分光光度法測(cè)定葉綠素含量的提取液的適宜濃度

胡秉芬，黃華梨，季元祖，趙曉芳，戚建莉，張露荷，張廣忠

(甘肅省林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所，甘肅 蘭州 730020)

葉綠素含量是反映植物光合組織生理狀況的一個(gè)基本指標(biāo)，植物生理研究中經(jīng)常涉及葉綠素含量的測(cè)定。葉綠素含量的測(cè)定方法主要有分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法等[1]。其中，應(yīng)用最廣泛的是分光光度法，即根據(jù)葉綠素對(duì)可見(jiàn)光的吸收光譜，在某一特定波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光度(A)，然后利用公式計(jì)算葉綠素含量。吸光度是光線通過(guò)溶液后用來(lái)衡量光被溶質(zhì)吸收程度的一個(gè)物理量。光的吸收程度與葉綠素提取液的濃度、液層的厚度以及入射及反射光的強(qiáng)度等因素有關(guān)。實(shí)際上，在進(jìn)行比色分析時(shí)，因采用同樣質(zhì)料、相同規(guī)格的比色皿，反射光的強(qiáng)度相同，它們的影響可以相抵消。Beer定律是比色分析的理論基礎(chǔ)，它適用于低濃度溶液，一般采用每升含溶質(zhì)1 g的濃度(1 mg·mL-1)，液層厚度為1 cm。許大全[2]認(rèn)為用于比色測(cè)定的葉綠素提取液的濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致葉綠素a/b比值的明顯降低。舒展等[3]也認(rèn)為葉綠素a/b比值的高低與用于比色的葉綠素提取液濃度有密切關(guān)系；當(dāng)葉綠素提取液濃度在3.50～6.00 cm2·mL-1時(shí)，a/b比值變化不大，而在這個(gè)范圍之外時(shí)，a/b比值隨提取液濃度的降低而升高。筆者在以往試驗(yàn)中，使用分光光度法測(cè)定小麥(Triticumaestivum)葉片葉綠素含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，取同一葉片對(duì)等部位厚度相同的兩份等面積材料，用不同容積乙醇-丙酮混合液(1∶1)浸提葉片葉綠素，結(jié)果是材料相同、濃度不同的葉綠素提取液所測(cè)得的葉綠素含量不同。此外，在比色讀數(shù)時(shí)吸光度經(jīng)常波動(dòng)不穩(wěn)定，特別在665和663 nm長(zhǎng)波點(diǎn)，表現(xiàn)尤為明顯。因此，運(yùn)用適宜濃度的葉綠素提取液對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定其葉綠素含量至關(guān)重要。鑒于此，本研究采用棗樹(shù)(Ziziphusjujuba)“金昌一號(hào)”葉片為材料，分別以乙醇和乙醇-丙酮混合液(1∶1)浸提棗樹(shù)葉片葉綠素，將浸提液稀釋成一定濃度梯度后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)比色讀取吸光度，然后測(cè)定計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b的比值和葉綠素總量(a+b)，并觀察吸光度的穩(wěn)定情況，進(jìn)而探討葉綠素含量穩(wěn)定時(shí)浸提液的濃度問(wèn)題，以期為分光光度法有效測(cè)定葉綠素含量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為4年生棗樹(shù)“金昌一號(hào)”的葉片，于2016年5月12日采自甘肅省林業(yè)科學(xué)研究院靖遠(yuǎn)縣雙龍鄉(xiāng)新建棗樹(shù)示范園。其他儀器試劑：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1600PC型，上海美譜達(dá)儀器有限公司)、80%丙酮、95%乙醇及乙醇-丙酮混合液(按體積比配制的提取液1∶1)等。

1.2 試驗(yàn)方法

在棗樹(shù)樹(shù)冠中部外圍東、西、南、北4個(gè)方位選取兩年生二次枝，于其上4～6節(jié)著生的棗吊中部各采2片葉，擦凈葉片表面污物，在8片重疊的棗樹(shù)葉片主脈兩側(cè)對(duì)應(yīng)部位各取2 cm×1 cm葉樣，稱重后剪成細(xì)絲，無(wú)損地放入具塞三角瓶中，加入乙醇-丙酮混合液(1∶1)定容至20 mL，封口后室溫、暗處浸泡提取。采用同樣的方法，用95%酒精作提取液再浸提一份。待材料完全變白后，取清液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)比色測(cè)定吸光度。

由于丙酮溶液中的葉綠素a、b在長(zhǎng)波光方面的最大吸收峰位于663和645 nm處，而乙醇溶液中的葉綠素a、b在長(zhǎng)波光方面的最大吸收峰位于665和649 nm處[4]。因此試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)方案：方案1，乙醇葉綠素提取液在665和649 nm波長(zhǎng)點(diǎn)比色，測(cè)得的葉綠素a、b及吸光度分別用a1、b1、1A665、1A649表示；方案2，乙醇-丙酮葉綠素提取液在665和649 nm波長(zhǎng)點(diǎn)比色，測(cè)得的葉綠素a、b及吸光度分別用a2、b2、2A665、2A649表示；方案3，乙醇-丙酮葉綠素提取液在663和645 nm波長(zhǎng)點(diǎn)比色，測(cè)得的葉綠素a、b及吸光度分別用a3、b3、A663、A645表示。方案1和方案2的提取液不同，比色波長(zhǎng)點(diǎn)及葉綠素含量的計(jì)算公式均相同；方案1和方案3提取液、比色波長(zhǎng)點(diǎn)及葉綠素含量的計(jì)算公式均不同，方案1是乙醇葉綠素提取液在A665和A649波長(zhǎng)下讀取吸光度后用Arnon的修正公式[5]計(jì)算葉綠素含量；方案3則是乙醇-丙酮葉綠素提取液在A663和A645波長(zhǎng)下讀取吸光度，由于其葉綠素提取液的吸收光譜和丙酮葉綠素提取液的吸收光譜相同[4]，故用Arnon公式計(jì)算葉綠素含量。

每一次比色后將比色皿中葉綠素提取液倒回原三角瓶，加5 mL相應(yīng)提取液稀釋后取清液再次測(cè)定吸光度。以此類推，共稀釋成19個(gè)濃度梯度(1.600、1.280、1.067、0.914、0.800、0.711、0.681、0.653、0.627、0.604、0.582、0.533、0.492、0.457、0.427、0.400、0.376、0.337、0.305 cm2·mL-1)，全部比色并記錄數(shù)據(jù)。棗樹(shù)“金昌一號(hào)”葉片約重18.33 mg·cm-2，所以cm2·mL-1與 mg·mL-1之間可以互算。

1.3 數(shù)據(jù)分析

分別以提取液作空白，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在663和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并依據(jù)Arnon公式[6]計(jì)算葉綠素含量(mg·dm-2)。

葉綠素a含量=(12.7A663-2.69A645)×[V/(1 000×W)]；

葉綠素b含量=(22.9A645-4.68A663)×[V/(1 000×W)]；

葉綠素總量=葉綠素a含量+葉綠素b含量=(20.21 A645+8.02 A663)×[V/(1 000×W)]。

在665和649 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并用以下修正的Arnon公式[5]計(jì)算葉綠素含量(mg·dm-2)。

葉綠素a含量=(13.7A665-5.76A649)×[V/(1 000×W)]；

葉綠素b含量=(25.8A649-7.6A665)×[V/(1 000×W)]；

葉綠素總量=葉綠素a含量+葉綠素b含量=(6.10A665+20.04A649)×[V/(1 000×W)]。

式中:A663、A645、A665、A649分別為663、645、665和649 nm波長(zhǎng)下的吸光度，V為提取液的體積(mL)，W為葉片鮮重(g)或葉面積(cm2)。

采用Excel 2003處理數(shù)據(jù)，制作圖表，曲線擬合分析；采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan法多重比較，比較顯著性水平設(shè)定為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素a含量隨葉綠素提取液濃度的變化

兩種不同提取液浸提的葉綠素溶液中，葉綠素a含量均隨葉綠素提取液濃度的降低呈現(xiàn)先升高后逐漸平穩(wěn)的變化趨勢(shì)(圖1，表1、2、3)。當(dāng)溶液濃度高于0.80 cm2·mL-1，a1，a2和a3均隨溶液濃度的降低而升高；而當(dāng)濃度低于0.80 cm2·mL-1，三者均表現(xiàn)出基本一致的平穩(wěn)曲線，a3>a2>a1。

方差分析和多重比較(表4)表明，a3顯著高于a1和a2(P<0.05)，說(shuō)明乙醇-丙酮葉綠素提取液在663和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的葉綠素a含量與在665和649 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的葉綠素a含量差異顯著，其與乙醇葉綠素提取液在665和649 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的葉綠素a含量差異也顯著；a2與 a1差異不顯著(P>0.05)，這說(shuō)明兩種葉綠素提取液在相同波長(zhǎng)點(diǎn)665和649 nm處測(cè)得的葉綠素a含量基本相同。表明,測(cè)定葉綠素a含量的葉綠素提取液適宜濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

對(duì)a1、a2和a3這3條曲線進(jìn)行二次曲線擬合(表5)，相關(guān)系數(shù)分別為0.996 1、0.997 2和0.996 2，這表明所做的曲線擬合是合理的。由于葉綠素提取液濃度低于0.80 cm2·mL-1，3條葉綠素a變化曲線均處于平穩(wěn)狀態(tài)，取該濃度葉綠素提取液所測(cè)得的葉綠素a含量為y值，根據(jù)相應(yīng)的擬合公式，對(duì)應(yīng)的x值分別為0.75、0.78和0.77，這進(jìn)一步說(shuō)明測(cè)定葉綠素a含量的葉綠素提取液濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

圖1 葉綠素a含量隨葉綠素提取液濃度的變化Fig. 1 The changes of chlorophyll a content with the concentration of chlorophyll extracts

a1、a2和a3分別表示3個(gè)方案中不同濃度梯度葉綠素提取液中的葉綠素a含量。

a1，a2and a3respectively represent the chlorophyll a contents in chlorophyll extracts from three different programmes.

2.2 葉綠素b含量隨葉綠素提取液濃度的變化

兩種不同提取液浸提的葉綠素溶液中，葉綠素b含量均隨葉綠素提取液濃度的降低呈現(xiàn)先降低后逐漸平穩(wěn)的變化趨勢(shì)(圖2，表1、2、3)。當(dāng)溶液濃度高于0.80 cm2·mL-1，b1，b2和b3均隨溶液濃度降低而快速降低；而當(dāng)濃度低于0.80 cm2·mL-1，三者均表現(xiàn)出基本一致的平穩(wěn)曲線，b2>b3>b1。

方差分析和多重比較(表4)表明，b1、b2和b3彼此間差異顯著 (P<0.05)，說(shuō)明乙醇-丙酮葉綠素提取液在665和649 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的葉綠素b含量與在663和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的葉綠素b含量不同，兩種葉綠素提取液在相同波長(zhǎng)點(diǎn)665和649 nm處測(cè)得的葉綠素b含量也完全不同。表明，測(cè)定葉綠素b含量的葉綠素提取液適宜濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

對(duì)b1、b2和b3這3條曲線進(jìn)行二次曲線擬合(表5)，相關(guān)系數(shù)分別為0.996、0.990和0.992，這表明所做的曲線擬合是合理的。由于葉綠素提取液濃度低于0.80 cm2·mL-1，3條葉綠素b變化曲線均處于平穩(wěn)狀態(tài)，取該濃度葉綠素提取液所測(cè)得的葉綠素b含量為y值，根據(jù)相應(yīng)的擬合公式，對(duì)應(yīng)的x值分別為0.80、0.80和0.81，進(jìn)一步說(shuō)明測(cè)定葉綠素b含量的葉綠素提取液濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

表1 乙醇提取液提取棗樹(shù)葉綠素含量(665/649 nm)Table 1 The extraction of chlorophyll content from jujube tree by ethanol extraction(665/649 nm)

表2 乙醇-丙酮提取液提取棗樹(shù)葉綠素含量(665/649 nm)Table 2 The extraction of chlorophyll content from jujube tree by ethanol and acetone extraction(665/649 nm)

表3 乙醇-丙酮提取液提取棗樹(shù)葉綠素含量(663/645 nm)Table 3 The extraction of chlorophyll content from jujube tree by ethanol and acetone extraction(663/645 nm)

表4 棗樹(shù)葉綠素含量方差分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis of chlorophyll content in jujube tree leaves

同列不同小寫字母者表示不同方案葉綠素含量間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant differences between different programmes at the 0.05 level.

2.3 葉綠素a/b比值隨葉綠素提取液濃度的變化

兩種不同提取液浸提的葉綠素溶液中，葉綠素a/b比值均隨葉綠素提取液濃度的降低呈現(xiàn)先升高后逐漸平穩(wěn)的變化趨勢(shì)(圖3，表1、2、3)。當(dāng)溶液濃度高于0.80 cm2·mL-1，a1/b1，a2/b2及a3/b3比值均隨溶液濃度降低而升高；而當(dāng)濃度低于0.80 cm2·mL-1，三者均表現(xiàn)出基本一致的平穩(wěn)曲線。

在方案1和方案3中雖然葉綠素提取液、比色波長(zhǎng)點(diǎn)及葉綠素含量的計(jì)算公式均不同，但a1/b1和a3/b3比值的曲線幾乎完全吻合。SPSS方差分析和Duncan多重比較(表4)表明，a1/b1和a3/b3間差異不顯著(P>0.05)。這說(shuō)明乙醇葉綠素提取液在長(zhǎng)波光最大吸收峰665和649 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的a/b比值與乙醇-丙酮葉綠素提取液在長(zhǎng)波光最大吸收峰A663和A645波長(zhǎng)下測(cè)得的a/b比值完全相同。此外，a3/b3比值顯著高于a2/b2比值(P<0.05)，說(shuō)明乙醇-丙酮葉綠素提取液在663和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的葉綠素a/b比值高于在665和649 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的。這表明測(cè)定葉綠素a/b比值的葉綠素提取液適宜濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

對(duì)a1/b1，a2/b2及a3/b3比值的3條曲線進(jìn)行二次曲線擬合(表5)，相關(guān)系數(shù)分別為0.986、0.983和0.983，這表明所做的曲線擬合是合理的。由于葉綠素提取液濃度低于0.80 cm2·mL-1，3條葉綠素a/b比值變化曲線均處于平穩(wěn)狀態(tài)，取該濃度葉綠素提取液所測(cè)得的葉綠素a/b比值為y值，根據(jù)相應(yīng)的擬合公式，對(duì)應(yīng)的x值分別為0.77、0.78和0.78，進(jìn)一步說(shuō)明測(cè)定葉綠素a/b比值的葉綠素提取液濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

表5 Excel曲線擬合分析結(jié)果Table 5 Excel curve fitting analysis results

y是葉綠素變化曲線穩(wěn)定時(shí)的葉綠素濃度，*表示a/b比值；x是根據(jù)相應(yīng)二次多項(xiàng)曲線擬合方程，與y對(duì)應(yīng)的x值。

yis the chlorophyll concentration when the chlorophyll change curve is stable，* is a/b ratio；xis thexvalue corresponding toyaccording to the two multinomial curve fitting equation.

圖2 葉綠素b含量隨葉綠素提取液濃度的變化Fig. 2 The changes of chlorophyll b content with the concentration of chlorophyll extracts

b1、b2和b3分別表示3個(gè)方案中不同濃度梯度葉綠素提取液中的葉綠素b含量。

b1，b2and b3respectively represent the chlorophyll b contents in chlorophyll extracts from three different programmes.

在低于0.80 cm2·mL-1的濃度范圍內(nèi)，乙醇葉綠素提取液的a1/b1比值均在3.379左右(表1)；乙醇-丙酮葉綠素提取液的a2/b2和a3/b3比值均分別在2.517和3.396左右(表2、3)。這個(gè)結(jié)果與C3植物a/b理論值約為3[7]的結(jié)論基本一致。而當(dāng)溶液濃度高于0.80 cm2·mL-1時(shí)，a1/b1、a2/b2及a3/b3比值均隨著濃度的降低迅速降低，這也說(shuō)明測(cè)定葉綠素a/b比值的葉綠素提取液適宜濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

圖3 葉綠素a/b比值隨葉綠素提取液濃度的變化Fig. 3 The changes of the ratio of chlorophyll a and b with the concentration of chlorophyll extracts

a1/b1、a2/b2和a3/b3分別表示3個(gè)方案中不同濃度梯度葉綠素提取液中的葉綠素a/b。

a1/b1，a2/b2和a3/b3respectively represent the chlorophyll a/b in chlorophyll extracts from three different programmes.

2.4 葉綠素總含量(a+b)隨葉綠素提取液濃度的變化

兩種不同提取液浸提的葉綠素溶液中，葉綠素總量均隨葉綠素提取液濃度的降低呈現(xiàn)先升高后逐漸平穩(wěn)的變化趨勢(shì)(圖4，表1、2、3)。當(dāng)溶液濃度高于0.80 cm2·mL-1，a1+b1，a2+b2和a3+b3均隨溶液濃度降低而升高；而當(dāng)濃度低于0.80 cm2·mL-1，三者均表現(xiàn)出基本一致的平穩(wěn)曲線。此外，a2+b2和a3+b3的曲線基本相吻合，這說(shuō)明乙醇-丙酮葉綠素提取液在665和649 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的葉綠素總量與663和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的總量完全相同。乙醇提取液浸提的葉綠素總量相對(duì)前兩者較低，差異明顯，這可能與不同葉片厚度的差異，甚至同一葉片不同部位厚度的差異以及人為操作產(chǎn)生的誤差有關(guān)，這些因素均會(huì)導(dǎo)致單位葉面積葉綠素含量的不同。這表明，測(cè)定葉綠素總量的葉綠素提取液適宜濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

圖4 葉綠素總量隨葉綠素提取液濃度的變化Fig. 4 The changes of total chlorophyll content with the concentration of chlorophyll extracts

a1+b1、a2+b2和a3+b3分別表示3個(gè)方案中不同濃度梯度葉綠素提取液中的葉綠素總量。

a1+b1，a2+b2and a3+ b3respectively represent the chlorophyll (a+b) contents in chlorophyll extracts from three different programmes.

對(duì)a1+b1，a2+b2和a3+b3這3條曲線進(jìn)行二次曲線擬合(表5)，相關(guān)系數(shù)分別為0.986、0.995和0.995，這表明所做的曲線擬合是合理的。由于葉綠素提取液濃度低于0.80 cm2·mL-1，3條葉綠素總量變化曲線均處于平穩(wěn)狀態(tài)，取該濃度葉綠素提取液所測(cè)得的葉綠素總量為y值，根據(jù)相應(yīng)的擬合公式，對(duì)應(yīng)的x值分別為0.70、0.77和0.76，進(jìn)一步說(shuō)明測(cè)定葉綠素總量的葉綠素提取液濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

2.5 吸光度及其比值隨葉綠素提取液濃度的變化

兩種不同提取液浸提的葉綠素溶液中，吸光度均隨葉綠素提取液濃度的降低而降低(圖5，表1、2、3)。其中，A665與A663的變化趨勢(shì)一致，A649與A645的變化趨勢(shì)一致。此外，A665/A649和A663/A645比值均隨葉綠素提取液濃度的降低呈現(xiàn)先升高后逐漸平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。當(dāng)溶液濃度高于0.80 cm2·mL-1時(shí)，A665/A649和A663/A645比值均隨溶液濃度降低而升高；而當(dāng)濃度低于0.80 cm2·mL-1后，其與葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b及葉綠素a總量呈現(xiàn)出完全一致的平穩(wěn)曲線。結(jié)果表明，A665/A649和A663/A645比值達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的提取液濃度范圍與測(cè)定葉綠素含量的適宜濃度范圍完全一致；也就是說(shuō)，吸光度比值是否平穩(wěn)與能否準(zhǔn)確測(cè)定葉綠素含量密切相關(guān)，通過(guò)吸光度比值的穩(wěn)定狀況可直接了解測(cè)得的葉綠素含量的可靠性。

2.6 吸光度的穩(wěn)定性

通過(guò)多次比色觀察表明，本研究中不同濃度梯度的葉綠素提取液在649與645 nm波長(zhǎng)下的吸光度讀數(shù)穩(wěn)定；在665、663 nm波長(zhǎng)下比色讀數(shù)時(shí)，高濃度溶液的吸光度讀數(shù)波動(dòng)不穩(wěn)定，但隨著溶液濃度的降低吸光度讀數(shù)逐步趨于穩(wěn)定。此外，當(dāng)乙醇葉綠素提取液稀釋到0.71 cm2·mL-1時(shí)，在665 nm波長(zhǎng)下的吸光度讀數(shù)較穩(wěn)定；當(dāng)進(jìn)一步稀釋到0.681 cm2·mL-1(相當(dāng)于48 mg·mL-1)以后，兩種葉綠素提取液在665和649、663和645 nm波長(zhǎng)下的吸光度讀數(shù)均不再變化。

3 討論與結(jié)論

本研究中的葉綠素含量測(cè)定結(jié)果表明，不論是乙醇葉綠素提取液還是乙醇-丙酮葉綠素提取液，當(dāng)濃度低于0.80 cm2·mL-1(或14.67 mg·mL-1)時(shí)，葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素a/b比值及葉綠素總量均處于穩(wěn)定水平，說(shuō)明測(cè)定葉綠素含量的提取液適宜濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1(或14.67 mg·mL-1)。對(duì)整個(gè)濃度范圍(0.304～1.6 cm2·mL-1)內(nèi)測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行二次曲線擬合，葉綠素a、b、a/b比值及葉綠素a+b總量的擬合方程相關(guān)系數(shù)均高于0.98，這充分說(shuō)明所做的曲線擬合是合理的，依據(jù)這些擬合方程求得的值可以采用。以濃度為0.80 cm2·mL-1的葉綠素提取液所測(cè)得的葉綠素a、b、a/b比值及葉綠素a+b總量，根據(jù)擬合公式，求得的x值均等于或接近0.8(表5)，這進(jìn)一步說(shuō)明測(cè)定葉綠素含量的葉綠素提取液濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。

比色分析的基本原理是Beer定律，它適用于低濃度溶液。棗樹(shù)“金昌一號(hào)”葉片浸提液0.80 cm2·mL-1相當(dāng)于14.67 mg·mL-1，這個(gè)濃度是比較低的，符合Beer定律的要求。本研究中葉綠素a/b比值的測(cè)定結(jié)果與許大全[2]的研究結(jié)果一致，他認(rèn)為用于比色測(cè)定的葉綠素提取液的濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致葉綠素a/b比值的明顯降低。舒展等[3]也認(rèn)為葉綠素a/b比值的高低與用于比色的葉綠素提取液濃度有密切關(guān)系；當(dāng)葉綠素提取液濃度在3.50～6.00 cm2·mL-1之間時(shí)，a/b比值變化不大，而在這個(gè)范圍之外，a/b比值隨提取液濃度的降低而升高，這與本研究結(jié)果不完全一致。許大全[2]認(rèn)為除了氮肥缺乏、缺少葉綠素的突變體、患失綠癥或葉片衰老等特殊情況外，絕大多數(shù)葉片的葉綠素含量均在400～600 mg·cm-2范圍內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)，在低于0.80 cm2·mL-1的濃度范圍內(nèi)，乙醇葉綠素提取液的葉綠素a1+b1含量均在356.7 mg·cm-2左右，乙醇-丙酮葉綠素提取液的a2+b2和a3+b3含量均分別在413和420 mg·cm-2左右。而當(dāng)溶液濃度高于0.80 cm2·mL-1，a1+b1、a2+b2和a3+b3含量均迅速降低，這也說(shuō)明測(cè)定葉綠素總量的提取液適宜濃度應(yīng)低于0.80 cm2·mL-1。那么，葉綠素提取液的最低濃度是多少時(shí)才能測(cè)出準(zhǔn)確的葉綠素含量？陳守建[8]采用分光光度法對(duì)低濃度區(qū)域的測(cè)定值進(jìn)行了分析，認(rèn)為，當(dāng)被測(cè)物含量很低時(shí)，分析數(shù)據(jù)是否具有意義是數(shù)據(jù)質(zhì)量的一個(gè)重要方面，任何一個(gè)分析過(guò)程，不論使用何種精確的方法或高級(jí)儀器，都不能產(chǎn)生無(wú)限低的有意義的數(shù)據(jù)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的概念，他把低濃度范圍的檢出劃分為定性和定量?jī)煞N，以銀的分光光度法為例，定性檢出限約為0.08 μg·mL-1，定量檢測(cè)限為0.12 μg·mL-1。

圖5 吸光度(A)及其比值隨葉綠素提取液濃度的變化Fig. 5 The changes of absorbance (A) and their ratio with the concentration of chlorophyll extracts

1A665、1A649和1A665/1A649分別表示方案1中不同濃度梯度葉綠素提取液在665和649 nm波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度及其比值；2A665、2A649和2A665/2A649分別表示方案2中不同濃度梯度葉綠素提取液在665和649 nm波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度及其比值；A663、A645和A663/A645分別表示方案3中不同濃度梯度葉綠素提取液在663和645 nm波長(zhǎng)點(diǎn)的吸光度及其比值。

1A665，1A649and 1A665/1A649respectively represent the absorbances and their ratios of different concentration chlorophyll extracts at 665 nm and 649 nm in programme 1；2A665，2A649and 2A665/2A649respectively represent the absorbances and their ratios of different concentration chlorophyll extracts at 665 and 649 nm in programme 2；A663，A645and A663/A645respectively represent the absorbances and their ratios of different concentration chlorophyll extracts at 663 and 645 nm in programme 3.

大量資料顯示，浸提法測(cè)定植物葉綠素含量多采用乙醇與丙酮混合液(不同體積比混合)作提取液[9-12]，也有單純采用乙醇溶液[13-15]或丙酮溶液[16-17]作浸提液的。楊振德[18]認(rèn)為，采用分光光度法測(cè)定的植物材料葉綠素含量根據(jù)提取液的不同而呈現(xiàn)不同的結(jié)果。劉彩云[19]則認(rèn)為葉綠素提取時(shí)，待測(cè)植物材料本身對(duì)提取試劑并無(wú)特異性，好的提取方法、試劑對(duì)不同植物材料均適用。本研究結(jié)果表明，以棗樹(shù)“金昌一號(hào)”葉片為試材，乙醇和乙醇-丙酮兩種浸提液在相同的最大吸收峰665和649 nm處測(cè)得的葉綠素a基本相同，兩種浸提液分別在不同的最大吸收峰665和649 nm處和663和645 nm處測(cè)得的葉綠素a/b比值(a1/b1與a3/b3間差異不顯著，P>0.05) 也相同，乙醇-丙酮浸提液在不同的最大吸收峰665和649 nm處和663和645 nm處測(cè)得的葉綠素a+b總量(a2+b2與a3+b3間差異不顯著，P>0.05)幾乎完全相同；在同等條件下，兩種浸提液測(cè)得的葉綠素b(b1、b2和b3彼此間差異顯著，P<0.05)均不相同，乙醇-丙酮浸提液在663和645 nm處測(cè)得的a3分別與在665和649 nm處測(cè)得的a2和乙醇浸提液在665和649 nm處測(cè)得的a1間、乙醇-丙酮浸提液在665和649 nm處測(cè)得a2/b2分別與在663和645 nm處測(cè)得的a3/b3和乙醇浸提液在665和649 nm處測(cè)得的a1/b1間、乙醇浸提液在665和649 nm處測(cè)得的a1+b1分別與乙醇-丙酮浸提液在兩大吸收峰處測(cè)得的a2/b2和a3/b3間均差異顯著(P<0.05)。因此，本研究結(jié)果與楊振德的試材相同,提取液不同,測(cè)定結(jié)果就不同的研究結(jié)果不完全一致。

本研究結(jié)果還表明，用紫外分光光度計(jì)比色時(shí)，葉綠素提取液濃度越低，吸光度讀數(shù)越穩(wěn)定；當(dāng)濃度低于0.681 cm2·mL-1(或12.48 mg·mL-1)時(shí)，在665、649 nm波長(zhǎng)下的吸光度讀數(shù)與663、645 nm波長(zhǎng)下的讀數(shù)均趨于穩(wěn)定。當(dāng)葉綠素提取液濃度低于0.80 cm2·mL-1時(shí)，A665/A649和A663/A645比值與葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b比值及葉綠素a+b總量均表現(xiàn)出完全相似的平穩(wěn)特征，說(shuō)明A665/A649和A663/A645比值的穩(wěn)定與準(zhǔn)確測(cè)定葉綠素含量密切相關(guān)。

長(zhǎng)期以來(lái)，人們測(cè)定植物葉片葉綠素含量時(shí)，通常以質(zhì)量單位(g)或面積單位(cm2)所含葉綠素多少(mg)來(lái)表示葉片葉綠素含量，由于不同物種葉片葉綠素含量不同，或相同物種不同葉片厚度不同，甚至同一葉片不同部位厚度不同，都會(huì)產(chǎn)生試驗(yàn)誤差。以質(zhì)量單位測(cè)定葉綠素含量，試驗(yàn)操作繁瑣人為誤差較大，以面積單位測(cè)定葉綠素含量，在葉片主脈兩側(cè)對(duì)應(yīng)部位以面積單位取材，操作簡(jiǎn)便人為誤差相對(duì)較小。采用面積單位測(cè)定不同棗樹(shù)品種葉片葉綠素含量在棗樹(shù)整個(gè)生長(zhǎng)期具有一致的變化規(guī)律[20]，尤其用不同溶劑提取相同棗樹(shù)品種葉片的葉綠素含量完全相同[21]。