，見(jiàn)圖3。

M. EasySee Western Marker(25～90 ku)；1.心臟；2.肝臟；3.脾臟；4.肺臟；5.腎臟；6.皮膚；7.回腸；8.盲腸；9.大腦； 10.脊髓；11.淋巴結(jié)；12.扁桃體；13.腎上腺；14.甲狀腺；15.頜下腺；不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。 M.EasySee Western Marker(25-90 ku)；1.Heart; 2.Liver; 3.Spleen; 4.Lung; 5.Kidney; 6.Skin; 7.Ileum; 8.Caecum; 9.Cerebrum; 10.Spinal cord;11.Lymph node; 12.Tonsil; 13.Adrenal gland; 14.Thyroid gland; 15.Submandibular gland; Different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

2.4 B4GALNT2基因生物信息學(xué)分析

2.4.1B4GALNT2基因序列及其編碼氨基酸 獲得的BMIB4GALNT2基因CDS序列長(zhǎng)1 509 bp，編碼502個(gè)氨基酸(圖4)，無(wú)信號(hào)肽序列，9-31 AA處含有1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量56.73 ku，等電點(diǎn)為6.24。

ATG.起始密碼子；*.終止密碼子；上一行字母為編碼區(qū)序列，對(duì)應(yīng)的下一行為其編碼的氨基酸序列； 橫線是Glyco tranf GTA type保守結(jié)構(gòu)域(272-364 AA)；陰影為跨膜結(jié)構(gòu)。 ATG.Start codon; *.Stop codon; The letters of upper line are CDS, and those of the corresponding line are amino acid sequences; The Glyco tranf GTA type conserved domains are underlined(272-364 AA) ； The transmembrane structure is shaded.

2.4.2 B4GALNT2蛋白質(zhì)疏水性和保守結(jié)構(gòu)域 BMI B4GALNT2蛋白經(jīng)ProtScale分析，其最大疏水值為3.244，最小疏水值為-2.256，分別處于第18位氨基酸和第116位氨基酸處，N端和C端均親水。NCBI服務(wù)器CDART-BLAST預(yù)測(cè)的B4GALNT2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域見(jiàn)圖5，其中272-364 AA屬于Glyco_tranf_GTA_type超家族成員。

圖5 BMI B4GALNT2蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 The conserved domain of BMI B4GALNT2 protein

2.4.3 B4GALNT2蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu) 利用TMHMM程序預(yù)測(cè)的B4GALNT2蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)(圖6)，存在1個(gè)9-31 AA的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。

2.4.4 B4GALNT2蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 利用SOPMA程序預(yù)測(cè)的BMI B4GALNT2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中含α螺旋167 AA(33.27%)，延伸鏈結(jié)構(gòu)96 AA(19.12%)，β轉(zhuǎn)角50 AA(9.96%)，無(wú)規(guī)則卷曲189 AA(37.65%)。通過(guò)SWISS-MODEL在線自動(dòng)同源建模系統(tǒng)，試圖尋找與BMI B4GALNT2蛋白相似度高的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果該系統(tǒng)提供了2個(gè)預(yù)測(cè)模板，模板1為2z87.1.A，一種軟骨素合酶，蛋白序列一致性為19.61%，覆蓋BMI B4GALNT2蛋白的254-459 AA，覆蓋率為41%；模板2為6h1j.1.C，一種可能的ss-1,3-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶，蛋白序列一致性為17.28%，覆蓋BMI B4GALNT2蛋白的256-458 AA，覆蓋率38%。

圖6 利用TMHMM程序預(yù)測(cè)的 BMI B4GALNT2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.6 The transmembrane structure of BMI B4GALNT2 protein predicted by TMHMM

2.4.5 B4GALNT2蛋白質(zhì)序列多物種相似度計(jì)算及系統(tǒng)進(jìn)化分析 BMI B4GALNT2氨基酸序列與下列5種物種：牛Cattle(XP_010814492)、羊Sheep(AGF33390)、人Human(NP_001152859)、大鼠Rat(XP_006220879)和小鼠Mouse(NP_032107)氨基酸序列相似度達(dá)到77.9%，75.9%，75.3%，69.3%，69.1%(圖7-A)。基于上述物種氨基酸序列同源性，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)以揭示各物種間的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明共分為三大類：BMI與牛和羊聚為一類，而后與人聚為一類，大鼠與小鼠聚為一類(圖7-B)。

圖7 BMI B4GALNT2同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 The homologous analysis and the phylogenetic tree of BMI B4GALNT2

3 討論

N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(GalNAc-Tases)家族成員，參與黏蛋白氧糖基化過(guò)程，氧糖基化蛋白主要見(jiàn)于分泌液中的糖蛋白，俗稱粘蛋白，與細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞黏附、免疫、腫瘤轉(zhuǎn)移、精卵結(jié)合及細(xì)胞凋亡等生命過(guò)程密切相關(guān)[10,20]。組織血型抗原Sda也是一種氧糖基化蛋白，在紅細(xì)胞及多種組織中都有表達(dá)，雖然Sda血型對(duì)輸血沒(méi)有顯著排斥風(fēng)險(xiǎn)，但在豬到人的異種器官移植過(guò)程中，豬血管中B4GALNT2的表達(dá)可能使人產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。除免疫排斥外，Sda抗原還參與癌細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)化，小鼠毒性T淋巴細(xì)胞的溶解，以及血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWf)循環(huán)半衰期的調(diào)節(jié)等過(guò)程[21-22]。近年來(lái)關(guān)于豬B4GALNT2基因及其蛋白的研究報(bào)道逐漸增多，在豬至狒狒心臟異種移植IgG受體的篩選中檢測(cè)到了豬B4GALNT2基因[6,23]，在豬大腸黏膜中檢測(cè)到了β1,4GalNAcT-Ⅱ酶活性并在豬原始生殖細(xì)胞中檢測(cè)到了Sda抗原[24-25]。敲除豬細(xì)胞中的B4GALNT2基因可清除Sda抗原上的GalNAc基團(tuán)，進(jìn)而降低人血清抗體與豬細(xì)胞的結(jié)合[5]。B4GALNT2基因在豬內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)并顯示出廣泛分布的表達(dá)模式[1]，有學(xué)者認(rèn)為，使用豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析和PAEC cDNA文庫(kù)篩選方法可能有助于異種移植物排斥的免疫原性非Gal靶抗原的鑒定[6,26]。Byrne等[1]研究顯示，在受到大量免疫抑制的受體中，誘導(dǎo)的非Gal抗體應(yīng)答與結(jié)合了HEK-B4T細(xì)胞的抗體之間存在相關(guān)性，特別是在人類HEK-B4T細(xì)胞中表達(dá)豬B4GALNT2基因，導(dǎo)致與抗Sda抗體的反應(yīng)性增加，甚至?xí)寡a(bǔ)體介導(dǎo)的裂解敏感性增強(qiáng)20倍，進(jìn)一步說(shuō)明B4GALNT2與異種移植免疫排斥相關(guān)。

本研究首次獲得了BMIB4GALNT2基因CDS全長(zhǎng)序列，包含1 509 bp，編碼502個(gè)氨基酸。在用熒光定量技術(shù)確定mRNA多組織表達(dá)譜時(shí)，由于單引物跨內(nèi)含子并不能完全避免擴(kuò)增基因組序列，從而減除基因組DNA對(duì)mRNA表達(dá)的影響，因此本研究設(shè)計(jì)了上下游引物同時(shí)跨越內(nèi)含子的熒光定量引物，熒光定量PCR結(jié)果顯示BMIB4GALNT2mRNA在多種組織中廣泛表達(dá)，其中在扁桃體、肺臟、淋巴結(jié)和脾臟中表達(dá)相對(duì)較高。Western Blotting檢測(cè)顯示BMI B4GALNT2蛋白在扁桃體、盲腸、腎臟和甲狀腺中表達(dá)相對(duì)較高。結(jié)合以上兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可以初步推斷，B4GALNT2基因的表達(dá)主要集中于免疫相關(guān)組織。本研究中Western Blotting在蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果與熒光定量PCR的mRNA表達(dá)結(jié)果存在一定差異，而這種差異的存在很可能是基因在先后經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄和翻譯2個(gè)過(guò)程中的表達(dá)量不同所造成的，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[27]。

本研究預(yù)測(cè)的B4GALNT2在9-31 AA處含有1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，屬于跨膜蛋白，其N端和C端均親水，與人B4GALNT2蛋白研究結(jié)果相類似[28]?？缒さ鞍资谴嬖谟谏锬は到y(tǒng)中的一種特殊蛋白，作為生物膜的主要組分，它們參與細(xì)胞及組織內(nèi)外環(huán)境中頻繁的信息傳遞和物質(zhì)交換，在生物體的生命活動(dòng)中具有重要作用[29]。B4GALNT2是GalNAc-T家族成員之一，GalNAc-T家族屬于Ⅱ型單通道跨膜蛋白，其氨基酸的N端處于胞質(zhì)中，包含一個(gè)15-25 AA氨基酸的穿膜錨定結(jié)構(gòu)域，通過(guò)一個(gè)莖部與C端深入高爾基體管腔內(nèi)大于450 AA的催化區(qū)相連接，這種結(jié)構(gòu)可能在高爾基復(fù)合體內(nèi)參與和其他蛋白質(zhì)協(xié)調(diào)的相互作用，或者輔助催化結(jié)構(gòu)域在高爾基體中的伸展，因此錨定結(jié)構(gòu)域與糖基轉(zhuǎn)移酶的定位有關(guān)[30]。

蛋白質(zhì)序列及其結(jié)構(gòu)的相似性使得蛋白質(zhì)分子在進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性[31-32]，因此，分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域?qū)τ谘芯克鼈兊墓δ苁鞘直匾?，本研究?duì)BMI B4GALNT2蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明272-364 AA屬于Glyco_tranf_GTA_type超家族成員。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)不僅僅是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的組成單元，也是構(gòu)成蛋白質(zhì)復(fù)雜構(gòu)象的重要基礎(chǔ)[33]。BMI B4GALNT2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，以無(wú)規(guī)則卷曲(37.65%)和α-螺旋(33.27%)結(jié)構(gòu)為主。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)即蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，決定其生物學(xué)功能，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)認(rèn)識(shí)其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要意義。目前，同源模建(Comparative Modeling)即比較模建是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法中最為成功的一種方法[34]，通過(guò)SWISS-MODEL在線自動(dòng)同源建模系統(tǒng)的分析預(yù)測(cè)，結(jié)果沒(méi)有搜索到與豬B4GALNT2相似性較高的三級(jí)結(jié)構(gòu)序列模板，系統(tǒng)只提供了2個(gè)蛋白序列一致性較低的預(yù)測(cè)模板，分別為2z87.1.A(相似性19.61%)和6h1j.1.C(相似性17.28%)。

BMI B4GALNT2與牛、羊、人、大鼠和小鼠氨基酸序列相似度較高，而序列相似度越高，同源性越高，親緣關(guān)系就越近，6個(gè)物種的B4GALNT2氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明BMI與牛和羊聚為一類，都屬于偶蹄目，而后與人聚為一類，大鼠與小鼠聚為一類，均為嚙齒目。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果與不同物種間基因序列相似度結(jié)果相符合。